畜 產 研 究 41(4):267~274, 2008 黃 建 榕 王 妙 鈴 郭 卿 雲 267 植 物 來 源 乳 酸 菌 移 除 膽 固 醇 能 力 之 探 討 ( 一 ) (1) (2) 黃 建 榕 (2) 王 妙 鈴 (2)(3) 郭 卿 雲 收 件 日 期 :96 年 12 月 3 日 ; 接 受 日 期 :97 年 4 月 18 日 摘 要 從 植 物 性 發 酵 產 品 如 發 酵 鳳 梨 醬 汁 蘿 蔔 醬 汁 蘿 蔔 乾 梅 子 醬 汁 小 麥 草 大 白 菜 泡 菜 雜 交 高 粱 種 子 發 酵 牧 草 及 綠 肥 大 豆 種 子 等 進 行 乳 酸 菌 之 篩 選, 經 純 化 及 初 步 篩 選 獲 數 十 株 革 蘭 性 陽 性 球 菌 革 蘭 性 陽 性 鏈 球 菌 革 蘭 性 陽 性 桿 菌 及 革 蘭 性 陰 性 鏈 球 菌 等, 經 以 RAPID ANA II method 進 行 純 化 菌 株 種 類 之 鑑 定, 從 高 粱 種 子 及 綠 肥 大 豆 種 子 均 鑑 定 出 Lactobacillus jensenii 以 API ZYM 套 組 來 測 定 菌 株 酵 素 活 性, 除 α-glucosidase 外, 二 菌 株 皆 具 較 弱 活 性 之 醣 解 酵 素 及 蛋 白 質 分 解 酵 素, 且 均 不 具 有 β-glucuronidase 活 性 以 o-phthalaldehyde method 來 探 討 此 二 菌 株 移 除 膽 固 醇 能 力 之 高 低 初 步 結 果 得 知 : 此 二 菌 株 均 具 移 除 膽 固 醇 能 力 之 特 性, 其 中 源 自 高 粱 種 子 之 菌 株 (A-3) 其 移 除 膽 固 醇 能 力 大 於 源 自 綠 肥 大 豆 種 子 之 菌 株 (B-2), 有 關 其 他 特 性, 目 前 正 作 進 一 步 的 探 討 關 鍵 詞 : 植 物 性 來 源 乳 酸 菌 膽 固 醇 移 除 能 力 篩 選 緒 言 乳 酸 菌 因 其 棲 息 環 境 之 不 同 而 可 分 為 :(1) 使 用 於 酸 酪 乳 乳 酸 菌 飲 料 及 乾 酪 等 畜 產 加 工 品 之 動 物 性 乳 酸 菌 ;(2) 生 長 於 人 及 動 物 腸 內 之 腸 內 乳 酸 菌 及 (3) 使 用 於 植 物 性 加 工 品 如 豆 乳 酒 粕 等 之 植 物 性 乳 酸 菌 等 三 大 類 而 上 述 之 乳 酸 菌 生 菌 食 品 或 製 劑, 目 前 大 多 採 用 動 物 性 乳 酸 菌 或 腸 內 乳 酸 菌 來 研 製 有 關 植 物 性 乳 酸 菌 的 特 性 及 其 機 能 性 的 研 究 到 目 前 為 止 仍 屬 少 數 由 於 乳 酸 菌 會 因 菌 株 菌 種 之 不 同, 其 所 具 有 之 機 能 性 及 胺 基 酵 素 之 種 類 活 性 會 有 所 差 異, 因 此 植 物 性 乳 酸 菌 所 具 有 之 機 能 性 是 可 以 寄 予 期 待 由 於 心 血 管 疾 病 是 先 進 國 家 高 死 亡 率 的 病 因 之 一, 且 其 發 生 與 高 膽 固 醇 血 症 有 重 要 關 聯, 因 此, 降 低 血 清 膽 固 醇 已 被 視 為 防 止 心 血 管 疾 病 發 生 的 重 要 手 段 及 方 法 近 年 來, 有 些 人 體 腸 內 微 生 物 有 降 低 血 清 膽 固 醇 以 及 乳 酸 菌 株 具 有 吸 附 膽 固 醇 能 力 之 事 實 已 廣 為 世 人 所 熟 知 (Gilliland et al., 1985) Gilliland and Walker (1990) 之 研 究 報 告 顯 示 Lactobacillus acidophilus 具 有 降 低 人 體 血 清 膽 固 (1) 行 政 院 農 業 委 員 會 畜 產 試 驗 所 研 究 報 告 第 1447 號 (2) 行 政 院 農 業 委 員 會 畜 產 試 驗 所 加 工 組 (3) 通 訊 作 者,E-mail: cykuo@mail.tlri.gov.tw
268 植 物 來 源 乳 酸 菌 移 除 膽 固 醇 能 力 之 探 討 ( 一 ) 醇 濃 度 之 能 力,Lee et al. (2005) 之 研 究 也 指 出, 從 乳 製 品 分 離 出 Lactococcus 屬 乳 酸 菌 (LACC-N7 及 LACC-527) 在 防 止 高 膽 固 醇 血 症 及 脂 肪 肝 的 發 生 有 顯 著 效 能 在 Hughes and Hoover (1991) 之 報 告 中 得 知, 因 具 有 降 低 血 清 膽 固 醇 之 效 益, 致 使 含 有 雙 叉 乳 桿 菌 之 發 酵 乳 品 銷 售 量 大 增 鑑 此, 針 對 國 人 對 健 康 訴 求 日 益 重 視, 尤 其 是 有 關 膽 固 醇 過 高 所 引 發 的 高 血 壓 及 心 血 管 症 狀 等 疾 病, 且 為 了 擴 大 國 人 對 鮮 乳 相 關 產 品 之 消 費 量, 本 研 究 擬 從 所 篩 選 之 植 物 來 源 乳 酸 菌 中 探 討 其 移 除 膽 固 醇 能 力 之 高 低, 並 應 用 其 來 研 製 機 能 性 酸 酪 乳 製 品, 期 能 提 供 國 內 乳 業 界 及 食 品 業 界 之 參 考 材 料 與 方 法 Ⅰ. 