中 国 农 学 通 报 2014,30(5):23-27 Chinese Agricultural Science Bulletin 大 肠 杆 菌 生 物 膜 的 筛 选 及 生 长 曲 线 测 定 喻 华 英, 李 启 峰 ( 塔 里 木 大 学 动 物 科 学 学 院, 新 疆 阿 拉 尔 843300) 摘 要 : 为 探 究 犊 牛 腹 泻 病 中 大 肠 杆 菌 生 物 膜 的 形 成 过 程 本 试 验 利 用 96 孔 微 量 板 法, 对 分 离 鉴 别 的 犊 牛 腹 泻 粪 便 中 的 60 株 大 肠 杆 菌 进 行 生 物 膜 的 筛 选 和 统 计 结 果 表 明 : 得 到 了 9 株 生 物 膜 阳 性 大 肠 杆 菌, 并 测 定 出 大 肠 杆 菌 生 物 膜 阳 性 菌 的 生 长 曲 线 从 而 确 定 大 肠 杆 菌 生 物 膜 形 成 的 四 个 时 期 : 初 粘 附 粘 附 生 物 膜 的 成 熟 脱 落 等 过 程 且 不 同 大 肠 杆 菌 生 物 膜 形 成 时 间 不 尽 相 同 为 临 床 上 治 疗 犊 牛 腹 泻 病 提 供 了 新 的 理 论 依 据 关 键 词 : 大 肠 杆 菌 ; 生 物 膜 ; 筛 选 ; 生 长 曲 线 中 图 分 类 号 :R3782+2 Q735 文 献 标 志 码 :A 论 文 编 号 :2013-1796 Screening Biofilm and Determination Growth Biofilm of Curve in Escherichia coli Yu Huaying, Li Qifeng (College Of Animal Science Tarim University, Alar Xinjiang 843300) Abstract: The biofilm explored the formation process of E. coli in the calf diarrhea. The experiment used the 96-well micro plate method screened and counted biofilm in 60 strains in E. coli from calf diarrhea fecal which were separated and identified in laboratory. The results showed that get nine positive biofilms in E. coli and determined the positive biofilm growth curve in E. coli. The test concluded and known the biofilm formation period contained four stages: initial adhesion, adhesion, mature biofilm and shedding processes, and then in different biofilm formation process varied in E. coli. The experiment was aimed of providing a new theoretical basis for the treatment against calves diarrhea in clinical. Key words: Escherichia coli; biofilm; screening; growth curve 0 引 言 细 菌 生 物 膜 (Biofilm,BF) 是 相 对 于 单 个 分 散 的 浮 游 状 态 的 细 菌 (Planktonic Cells) 生 存 形 式 而 言 的 一 种 独 特 的 细 菌 生 存 形 式 生 物 被 膜 是 细 菌 生 长 的 一 种 保 护 模 式, 保 证 细 菌 在 恶 劣 环 境 下 可 以 生 存 [1] [2] 对 于 生 物 膜 的 研 究,2002 年,Donlan 等 认 