1 HBsAg 基因的克隆及其香蕉果实表达载体的构建 黄惠琴, 胡永华, 朱军, 方哲, 鲍时翔中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 海南海口 (571101) E-mail:bsxhhq@yahoo.com.cn 摘要 : 乙型肝炎是由乙肝病毒 (hepatitis B virus,hbv) 引起的全球性传染病, 目前主要通过注射疫苗来预防 然而用酵母等表达系统生产的乙肝疫苗成本高且储存不方便, 限制了它的普及 在可食性植物中表达疫苗将是其发展趋势 本研究通过改进的酚 - 氯仿提取法从乙肝病毒感染者的血清中提取 HBV DNA, 根据报道的序列设计特异性引物, 同时在上游引物中引入了 KOZAK 序列, 经 PCR 克隆得到 HBsAg 基因序列, 长度为 681bp NCBI BLAST 分析的结果表明, 获得的 HBsAg 基因序列与 GenBank 中所报道序列的同源性为 99.4% 将经过改造的 HBsAg 基因替代瞬时表达载体 pbacs 中的 GUS 基因, 成功构建了含有 ACS 启动子和 HBsAg 基因的香蕉树果实表达载体, 为下一步转化香蕉, 获得在果实中表达 HBsAg 蛋白的转基因植株奠定了基础 关键词 : 香蕉果实 ;HBsAg 基因 ; 口服疫苗 ; 表达载体构建 乙型肝炎是由乙肝病毒 (hepatitis B virus,hbv) 引起的全球性传染病, 全世界目前大约有 3.5 亿名乙肝病毒携带者 据估计近 1 亿的乙肝患者将死于肝硬化和 / 或肝癌等疾病 [1], 乙肝的治愈率不容乐观 注射疫苗能预防该病毒的感染, 目前一般都用酵母等表达系统来生产乙肝疫苗, 但由于其成本较高且储存不方便等因素, 限制了它的普及, 尤其是在发展中国家 利用植物, 特别是可食性果实来生产疫苗, 具有成本低 易于长距离运输等优点, 易于推广, 同时可避免注射疫苗带来的疾病传播 [2] 为了开发乙肝口服疫苗, 许多研究者致力于用植物来表达乙肝病毒表面抗原 (hepatitis B virus surface antigen,hbsag) 蛋白,HBsAg 已经在烟草 [3,4] 马铃薯 [5,6] 西红柿 [7] 莴苣和羽扇豆中得到成功表达 [8] 近年来用番茄 香蕉等植物来生产乙肝疫苗已成为一个热点 联合国粮食农业组织已经把香蕉列为世界上第四大粮食作物 [9], 利用香蕉开发转基因植物反应器具有如下特点 :1) 生长周期较短 ( 一年左右 );2) 香蕉营养价值高, 是大多人喜爱的水果, 市场消费量大 ;3) 价格便宜 ;4) 香蕉可以生食, 若表达口服疫苗, 产品可以供人们直接口服, 不需分离提取或加热处理 转基因香蕉生物反应器的研究和开发将具有广阔的应用前景, 目前国内外一些学者正在开展这一领域研究 本研究利用香蕉这一可食性植物来表达 HBsAg, 对乙型肝炎的预防有着积极的意义, 也将进一步促进香蕉生物反应器的发展 1. 材料与方法 1.1 材料 香蕉果实 (AAA 型 ) 来自于热带作物生物技术国家重点实验室, 提取乙肝病毒 DNA 的血清取自海南省人民医院乙肝病人, 克隆载体 pgem -T easy Vector SystemⅠ 限制性内切酶 连接酶等购自 Promega 公司,Taq DNA polymerse dntps 等购自北京经科公司 E.coli DH5α 由本室保存, 所用引物由上海生物工程有限公司合成,DNA PCR 仪为 Biometra -T personal, 瞬时表达载体 pbacs 由本室构建保存 1 本课题得到博士学科点专向科研基金 (20050565004) 的资助 -1-
1.2 乙肝病毒基因组总 DNA 的提取及检测 1.2.1 血清样本采集 采集被检者静脉血 2ml, 收集于无菌离心管 ( 室温放置不超过 6 小时 ),1600 g 离心 20 分钟, 吸取血清 ( 切勿吸入红细胞 ) 转入另一无菌离心管中, 即可用于实验 待用血清在 2-8 保存时间不应超过 72 小时 [10] 1.2.2 HBV DNA 提取 125µL 血清加入 125µL HBV DNA 提取缓冲液 TES(10mmol/L Tris-HCl; 5mmol/L EDTA; 0.5%SDS, ph8.0) 和 6.25µL 蛋白酶 K (2g/L),37 消化 6 小时 采用酚 / 氯仿法提取, 乙醇沉淀, DNA 溶解于 20µL 双蒸水中 1.3 HBsAg 基因的分子克隆与改造 依据 R.J.Bowden 等报道的 HBsAg 基因序列, 经 PC/Gene 软件分析并根据引物设计优化原则, 为方便克隆而引入了 BamHⅠ 和 SacⅠ 酶切位点 同时, 在 HBsAg 基因起始密码子前引入有利于真核生物基因表达的 Kozak 序列 (A**ATGG), 对 HBsAg 基因进行改造 设计的引物如下 : Primers1:5 -GCGGATCCACCATGGAGAA CATCACATCAGGCTTTC-3 BamHI KOZAK sequence primers2 :5 -GCGAGCTCTTAAATGTATACCCAAAGAC-3 SacI PCR 反应体系为 20µL 混合物, 反应参数如下 :94 预变性,5min;94 变性,45sec;56 退火 50 sec;72 延伸,60sec; 循环 30 次数 ;72 延伸,7min;4 保存 1.4 PCR 产物的 T/A 克隆与测序 PCR 产物经 1.8% 的琼脂糖凝胶电泳后, 切下目的条带, 采用 PCR 产物纯化试剂盒进行回收, 然后与 pgem-t 载体连接, 转化 E. coli DH5α 感受态细胞 于含有 100µL/mL Amp 的 LB 平板 ( 加 IPTG/X-gal) 上筛选菌落后, 用碱裂解法提取质粒, 采用 PCR 和 BamHI-SacI 双酶切法鉴定阳性重组质粒, 送交上海生工公司测序 测序结果利用 DNAsist 软件和 BLAST 分析 1.5 香蕉果实特异表达载体的构建 质粒 pbacs 和 HBsAg PCR 产物用 BamHI/SacI 双酶切, 分别回收目的片断, 用 T4 DNA 连接酶连接回收片断, 连接产物转化 E. coli DH5α 感受态细胞, 于含有 100µL/mL Kan 的 LB 平板 ( 不加 IPTG/X-Gal) 筛选阳性菌落, 采用 PCR 和 BamHI/SacI XbaI/BamHI XbaI/SacI 双酶切进行鉴定, 阳性重组质粒命名为 pbah 具体构建过程见图 1 所示 -2-
BamHI/SacI 双酶切 BamHI/SacI 双酶切 连接 图 1. 表达载体 pbah 构建简图 2. 结果与分析 2.1 HBV DNA 提取 通过改进的酚 - 氯仿提取法从乙肝病毒感染者的血清中提取到 HBV DNA, 紫外分光光度法测定光谱吸收比的结果为 OD 260 /OD 280 =1.77,OD 260 /OD 230 =1.94, 说明所获得的 DNA 纯度较高, 可以用于后续实验 2.2 HBsAg 基因的 PCR 扩增 HBsAg 基因 PCR 扩增具有很高的特异性, 如图 2 所示, 从图中可以看出其大小约为 700bp, 与预期相符 图 2. HBsAg 基因 PCR 扩增 -3-
2.3 HBsAg 基因序列分析从测序结果可知,KOZAK 序列 (A**ATGG) 插入 HBsAg 基因翻译起始位点 ( 图 3), 经 NCBI BLAST 分析, 发现获得的 HBsAg 基因与 GenBank 中的序列 (AF223961) 同源性达 99.4%,DNAsist 软件分析结果见图 3 起始密码子 GCGGATCC ACC ATGGAGAACATCACATCAGGCTTTCT 35 ATGGAGAGCACCACATCAGGATTCCT 180 KOZAK 序列 AGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACC 95 AGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACC XbaI 酶切位点 240 ACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAGCACCCACGTGTCC 155 ACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAGCACCCACGTGTCC 300 TGGCCAAAATGTGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAATTTG 215 TGGCCAAAATTTGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAATTTG 360 TCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCT 275 TCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCT 420 ATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCT 335 ATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCT 480 ACTTCCAGGAACATCAACTACCAGCACGGGACCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCA 395 ACTTCCAGGAACATCAACTACCAGCACGGGACCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCA 540 AGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAATTGCACTTG 455 AGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAATTGCACTTG 600 TATTCCCATCCCATCATCTTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCG 515 TATTCCCATCCCATCATCTTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCG 660 TTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCAC 575 TTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCAC 720 TGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTT 635 TGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTT 780 终止密码子 GAATCCCTTTTTACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTAA 681 GAATCCCTTTTTACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTAA 839 2.4 香蕉果实表达载体的构建 图 3. HBsAg 基因 DNAsist 软件分析结果 外源基因在香蕉树果实中成功表达离不开合适的表达载体 为此, 本研究将改造的 HBsAg 基因替代 pbacs 中的 GUS 基因构建了香蕉果实表达载体 pbah 表达载体的 PCR 和酶切鉴定 -4-
结果如图 4 和 5,pBAH 经 PCR 和 BamHI/SacI 双酶切都得到约 700bp 条带, 说明 HBsAg 基因已克隆到载体中,XbaI/BamHⅠ 双酶切后得到一条 1200bp 的条带,XbaI/SacI 双酶切得到一条稍大于 1200bp 的条带和一条稍小于 700bp 的条带 (XbaI/BamHI 为瞬时表达载体 pbacs 中 ACS 两端的酶切位点, 其中 95-101 碱基为 XbaI 位点 ), 说明 ACS 启动子与 HBsAg 基因正确连接 pbah 转化香蕉及其表达分析将另文报道 1 2 3 1 2 3 4 1000bp 750bp 500bp 1200bp 1000bp 750bp 500bp 图 4. pbah 质粒 PCR 鉴定 1.Marker; 2. 对照 ; 3.PCR 扩增条带 图 5. pbah 质粒酶切鉴定 1. Marker; 2. BamHI/SacI 双酶切 ; 3. XbaI/BamHⅠ 双酶切 ; 4. XbaI /SacI 双酶切 (XbaI/ BamHI 为瞬时表达载体 pbacs 中 ACS 两端的酶切位点, 而 HBsAg 基因中 95-101 碱基为 XbaI 位点 ) 3. 讨论 乙肝病毒是包膜病毒, 在人体内能引起急性和慢性感染 [11], 而重组 HBsAg 疫苗能诱导特异性的抗乙型肝炎表面抗体, 可有效预防乙型肝炎病毒的感染 [12,13] 我们不仅可以利用酵母表达系统来生产 DNA 疫苗 [14], 而且目前 HBsAg 基因已被克隆并在动物 植物和微生物中表达 然而, 自然界中乙肝病毒的基因序列显示巨大变异 [15] 我们克隆到的序列经 BLAST 分析发现, 与 Genbank 中相关序列 (AF223961) 有 99.4% 的同源率, 但与设计引物所用的序列 (Bowden,R.J. NO: AY122594) 的同源率仅为 97%, 推测氨基酸的同源率为 97.4%, 基因序列变异较大 Xin Zheng 等 [16] 研究表明, 部分氨基酸替换的 HBsAg 仍具有免疫力 我们实验所克隆的 HBsAg 基因为 adw 亚型, 与标准病毒的 DNA 序列有一定的差异, 但 14 个半胱氨酸保留完好, 能形成具有免疫原性的二级和三级结构 Kozak [17] 的研究表明, 在真核生物基因起始密码子周边序列为 ACCATGG 时转录和翻译效率最高, 特别是 -3 位的 A 对翻译效率非常重要 ( 该序列称为 Kozak squence ) 本研究在构建香蕉树果实表达载体时, 引入了改进的 Kozak 序列 ACCATGG, 以增强 HBsAg 基因的表达 参考文献 [1] World Health Organization. State of the world s vaccines and immunization[a]. Global Programme for Vaccines and Immunization.WHO/GPV/96.04, 1996 [2] A.M.Walmsley and C.J.Arntzen. Plants for delivery of edible vaccines[j]. Current Opinion in Biotech. 2000, 11: 126-129 [3] H.S.Mason, D.M.K.Lam and C.J.Arntzen. Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants[j]. Proc Natl Acad Sci (USA), 1992,89: 11745-11749 -5-
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