材 料 高 梁 種 子 綠 肥 大 豆 種 子 及 發 酵 牧 草 由 本 所 飼 作 組 提 供 小 麥 草 購 自 台 南 新 化 有 機 食 品 商 店 鳳 梨 醬 汁 蘿 蔔 醬 汁 梅 子 醬 汁 大 白 菜 泡 菜 小 黃 瓜 泡 菜 及 榨 菜 購 自 台 南 新 化 傳 統 市 場 Ⅱ. 篩 選 各 種 植 物 性 來 源 之 乳 酸 菌 種 從 Ⅰ. 之 植 物 性 發 酵 產 品 如 發 酵 牧 草 及 小 麥 草 等 秤 取 10 g 攪 碎 均 質 後, 在 有 氧 及 厭 氧 的 條 件 下 稀 釋 成 適 當 之 倍 數 後, 於 非 選 擇 性 培 養 基 BL (HiMedia Laboratories Limited, India) 或 選 擇 性 培 養 基 BS (HiMedia Laboratories Limited, India) 上 塗 抹, 並 分 別 置 於 一 般 培 養 箱 及 厭 氧 培 養 箱 內 培 養 將 生 長 於 培 養 基 上 的 菌 落 分 離 後, 再 作 進 一 步 的 連 續 培 養 及 純 化 再 將 純 化 後 之 菌 株 移 至 MRS 培 養 液 (Difco Laboratories, Detroit, USA) 中, 於 37 培 養 48 hrs 後, 保 存 於 4, 每 兩 週 活 化 一 次, 以 供 鑑 定 乳 酸 菌 之 鑑 定 及 特 性 : 純 化 後 之 乳 酸 菌 株, 依 據 光 岡 (1990) Hardie (1986) 及 Kandler and Weiss (1986) 所 述 之 分 類 標 準 進 行 鑑 定 檢 驗 項 目 包 括 : ( ) 菌 體 形 態 之 觀 察, 以 革 蘭 氏 染 色 法 將 菌 株 染 色 後, 以 電 子 顯 微 鏡 觀 察 並 照 相 做 為 篩 選 依 據 ( ) 發 酵 型 式 : 於 MRS 培 養 液 中 培 養, 觀 察 是 否 有 氣 體 產 生 來 判 斷 為 同 質 或 異 質 發 酵 ( ) 生 長 適 溫 : 將 菌 液 培 養 於 10 或 45, 視 其 是 否 生 長 ( ) 觸 瓷 反 應 : 取 1 白 金 耳 菌 塗 抹 於 載 玻 片 上, 加 3% 過 氧 化 氫 1-2 滴 於 菌 體 上, 迅 速 冒 泡 者, 為 陽 性 反 應 ( ) 醣 發 酵 性 狀 測 試 : 採 用 RAPID ANA Π 套 組 (remel, Lenexa, Kansas, USA), 進 行 數 十 種 不 同 醣 類 之 發 酵 測 試, 於 37 培 養, 並 於 4 小 時 後 判 讀 ( ) 酵 素 活 性 測 試 : 採 用 API ZYM 套 組 (Biomérieux, France), 測 試 菌 株 19 種 酵 素 活 性, 並 依 其 呈 色 深 淺 分 為 五 級, 顏 色 越 深 則 其 酵 素 活 性 越 高 ( ) 耐 鹽 性 : 將 菌 株 培 養 於 MRS 培 養 基 ( 內 含 6.5% NaCl) 中, 於 37 培 養 48 小 時, 觀 察 其 生 長 情 況 Ⅲ. 進 行 菌 株 對 膽 固 醇 移 除 能 力 之 探 討 參 考 Liong and Shah (2005) 及 Rudel and Morris (1973) 之 法, 以 含 有 膽 固 醇 濃 度 (70-100 μg/ ml) 之 滅 菌 MRS-LC broth 來 培 養 所 篩 選 之 植 物 來 源 乳 酸 菌, 於 37 下, 培 養 20 小 時 培 養 終 了, 離 心 除 去 菌 體, 依 Rudel and Morris (1973) 之 o-phthalaldehyde method, 測 定 broth 中 膽 固 醇 之 濃 度