为 : 生 物 被 膜 是 一 种 不 可 逆 的 粘 附 于 非 生 物 或 生 物 表 面 的 微 生 物 细 胞 菌 落, 包 裹 于 细 胞 外 多 聚 物 基 质 (Extracellular Polymeric Substances,EPS) 中 ( 主 要 是 多 聚 糖 ), 生 物 膜 中 存 在 蛋 白 质 多 糖 DNA RNA 肽 聚 糖 脂 和 磷 脂 等 物 质 [3] 生 物 膜 是 细 菌 在 恶 劣 环 境 中 的 一 种 生 长 方 式, 环 境 中 的 营 养 成 分 温 度 渗 透 压 ph 铁 离 子 浓 度 氧 化 还 原 电 位 变 化 等 对 生 物 膜 的 形 成 具 有 重 要 作 用 [4] 生 物 膜 可 由 纯 菌 种 形 成, 也 可 以 由 多 菌 种 组 成 [5] 生 物 膜 系 统 存 在 着 通 道 系 统, 保 证 养 料 酶 代 谢 产 物 和 排 泄 物 运 输 畅 通 [6] 1978 1995 [7] 年,Costerton 等 研 究 牙 菌 斑, 提 出 生 物 被 膜 的 理 论, 解 释 了 微 生 物 为 何 附 着 于 有 生 命 或 无 生 命 的 物 体 表 面 及 受 益 于 这 种 小 生 境 的 机 制 他 认 为 : 生 物 被 膜 包 括 单 个 细 胞 和 微 生 物 菌 落, 镶 嵌 在 一 种 高 度 水 合 化, 主 要 携 带 负 电 荷 的 多 聚 物 基 质 粘 附 于 表 面 界 面 及 相 互 之 间, 在 多 孔 基 质 孔 隙 中 隐 藏 的 细 菌 生 物 膜 的 感 染 性 疾 病 大 都 是 慢 性 和 难 治 性 的, 生 物 膜 内 的 细 菌 几 乎 对 所 有 的 抗 生 素 都 不 敏 感, 表 现 出 极 强 的 耐 药 性 [7] 基 金 项 目 : 国 家 自 然 基 金 新 疆 地 区 犊 牛 腹 泻 病 中 大 肠 杆 菌 基 因 型 分 型 及 bfpa 基 因 生 物 学 功 能 探 讨 (31060344) 第 一 作 者 简 介 : 喻 华 英, 女,1967 年 出 生, 新 疆 人, 硕 士, 教 授, 现 从 事 家 畜 病 理 学 教 学 研 究 工 作, 研 究 方 向 为 细 菌 和 细 菌 毒 素 的 致 病 机 制 通 信 地 址 : 843300 新 疆 塔 里 木 大 学 动 科 院,Tel:0997-4680341,E-mail:aksyhy@126.com 收 稿 日 期 :2013-07-01, 修 回 日 期 :2013-10-05
24 中 国 农 学 通 报 http://www.casb.org.cn 生 物 膜 的 形 成 后, 细 菌 个 体 表 现 不 同 致 病 性 特 性, 某 些 细 菌 个 体 对 宿 主 无 危 害, 有 些 细 菌 则 可 能 对 宿 主 有 致 命 威 胁 生 物 膜 中 特 有 的 物 质 如 胞 外 多 聚 物 和 群 体 [8-9] 感 应 信 号 因 子 都 可 能 是 使 其 抗 性 增 强 的 原 因 大 约 [10-12] 65% 的 人 类 细 菌 性 感 染 是 细 菌 由 生 物 膜 引 起 的 生 [13-14] 物 膜 形 成 后 可 引 起 机 体 严 重 的 反 复 感 染 能 形 成 生 物 膜 的 细 菌 有 金 黄 色 葡 萄 球 菌 副 伤 寒 沙 门 氏 菌 铜 绿 假 单 胞 菌 枯 草 杆 菌 沙 门 杆 菌 志 贺 氏 菌 变 形 杆 菌 绿 脓 杆 菌 炭 疽 杆 菌 蜡 样 芽 胞 杆 菌 葡 萄 球 菌 等 大 肠 杆 菌 形 成 生 物 膜 与 自 身 的 结 构 如 粘 附 因 子 毒 力 因 子 细 胞 坏 死 因 子 和 铁 载 体 等 有 关, 还 与 [14-15] 细 菌 所 生 存 的 环 境 有 关 大 肠 杆 菌 能 在 口 腔 尿 道 生 殖 道 肠 道 等 器 官 表 面 形 成 生 物 膜, 导 致 疾 病 出 [16-17] 现 反 复 感 染 在 新 疆 地 区, 养 牛 业 出 现 快 速 迅 