生物技术通报 BIOTECHNOLOGY 研究报告 BULLETIN 海洋真菌梅花状青霉 FS83 抗菌抗肿瘤活性研究 李浩华 陈玉婵 王磊 章卫民 广东省微生物研究所 广东省菌种保藏与应用重点实验室 广东省微生物应用新技术公共实验室 广东省华南应用微生物重点实验室 省部 共建国家重点实验室培育基地 广州 510070 摘 要 采用滤纸片法测定海洋真菌梅花状青霉 Penicillium herquei FS83 的发酵提取物对金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa 和大肠杆菌 Escherichia coli 的抑菌活性 采 用生长速率法测定提取物对绿色木霉 Trichoderma viride 黑曲霉 Aspergillus niger 黄曲霉 Aspergillus flavus 链格孢 Alternaria alternata 和胶孢炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides 的抗真菌活性 并采用连续稀释法测定提取物对所有细菌和真菌的最低 抑制浓度 MIC 值 此外 还通过 MTT 法测试提取物对人肺癌细胞 NCI-H460 人乳腺癌细胞 MCF-7 和人神经胶质瘤细胞 SF-268 的细胞毒活性 结果表明 对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有明显的抑制活性 抑菌圈分别为 18.1 mm 17.3 mm 最低抑制浓度均为 mg/ml 对所有供试真菌也有较好的抑制作用 抑菌率均达 50% 以上 最低抑制浓度为 0.78-3.12 mg/ml 对枯草芽孢杆菌有明显的抑制作用 抑菌圈达 16.4 mm 最低抑制浓度均为 mg/ml 对所有供试真菌也 有较好的抑制作用 最低抑制浓度为 - mg/ml 对 3 种肿瘤细胞株有较强的细胞毒活性 IC50 值为 55.9-63.5 μg/ml 对肿瘤细胞株 MCF-7 有较强的细胞毒活性 在 200 μg/ml 浓度下的抑制率为 84.3% 关键词 海洋真菌 梅花状青霉 提取物 抑菌活性 细菌 真菌 细胞毒活性 Study on Antimicrobial and Antitumor Activities of Marine-derived Fungus Penicillium herquei FS83 Li Haohua Chen Yuchan Wang Lei Zhang Weimin Guangdong Provincial Open Laboratory of Applied Microbiology Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and South China Guangdong Application State Key Laboratory of Applied Microbiology Ministry-Guangdong Province Jointly Breeding Base Institute of Microbiology Guangzhou 510070 Abstract: The mycelial and broth extracts of a marine-derived strain of the fungus Penicillium herquei FS83 were tested for their antibacterial activities against Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli by filter paper method, and investigated for their antifungal activities against Trichoderma viride, Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Alternaria alternate and Colletotrichum gloeosporioides by growth rate method. Minimum inhibitory concentrations MICs of the culture extracts were determined by serial dilution method. Furthermore, the extracts were evaluated for their cytotoxic activities against NCI-H460, MCF-7, and SF-268 tumor cell lines by the MTT method. The results showed that the mycelial extract displayed significant inhibitory effect on S. aureus and B. subtilis with inhibition zone diameters of 18.1 and 17.3 mm respectively, and the same MIC of mg/ml, and also exhibited satisfactorg antifungal activities against all the test fungi with inhibitory rates of over 50% and MICs in the range of 0.78-3.12 mg/ml. The broth extract showed a remarkable antibacterial effect on B. subtilis with an inhibition zone diameter of 16.4 mm and an MIC of mg/ml, and also displayed antifungal activities on all the test fungi with MICs in the range of - mg/ml. The mycelial extract had a strong cytotoxic activity against the three tumor cell lines with IC50 values between 55.9-63.5 μg/ml, and the broth extract showed a