黃 建 榕 王 妙 鈴 郭 卿 雲 269 結 果 與 討 論 本 研 究 從 數 批 發 酵 牧 草 高 粱 種 子 綠 肥 大 豆 種 子 鳳 梨 醬 汁 泡 菜 榨 菜 及 小 麥 草 等 中, 進 行 植 物 性 來 源 乳 酸 菌 之 篩 選 作 業, 並 以 RAPID ANA Ⅱ 套 組 進 行 菌 種 之 鑑 定 由 表 1 得 知 從 各 種 植 物 性 發 酵 物 所 篩 選 出 的 菌 種 大 多 屬 於 梭 菌 屬 菌 種 (Clostridium spp.), 一 部 分 屬 放 線 菌 屬 (Actinomyces) 及 真 菌 屬 (Eubacterium) 菌 種, 唯 有 從 編 號 A-3 之 高 粱 種 子 及 編 號 B-2 之 綠 肥 大 豆 種 子 均 各 篩 選 出 一 株 Lactobacillus jensenii 再 者, 此 二 菌 株 對 於 p-nitrophenyl-n-acetyl-β-dglucosaminide 均 具 有 利 用 性, 荒 等 (2002) 之 研 究 指 出 源 自 植 物 產 品 的 乳 酸 菌 可 能 具 有 masking 之 功 能, 對 於 產 品 之 呈 味 性, 具 有 改 善 之 效 果, 而 其 機 能 性 主 成 分 可 能 與 其 反 應 中 生 合 成 之 新 型 醣 分 子 有 關 表 1. 從 植 物 性 發 酵 物 所 篩 選 的 微 生 物 菌 種 Table 1. The species of microorganisms screened from plant fermented substances No. Species Plant fermented substances A-1 Actinomyces meyeri Seed of Kaoliang A-2 Clostridium botulinum Seed of Kaoliang A-3 Lactobacillus jensenii Seed of Kaoliang B-2 Actinomyces odontolyticus Seed of soybeans B-2 Lactobacillus jensenii Seed of soybeans B-3 Clostridium hastiforme Seed of soybeans 1-1 Clostridium hastiforme Sauce of pineapple 1-2 Clostridium hastiforme Sauce of pineapple 1-5 Clostridium hastiforme Sauce of pineapple 6-2 Eubacterium aerofaciens Wheat grass 6-3 Clostridium difficle Wheat grass 7-1 Actinomyces meyeri Chinese cabbage pickle a-1 Clostridium innocuum Cucumbers a-2 Clostridium innocuum Cucumbers a-5 Clostridium innocuum Cucumbers b-4 Clostridium innocuum Pickles c-1 Eubacterium limosum Mustard tuber c-2 Eubacterium limosum Mustard tuber c-3 Clostridium innocuum Mustard tuber c-4 Clostridium innocuum Mustard tuber c-5 Clostridium innocuum Mustard tuber 5X-1 Clostridium hastiforme Fermented pasture 5X-4 Clostridium difficle Fermented pasture 10X-1 Clostridium hastiforme Fermented pasture 10X-2 Clostridium innocuum Fermented pasture 10X-3 Clostridium difficle Fermented pasture 10X-4 Clostridium difficle Fermented pasture 10X-5 Clostridium difficle Fermented pasture 10X-6 Clostridium difficle Fermented pasture 1 Clostridium difficle Fermented pasture 2 Clostridium botulinum Fermented pasture 3 Clostridium difficle Fermented pasture