猛 发 展 并 成 为 农 牧 民 增 收 的 主 要 手 段 之 一 犊 牛 腹 泻 病 的 危 害 在 养 牛 业 中 危 害 越 来 越 严 重, 同 时 致 犊 牛 腹 泻 病 的 大 肠 杆 菌 普 遍 存 在 对 抗 生 素 有 较 强 的 耐 药 性 反 复 性 感 染 不 易 根 治 和 致 病 力 强 等 特 点 本 试 验 用 的 96 孔 微 量 板 法, 对 致 犊 牛 腹 泻 病 的 大 肠 杆 菌 进 行 生 物 膜 的 筛 选 和 分 析, 并 探 究 其 生 物 膜 的 形 成 过 程, 为 临 床 上 犊 牛 腹 泻 病 的 治 疗 提 供 新 的 思 路 1 试 验 材 料 1.1 试 验 材 料 试 验 病 料 是 于 2012 年 10 月 采 自 十 团 奶 牛 场 中 发 生 腹 泻 的 犊 牛 粪 便, 经 试 验 室 分 离 鉴 定 的 60 株 大 肠 杆 菌 1.2 试 验 所 用 培 养 基 麦 康 凯 琼 脂 培 养 基 LB 液 体 培 养 基 M9 培 养 基 1.3 试 验 试 剂 1%PBS 缓 冲 溶 液 1% 结 晶 紫 (Crystal Violet) 液, 33 % 冰 乙 酸, 甲 醇 1.4 试 验 设 备 与 仪 器 紫 外 线 可 见 分 光 光 度 计 CODES 54; 全 波 长 酶 标 仪 Power Wave XS 美 国 产 ; 进 口 U 型 96 孔 板 (3599) 购 自 Corning Costar 产 品 2 试 验 方 法 2.1 大 肠 杆 菌 生 物 膜 筛 选 -96 孔 微 量 板 法 2.1.1 细 菌 的 活 化 和 分 离 纯 化 (1) 从 -70 冰 箱 中 取 出 甘 油 保 存 的 菌 株, 待 菌 液 在 冰 浴 下 溶 解 后, 取 100 μl 菌 液 接 种 于 新 鲜 灭 菌 的 5 ml LB 液 体 培 养 基 中, 置 于 37 恒 温 摇 箱 中 过 夜 培 养 ;(2) 将 菌 液 接 种 于 麦 康 凯 培 养 基 中 置 于 37 恒 温 培 养 箱 内 培 养 24 h;(3) 从 麦 康 凯 培 养 基 中 挑 取 红 色 单 菌 落, 接 种 到 新 鲜 灭 菌 的 5 ml LB 液 体 培 养 基 中, 于 37 恒 温 摇 箱 中 摇 16 h;(4) 按 1:100 倍 稀 释 : 取 培 养 的 菌 液 50 μl 于 新 鲜 灭 菌 的 5 ml LB 试 管 液 体 培 养 基 中, 于 37 恒 温 摇 箱 中 摇 4.5 h, 保 证 细 菌 处 于 对 数 生 长 期 2.1.2 菌 液 OD 600nm 的 测 量 及 稀 释 (1) 将 紫 外 可 见 分 光 光 度 计 预 热 半 小 时 ;(2) 取 2 ml 菌 液 于 干 净 比 色 皿 中, 同 时 取 2 ml LB 液 体 培 养 基 作 为 空 白 对 照 ;(3) 调 整 当 前 波 长 为 600 nm, 初 始 波 长 为 200 nm;(4) 测 菌 液 OD 600nm 值, 记 录 数 据 ;(5) 用 灭 菌 的 1 M9 液 体 培 养 基 将 所 测 OD 600nm 值 稀 释 至 0.01 2.1.3 装 板 和 培 养 取 200 μl 稀 释 至 0.01 的 菌 液 加 入 96 孔 U 型 平 底 板 中, 每 个 菌 液 接 2 列 6 孔, 用 1 M9 液 体 培 养 基 200 μl 接 剩 余 2 孔 作 为 空 白 对 照 将 板 置 于 37 恒 温 箱 中 培 养 36~48 h 2.1.4 洗 板 (1) 将 培 养 好 的 96 孔 U 型 平 底 板 从 恒 温 箱 中 取 出, 弃 菌 液 ; 用 1%PBS 缓 冲 液 洗 96 孔 U 型 平 底 板, 重 复 3 次, 弃 洗 液, 拍 干 ; 将 甲 醇 放 入 96 孔 U 型 平 底 板 中 固 定 15 min, 倒 出 并 晾 干 ; 将 1% 结 晶 紫 溶 液 加 入 96 孔 U 型 平 底 板 中, 水 平 晃 动, 使 生 物 膜 染 色 均 匀, 染 色 (2) 将 培 养 好 的 96 孔 U 型 平 底 板 从 恒 温 箱 中 取 出, 弃 菌 液 ; 用 1%PBS 缓 冲 液 洗 96 孔 U 型 平 底 板, 重 复 3 次, 弃 洗 液, 拍 干 ; 将 甲 醇 放 入 96 孔 U 型 平 底 板 中 固 定 15 min, 倒 出 并 晾 干 ; 将 1% 结 晶 紫 溶 液 加 入 96 孔 U 型 平 底 板 中, 水 平 晃 动, 使 生 物 膜 染 色 均 匀, 染 色 2.1.5 溶 解 和 测 OD 600nm 的 值 将 33% 的 冰 醋 酸 加 于 96 孔 U 型 平 底 板 中, 待 细 菌 生 物 膜 完 全 溶 解 后, 用 全 波 长 酶 标 仪 测 定 OD 600nm 对 试 验 所 得 数 据 进 行 处 理, 基 于 临 界 值 ODc, 菌 株 生 物 膜 可 以 分 为 :OD ODc 为 不 粘 附 (-);ODc<OD 2ODc 为 弱 粘 附 (+ );2ODc< OD 3ODc 为 中 等 粘 附 (++ );OD>3ODc 强 粘 附 (+++) 2.2 大 肠 杆 菌 生 物 膜 的 生 长 曲 线 检 测 -96 孔 微 量 板 法 2.2.1 菌 体 的 培 养 (1) 从 麦 康 凯 培 养 基 中 挑 出 9 株 阳 性 大 肠 杆 菌, 用 接 种 环 挑 取 红 色 单 菌 落, 接 种 到 新 鲜 灭 菌 的 5 ml LB 液 体 培 养 基 中, 于 37 恒 温 摇 箱 中 摇 16 h (2) 按 1:100 倍 稀 释 : 取 培 养 的 菌 液 50 μl 于 新 鲜 灭 菌 的 5 ml LB 试 管 液 体 培 养 基 中, 于 37 恒 温 摇 箱 中 摇 4.5 h, 保 证 细 菌 处 于 对 数 生 长 期 2.2.2 菌 液 OD 600nm 的 测 量 及 稀 释
喻 华 英 等 : 大 肠 杆 菌 生 物 膜 的 筛 选 及 生 长 曲 线 测 定 25 (1) 将 紫 外 可 见 分 光 光 度 计 预 热 半 小 时 ;(2) 取 2 ml 菌 液 于 干 净 比 色 皿 中, 同 时 取 2 ml LB 液 体 培 养 基 作 为 空 白 对 照 ;(3) 调 整 当 前 波 长 为 600 nm, 初 始 波 长 为 200 nm;(4) 测 菌 液 OD 600nm 值, 记 录 数 据 ;(5) 用 灭 菌 的 1 M9 液 体 培 养 基 将 所 测 OD 600nm 值 稀 释 至 0.01 2.2.3 装 板 和 培 养 取 200 μl 稀 释 至 0.01 的 菌 液 加 入 96 孔 U 型 板 中, 每 个 菌 液 接 2 列 6 孔, 并 用 1 M9 液 体 培 养 基 200 μl 接 剩 余 的 2 孔, 作 为 空 白 对 照 将 接 8 株 弱 阳 性 菌 的 96 孔 U 型 板 置 于 37 培 养, 分 别 在 12 24 36 48 60 72 h 取 板 将 接 1 株 强 阳 性 菌 96 孔 U 型 板 置 于 37 培 养, 分 别 在 2 4 8 12 24 36 48 h 取 板 2.2.4 洗 板 (1) 将 不 同 培 养 时 间 的 96 孔 U 型 板 取 出, 弃 菌 液 ; (2) 用 1%PBS 缓 冲 液 洗 96 孔 U 型 平 底 板, 重 复 三 次, 弃 洗 液, 拍 干 ;(3) 将 甲 醇 放 入 96 孔 U 型 平 底 板 中 固 定 15 min, 倒 出 并 晾 干 ;(4) 将 1% 结 晶 紫 溶 液 加 入 96 孔 U 型 平 底 板 中, 水 平 晃 动, 使 生 物 膜 染 色 均 匀, 染 色 2.2.5 溶 解 和 测 OD 600nm 的 值 将 33% 的 冰 醋 酸 加 于 96 孔 U 型 平 底 板 中, 待 细 菌 生 物 膜 完 全 溶 解 后, 用 全 波 长 酶 标 仪 测 定 OD 600nm 对 试 验 所 得 数 据 按 照 时 间 不 同 进 行 分 析 处 理 并 绘 制 生 长 