270 植 物 來 源 乳 酸 菌 移 除 膽 固 醇 能 力 之 探 討 ( 一 ) 圖 1 及 圖 2 分 別 為 源 自 高 粱 種 子 (A-3) 及 綠 肥 大 豆 種 子 (B-2) 之 微 生 物 使 用 RAPID ANA II 系 統 之 鑑 定 結 果 由 圖 顯 示, 此 二 菌 株 無 法 有 效 地 利 用 具 有 β-d-galactoside 構 造 之 物 質, 也 就 是 說 對 於 乳 糖 之 利 用 性 可 能 不 如 源 自 動 物 性 來 源 或 腸 道 菌 叢 之 乳 酸 菌 株, 這 可 能 與 其 源 自 植 物 發 酵 產 品 有 關 圖 1. 源 自 高 粱 種 子 之 乳 酸 菌 株 (A-3) RAPID ANA Ⅱ 之 鑑 定 結 果 Fig. 1. Utilization of carbon source of lactic acid bacterium (A-3)screened from seed of kaoliang by RAPID ANA Ⅱ test. 圖 2. 源 自 綠 肥 大 豆 種 子 之 乳 酸 菌 株 (B-2) RAPID ANA Ⅱ 之 鑑 定 結 果 Fig. 2. Utilization of carbon source of lactic acid bacterium (B-2)screened from seed of soybeans by RAPID ANA Ⅱ test.
黃 建 榕 王 妙 鈴 郭 卿 雲 271 為 了 更 明 瞭 此 二 篩 選 菌 株 之 酵 素 活 性, 將 此 二 篩 選 菌 株 以 API ZYM 套 組 測 其 19 種 酵 素 活 性, 依 反 應 顏 色 之 深 淺, 來 顯 示 反 應 之 進 行 與 否 記 錄 反 應 結 果 之 讀 值, 依 反 應 顏 色 之 深 淺 從 0-5 可 分 為 6 個 等 級,0 相 等 於 負 反 應,5 則 為 最 大 強 度 之 正 反 應 (Hofstad, 1980), 其 結 果 如 表 2 所 示 此 二 菌 株 均 具 有 較 高 酵 素 活 性 之 Acid phosphatase N-acetyl-β-glucosaminidase, 而 在 醣 解 酵 素 方 面, 除 α-glucosidase 外, 其 餘 則 僅 具 微 弱 活 性 或 不 具 任 何 活 性, 這 可 能 與 其 生 活 環 境 有 關, 而 α-glucosidase 對 於 諸 如 大 豆 大 麥 及 馬 鈴 薯 等 含 有 α-1,4 glucoside 構 造 的 物 質 則 具 有 水 解 及 生 合 成 機 能 性 寡 醣 類 之 功 能 ( 細 谷 及 福 場,1984), 對 於 未 來 應 用 於 類 似 豆 乳 等 發 酵 性 產 品 時, 可 寄 予 期 待 而 此 二 菌 株 也 皆 僅 具 微 弱 之 leucine arylamidase 及 cystine arylamidase 等 蛋 白 質 水 解 酵 素 活 性, 故 可 能 無 法 有 效 地 將 蛋 白 質 分 子 完 全 分 解 為 低 分 子 胜 類 或 胺 基 酸, 所 以 其 在 牛 乳 中 之 生 長 性 可 能 不 佳 (Cheng and Nagasawa, 1984) 須 配 合 動 物 性 來 源 乳 酸 菌 組 成 混 合 菌 元, 互 補 長 短 ( 石 川 等,2003) 此 外, 此 二 菌 株 皆 不 具 有 β-glucuronidase 活 性,Nanno et al. (1986) 指 出 此 酵 素 有 可 能 與 致 癌 物 質 之 產 生 有 關 表 2. A-3 與 B-2 菌 株 於 API ZYM 試 驗 之 酵 素 活 性 Table 2. API ZYM test enzymes activity of A-3 and B-2 strains No. Enzyme A-3 B-2 1 Control - - 2 Alkaline phosphatase 1-3 Esterase - - 4 Esterase, Lipase 2-5 Lipase - 4 6 Leucine arylamidase 1 2 7 Valine arylamidase 1-8 Cystine arylamidase 1 1 9 Trypsin - - 10 α-chymotrypsin - - 11 Acid phosphatase 4 3 12 Naphthol-As-Bl-phosphohydrolase 2 2 13 α-galactosidase 1-14 β-galactosidase - - 15 β-glucuronidase - - 16 α-glucosidase 2 2 17 β-glucosidase 1 1 18 N-acetyl-β-glucosaminidase 3 2 19 α-mannosidase - - 20 α-fucosidase - 1 A-3 Lactobacillus jensenii B-2 Actinomyces odontolyticus
272 植 物 來 源 乳 酸 菌 移 除 膽 固 醇 能 力 之 探 討 ( 一 ) 以 ο-phthalalhyde method 來 探 討 植 物 來 源 乳 酸 菌 移 除 膽 固 醇 能 力 之 高 低, 結 果 如 圖 3 所 示, 各 菌 株 間 膽 固 醇 移 除 能 力 有 明 顯 差 異,A-3 及 B-2 二 株 源 於 植 物 來 源 之 乳 酸 菌 其 移 除 能 力 高 於 Streptococcus thermophilus CCRC 14807, 且 A-3 高 於 B-2 Liong and Shah (2005) 之 研 究 報 告 指 出 菌 株 間 膽 固 醇 移 除 能 力 之 高 低, 可 能 與 其 耐 膽 鹽 性 之 高 低 及 生 菌 數 目 有 所 關 聯 有 關 其 關 聯 特 性, 目 前 正 作 進 一 步 之 探 討 圖 3. 植 物 來 源 乳 酸 菌 之 膽 固 醇 移 除 能 力 Fig. 3. The efficiency of cholesterol removal ability by plant origin lactic acid bacteria. 結 果 與 建 議 由 於 市 售 之 植 物 性 發 酵 產 品 包 裝 後 大 都 經 過 二 次 殺 菌, 導 致 不 易 自 市 售 產 品 中 篩 選 到 乳 酸 菌 株, 往 後 計 劃 自 製 植 物 性 發 酵 產 品 ( 如 泡 菜 等 ), 從 中 篩 選 符 合 目 的 及 特 性 的 乳 酸 菌 株, 以 利 實 驗 作 業 之 進 行 誌 謝 本 研 究 承 蒙 行 政 院 農 業 委 員 會 九 十 五 年 度 農 業 科 技 計 畫 (95 農 科 -10.1.4- 畜 -L1(5)) 經 費 補 助 及 本 所 飼 料 作 物 組 許 福 星 組 長 成 游 貴 博 士 及 許 進 德 提 供 試 樣 品, 特 此 致 謝 參 考 文 獻 石 川 健 一 加 藤 丈 雄 小 宮 孝 志 2003 混 合 乳 酸 菌 - - - 利 用 發 酵 漬 物 開 發 日 本 食 品 工 學 會 誌 50(9):411~418 光 岡 知 足 1990 腸 道 - 健 康 New Food Industry 32(10):1~8 荒 勝 俊 吉 松 正 小 島 川 合 修 次 大 久 保 一 良 2002 新 規 乳 酸 菌 用 豆 乳 發 酵 食 品 呈 味 改 善 日 本 食 品 工 學 會 誌 49(6):377-387
黃 建 榕 王 妙 鈴 郭 卿 雲 273 細 谷 憲 政 福 場 博 保 1984 轉 移 糖 榮 養,pp. 32-43, 第 一 出 版 社, 東 京, 日 本 Cheng, C. C. and T. Nagasawa. 1984. Effect of peptides and amino acids produced by Lactobacillus casei in milk on the acid production of bifidobacteria. Jpn. J. Zootech. Sci. 55(5):339-349. Hofstad, T. 1980. Evaluation of API ZYM system for indentification of bacteroides and Fusobacterium species. Med. Microbiol. Immunol. 168:173-177. Gilliland, S. E., C. R. Nelson and C. Maxwell. 1985. Assimilation of cholesterol by Lactobacillus acidophilus. Appl. Environ. Microbiol. 49:377-381. Gilliland, S. E. and D. K. Walker. 1990. Factors to consider when selecting a culture of Lactobacillus acidophilus as a dietary adjunct to produce a hypocholesterolemic effect in humans. J. Dairy Sci. 73:905-911. Hardie, J. M. 1986. Genus Streptococcus. In Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol. 2, pp.1043-1071. Hughes, D. B. and D. G. Hoover. 1991. Bifidobacteria: their potential for use in American dairy products. Food Technol. 45:74-80. Kandler, O. N. and D. Weiss. 1986. Genus Lactobacillus. In Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol. 2, pp.1209-1234. Lee, W. K., H. J. Lim, S. Y. Kim, H. Kimoto, S. Ohmomo, Y. Tashiro and H. Takebe. 