曲 线 3 结 果 与 分 析 3.1 大 肠 杆 菌 生 物 膜 筛 选 结 果 本 次 试 验 利 用 96 孔 微 量 板 法, 经 结 晶 紫 染 色, 冲 洗 晾 干 后, 在 96 孔 U 型 平 板 底 部, 可 看 到 一 层 均 匀 淡 紫 色 的 薄 膜, 初 步 判 断 为 大 肠 杆 菌 形 成 的 生 物 膜, 并 且 能 够 形 成 厚 薄 不 同 的 生 物 膜 ( 见 图 1) 从 60 株 大 肠 杆 菌 进 行 了 生 物 膜 的 筛 选, 得 到 9 株 生 物 膜 阳 性 菌, 阳 性 率 为 15%, 其 中 1 株 大 肠 杆 菌 生 物 膜 呈 现 出 强 阳 性 3.2 大 肠 杆 菌 生 物 膜 粘 附 性 分 析 结 果 基 于 临 界 值 ODc, 菌 株 生 物 膜 可 以 分 为 :OD ODc 为 不 粘 附 (-);ODc<OD 2ODc 为 弱 粘 附 (+ ); 2ODc<OD 3ODc 为 中 等 粘 附 (++);OD>3ODc 强 粘 图 1 大 肠 杆 菌 形 成 的 生 物 膜 阳 性 结 果 表 1 9 株 大 肠 杆 菌 生 物 膜 粘 附 性 分 析 结 果 菌 株 号 18-3 18-11 18-8 18-12 23-7 25-6 11-1 28-7 15-1 测 定 值 1.025 0.461 0.557 0.44 0.513 0.445 0.453 0.434 0.587 0.162 0.105 0.132 0.112 0.123 0.108 0.115 0.109 0.116 临 界 值 附 (+++) 的 判 断 标 准 进 行 数 据 处 理 ( 见 表 1) 在 这 9 株 大 肠 杆 菌 生 物 膜 阳 性 菌 中,1 株 为 强 粘 附 性 大 肠 杆 菌 为 18-3 号, 其 余 8 株 为 中 等 粘 附 性 大 肠 杆 菌 大 肠 杆 菌 生 物 膜 的 粘 附 性 柱 状 图 分 析 也 可 以 看 出 生 物 膜 形 成 的 强 弱 不 同 ( 见 图 2) 9 株 菌 中 仅 18-3 号 菌 为 强 粘 附 大 肠 杆 菌,OD>3ODc, 强 粘 附 (+++), 其 余 8 株 2ODc<OD 3ODc, 均 为 中 等 粘 附 大 肠 杆 菌 3.5 8 株 大 肠 杆 菌 生 物 膜 生 长 曲 线 图 3 可 看 出 强 粘 附 性 大 肠 杆 菌 18-3( 占 11.1%) 生 物 膜 的 形 成 是 一 个 动 态 的 过 程, 可 分 为 四 个 时 期 : 初 粘 附 粘 附 形 成 成 熟 的 生 物 膜 生 物 膜 脱 落, 与 铜 绿 假 单 胞 菌 金 黄 色 葡 萄 球 菌 禽 沙 门 氏 菌 等 形 成 周 期 一 致 同 一 株 大 肠 杆 菌 在 这 四 个 过 程 中 也 存 在 时 间 上 的 差
26 中 国 农 学 通 报 http://www.casb.org.cn 测 定 值 临 界 值 图 2 9 株 大 肠 杆 菌 生 物 膜 的 粘 附 性 分 析 结 果 测 定 值 菌 株 号 图 3 大 肠 杆 菌 (18-3) 生 物 膜 生 长 曲 线 结 果 异,18-3 号 菌 在 37 恒 温 箱 中 培 养 2 h 后 完 成 初 粘 附, 4 h 形 成 了 粘 附, 在 8 h 形 成 了 成 熟 的 生 物 膜, 在 8~12 h 这 个 时 间 段, 成 熟 的 生 物 膜 开 始 脱 落, 在 12 h 以 后, 该 大 肠 杆 菌 进 入 下 一 个 生 长 周 期, 随 着 营 养 物 质 的 大 量 消 耗, 大 量 代 谢 产 物 聚 集, 可 导 致 细 菌 在 形 成 下 一 个 生 长 周 期 生 物 膜 的 生 长 能 力 比 前 一 个 生 物 膜 的 能 力 减 弱, 生 长 曲 线 峰 值 出 现 减 弱 的 现 象 图 4~5 可 看 出 : 八 株 菌 均 为 中 等 粘 附 性 大 肠 杆 菌 ( 占 88.9%), 其 中, 18-8 18-11 18-12 25-6 11-1 28-7 15-1 七 株 菌 在 12 h 形 成 初 粘 附,36 h 完 成 粘 附,48 h 形 成 了 成 熟 的 生 物 膜,48~60 h 生 物 膜 脱 落,60 h 以 后 进 入 下 一 个 生 长 周 期 23-7 菌 在 12 h 时 形 成 初 粘 附,24 h 完 成 粘 附,36 h 形 成 成 熟 的 生 物 膜,36~60 h 生 物 膜 脱 落,60 h 后 进 入 下 一 个 生 长 周 期 4 结 论 本 次 试 验 成 功 地 利 用 96 孔 微 量 板 法, 从 60 株 大 肠 杆 菌 筛 选 得 到 9 株 生 物 膜 阳 性 菌 在 9 株 生 物 膜 阳 性 菌 中, 生 物 膜 形 成 的 能 力 表 现 出 强 弱 之 分 由 大 肠 杆 图 4 4 株 中 等 粘 附 大 肠 杆 菌 生 物 膜 生 长 曲 线 结 果 图 5 4 株 中 等 粘 附 大 肠 杆 菌 生 物 膜 生 长 曲 线 结 果 菌 生 物 膜 生 长 曲 线 上 可 以 看 出 : 大 肠 杆 菌 生 物 膜 形 成 过 程 也 是 一 个 动 态 的 过 程, 可 分 为 四 个 时 期 : 初 粘 附 粘 附 形 成 成 熟 的 生 物 膜 生 物 膜 脱 落 与 铜 绿 假 单 胞 菌 金 黄 色 葡 萄 球 菌 禽 沙 门 氏 菌 等 形 成 周 期 一 致 但 在 这 四 个 过 程 中 同 种 大 肠 杆 菌 形 成 成 熟 的 生 物 膜 的 时
喻 华 英 等 : 大 肠 杆 菌 生 物 膜 的 筛 选 及 生 长 曲 线 测 定 27 间 上 也 存 在 差 异 5 讨 论 5.1 新 疆 地 区 犊 牛 腹 泻 病 的 临 床 特 点 近 年 来, 在 新 疆 地 区, 养 牛 业 出 现 快 速 迅 猛 的 发 展, 成 为 农 牧 民 增 收 的 主 要 手 段 之 一, 但 是 犊 牛 腹 泻 病 的 危 害 在 养 牛 业 中 危 害 也 越 来 越 严 重, 同 时 不 同 地 区 的 致 犊 牛 腹 泻 病 的 大 肠 杆 菌 普 遍 存 在 对 抗 生 素 有 较 强 的 耐 药 性 反 复 性 感 染 不 易 根 治 和 致 病 力 强 等 特 点 5.2 大 肠 杆 菌 生 物 膜 的 形 成 与 犊 牛 腹 泻 病 的 关 系 大 肠 杆 菌 能 在 口 腔 尿 道 呼 吸 道 生 殖 道 肠 道 等 管 状 器 官 表 面 形 成 生 物 膜, 来 对 抗 不 利 的 环 境, 这 是 细 菌 所 具 有 的 一 种 非 常 特 殊 而 重 要 的 适 应 环 境 的 机 制 本 次 试 验 利 用 96 孔 微 量 板 法, 从 60 株 大 肠 杆 菌 进 行 了 生 物 膜 的 筛 选, 得 到 9 株 生 物 膜 阳 性 菌, 阳 性 率 为 15%, 表 明 : 在 新 疆 地 区 致 犊 牛 腹 泻 病 的 大 肠 杆 菌 普 遍 存 在 对 抗 生 素 有 较 强 的 耐 药 性 反 复 性 感 染 不 易 根 治 和 致 病 力 强 可 能 与 大 肠 杆 菌 生 物 膜 形 成 有 关 同 时 由 9 株 大 肠 杆 菌 形 成 生 物 膜 能 力 强 弱 不 同 及 生 物 膜 生 长 曲 线 时 间 也 不 尽 相 同, 这 进 一 步 为 临 床 上 大 肠 杆 菌 出 现 反 复 感 染 致 病 力 增 强 对 抗 生 素 耐 药 升 高 不 易 根 治 等 提 供 了 一 定 的 理 论 佐 证 本 试 验 通 过 利 用 96 孔 微 量 板 法 和 提 供 一 种 寡 营 养 的 培 养 基 M9, 模 拟 肠 道 内 大 肠 杆 菌 的 生 活 环 境, 对 犊 牛 腹 泻 病 中 大 肠 杆 菌 阳 性 菌 生 物 膜 生 长 曲 线 进 行 测 定 分 析, 为 临 床 治 疗 和 预 防 犊 牛 腹 泻 病 提 供 了 新 的 思 路 参 考 文 献 [1] 唐 童 画, 刘 国 生, 谢 志 雄, 等. 细 菌 生 物 膜 的 结 构 及 形 成 机 制 研 究 进 展 [J]. 