2005. Hypocholesterolemic effect of Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis N7 and Lactococcus lactis subsp. lactis 527 Strains in SD rats. Biosci. Flora. 24(1):11-16. Liong, M. T. and N. P. Shah. 2005. Acid and bile tolerance and the cholesterol removal ability of bifidobacteria strains. Biosci. Flora. 24(1):1-10. Nanno, M., M. Morotomi, H. Takayama, T. Kuroshima, R. Tanaka and M. Mutai. 1986. Mutagenic activation of biliary metabolites of benzo (a) pyrene by β- glucuronidase positive bacteria in human in faeces. J. Med. Microbiol. 22:351-355. Rudel, L. L. and M. D. Morris. 1973. Determination of cholesterol using o-phthalaldehyde. J. Lipid Res. 14:364-366.
274 植 Taiwan 物 來 源 Livestock 乳 酸 菌 移 Res. 除 膽 41(4):267~274, 固 醇 能 力 之 探 討 ( 2008 一 ) Studies on the cholesterol removal ability of plant origin lactic acid bacteria (1) Chien-Jung Huang (2), Miao-Ling Wang (2) and Ching-Yun Kuo (2)(3) Received : Dec. 3, 2007 ; Accepted : Apr. 18, 2008 Abstract The aims of this study was to screen plant origin lactic acid bacteria which had the cholesterol removal ability for the future application of yoghurt products to dairy and food industries. Two strains of bacteria isolated from seeds of kaoliang and soybeans were screened and identified to be Lactobacillus jensenii by RAPID ANA Ⅱ method. The enzyme activity evaluated by the API ZYM kit indicated that both of the isolated bacteria had lower activity of glycosidase and proteinase exceptα- glucosidase, but no activity of β- glucuronidase. Cholesterol assimilation was determined by a difference in cholesterol content in the medium before and after the incubation period by o-phthalaldehyde method. The result showed the two strains had the cholesterol removal ability, and the strain of A-3 was higher than that of B-2. Key words : Plant origin lactic acid bacteria, Cholesterol removal ability, Screening. (1) Contribution No. 1447 from Livestock Research Institute, Council of Agriculture, Executive Yuan. (2) Animal Products Processing Division, COA-LRI, Hsinhua 712, Tainan, Taiwan, R.O.C. (3) Corresponding author, E-mail: cykuo@mail.tlri.gov.tw