氨 基 酸 和 生 物 资 源,2006,28(3):30-33. [2] 李 学 如, 贾 文 祥. 细 菌 生 物 膜 的 形 成 及 其 相 关 感 染 与 防 治 [M]. 中 国 抗 生 素 杂 志,2003,8(1):55-56. [3] 陈 静, 刘 显 军, 边 连 全, 等. 细 菌 生 物 膜 及 细 菌 群 体 感 应 系 统 的 研 究 进 展 [J]. 江 苏 农 业 科 学,2010(5):32-33. [4] Stewart P S. Mechanisms of antibiotic Resistance in bacterial biofilms [J].Intentional Joual of Medical Mich.Biology,2002,292: 107-113. [5] 王 丽 英. 生 物 膜 的 形 成 与 控 制 [J]. 食 品 工 业 科 技,1998(6):69-70. [6] 唐 俊 妮, 史 贤 明, 王 红 宁, 等. 细 菌 生 物 膜 的 形 成 与 调 控 机 制 [M]. 生 物 学 杂 志,2009,26(2): 48-49. [7] Costerton J W, Stewart P S, Green berg E P. Bacteriological: A common cause of persistent infection [J].science,1999,21:284 (5418):1318-1322. [8] 梁 宇 寰, 刘 新. 细 菌 生 物 膜 耐 药 机 制 研 究 [J]. 沈 阳 医 学 院 学 报,2007, 9(3):176-177. [9] 宋 志 军, 吴 红,Givskov M. 细 菌 生 物 膜 与 抗 生 素 耐 药 [J]. 自 然 科 学 进 展,2003(10):132-135. [10] 陈 维 贤, 张 丽 萍. 细 菌 生 物 被 膜 的 研 究 进 展 [J]. 微 生 物 学 杂 志,2004 (1):47-49. [11] 李 京 宝, 韩 峰, 于 文 功. 细 菌 生 物 膜 研 究 技 术 [J]. 微 生 物 学 报,2007,47 (3):559-562. [12] 丁 进 亚, 黄 前, 曹 军 皓. 细 菌 生 物 膜 的 防 治 进 展 [J]. 医 学 综 述,2011,17 (3):84-96. [13] Yasmeen T, Farhan E, Faisal A. Study on biofilm-forming properties of clinical isolates of Staphylococcus aureus [J].Infect Dev Ctries,2012,5(6):403-409. [14] 屈 常 林, 高 洪, 赵 宝 洪, 等. 细 菌 生 物 被 膜 与 抗 生 素 耐 药 机 制 研 究 进 展 [J]. 动 物 医 学 进 展,2008,29(3):251-254. [15] Kaplan J B. Biofilm dispersal: mechanisms, clinical implications, and potential therapeutic uses [J].Dent Res,2010,89(3):205-218. [16] Cotter J, Casey E. Rapid depletion of dissolved oxygen in 96 well microtiter plate Staphylococcus epidermidis biofilm assays promotes biofilm development and is influenced byinoculum cell concentration[j].biotechnol Bioeng,2009,15(8):123-125. [17] Wimpenny J, Manz W, Szewzy U. Heterogeneity in biofilm. FEMS Microbiol Rew[J]. Reproduction,2004,24:661-671.