strong cytotoxic activity against MCF-7 cell line with an inhibition rate of 84.3% at a concentration of 200 μg/ml. Key words: Marine fungus Penicillium herquei Extract Antimicrobial activity Bacteria Fungi Cytotoxic activity 收稿日期 2012-06-18 基金项目 广东省科技计划项目 2011B031200003, 2010B030600010 中国科学院知识创新工程重要方向项目 KSCX2-EW-G-12B 作者简介 李浩华 女 助理研究员 研究方向 微生物资源及其活性物质 E-mail: hhli100@ 126. com 通讯作者 章卫民 男 研究员 研究方向 微生物资源及其活性物质 E-mail: wmzhang58@yahoo.com.cn
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 152 微生物发酵产物一直是医药上的重要资源 但 作台 上海恒益科技有限公司 CO2 培养箱 SHEL- 近年来随着陆地资源的不断开发 筛选新的微生物 LAB 公司 倒置显微镜 OLYMPUS 公司 酶标 资源 寻找新的活性代谢产物难度越来越大 1 海 洋约占地球表面积的 71% 蕴藏丰富的微生物资源 仪 BIO-TEK 公司 旋转真空蒸发仪 上海亚荣生 化仪器厂 无水乙醇 分析纯 广州化学试剂厂 RPMI- 是开发药物的重要源泉 海洋真菌是海洋微生物的重 要组成部分 不但种类多 分布广 而且生活在海 1640 培养基 Gibco 公司 胎牛血清 Gibco 公司 洋高盐 高压 低温 低光照 寡营养等特殊环境中 双抗 10 000 U/mL 青霉素 +10 000 U/mL 链霉素 能产生陆栖微生物所不能产生的结构新颖 作用特 Gibco 公司 胰酶 Amresco 公司 二甲基亚砜 DMSO 2 3 殊的活性代谢产物 因此 海洋真菌资源具有重 要的研究和开发价值 是寻找药物先导化合物的重 Sigma 公司 四甲基偶氮唑盐 MTT Sigma 公司 1.2 方法 要来源 为了发掘海洋来源的药用真菌资源 本课 1.2.1 题组对分离自南海沉积物的海洋真菌进行筛选 发 菌株梅花状青霉 FS83 接种到 PDB 液体培养基中 现梅花状青霉 Penicillium herquei FS83 具有生长 26 120 r/min 培养 7 d 提取物的制备 将菌株 速度快 提取物得率高 代谢产物丰富等特点 为 FS83 发酵产物过滤 分离发酵液和菌丝体 发酵液 了进一步探讨梅花状青霉的生物活性 本研究拟探 用乙酸乙酯萃取 4 次 萃取液在 40 下减压浓缩至 讨梅花状青霉 FS83 的发酵液和对 4 种 干 得浸膏 菌丝体用无水乙醇冷浸 细菌 5 种真菌和 3 种肿瘤细胞株的抑制活性 为 多次至提取液基本无色 合并提取液 提取液 55 进一步开发新的抗菌 抗肿瘤活性物质奠定基础 下减压浓缩至干 得浸膏 将两种提 1 取物浸膏用二甲基亚砜 DMSO 溶解 配制成 50 材料与方法 1.1 1.1.1 菌株发酵 将 mg/ml 浓度 备用 材料 菌株来源 菌株的发酵与提取物的制备 海 洋 真 菌 FS83 从 南 海 106 30.295' E 10 0.941' N 1 675 m 深处的南海海底沉 积物中分离 纯化得到 根据形态学特征和 ITS 序 列分析结果 该菌株被鉴定为梅花状青霉 Penicillium 1.2.2 抗细菌活性的测定 细菌活化及菌悬液制备 将各供试细菌接种于 LB 液体培养基中 37 培养 24 h 用无菌生理盐水稀释 配制成 105-107 CFU/mL 浓度的菌液 抗细菌活性的测定采用滤纸片法 4 5 取制备 其基因登录号为 JQ034358 菌株保存于 herquei 好的细菌悬液 1 ml 放入平板中 倒入已冷却至合适 广东省微生物研究所 温度的 LB 培养基 混合均匀 用无菌镊子夹取厚 1.1.2 及肿瘤细胞株 细菌 金黄色葡萄 球菌 Staphylococcus aureus 枯草芽孢杆菌 Bacill 铜 绿 假 单 胞 菌 Pseudomonas aeruginous subtilis 大肠杆菌 Escherichia coli 真菌 绿色木霉 sa Trichoderma viride 黑曲霉 Aspergillus niger 黄 曲霉 Aspergillus flavus 链格孢 Alternaria alterna 胶孢炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides 肿 ta 度为 1.5 mm 直径 6 mm 的滤纸片置于含菌平板上 每个菌种设 3 皿重复 同时在滤纸片上分别滴提取 液 10 μl 以 DMSO 代替样品作空白对照 以浓度 为 200 μg /ml 的硫酸卡那霉素作阳性对照 将平板 置于 37 恒温箱培养 24 h 用十字测量法测量菌圈 直径的大小 计算抑菌圈的平均值 1.2.3 抗真菌活性测定 真菌的活化 分别挑取各 瘤细胞株 人肺癌细胞 NCI-H460 人乳腺癌细胞 供试真菌斜面菌种一小块接种于 PDA 平板中 28 MCF-7 人神经胶质瘤细胞 SF-268 以上菌株和肿 恒温箱培养 72 h 瘤细胞株均保存于广东省微生物研究所 1.1.3 仪器与试剂 PYX-DHS 电热恒温培养箱 湖 抗真菌活性的测定采用生长速率法 6 取浓 度为 50 mg/ml 的样品提取液 0.1 ml 均匀涂布到含 北省黄石医疗器械厂 YXQ.WY21-600 电热高压蒸 PDA 固体培养基的培养皿中 在平皿中央分别接入 汽灭菌锅 广州市华南医疗器械有限公司 超净工 直径为 4 mm 的绿色木霉 黑曲霉 黄曲霉 链格孢
153 李浩华等 海洋真菌梅花状青霉 FS83 抗菌抗肿瘤活性研究 胶 孢 炭 疽 菌 的 菌 饼 每 处 理 重 复 3 皿 以 DMSO 个空白调零孔 于 37 5 CO2 培养箱中培养 24 代替样品作空白对照 置于 28 恒温培养箱培养 h 待细胞贴壁后 每孔分别加入 20 μl 浓度为 200 72 h 用 十 字 测 量 法 记 录 菌 饼 生 长 直 径 计 算 抑 μg/ml 提 取 物 稀 释 溶 液 阴 性 对 照 加 20 μl RPMI- 制率 1640 培养基 阳性对照加 20 μl 浓度为 10 μg/ml 顺 抑制率 = 1- 处理组纯生长量 / 对照组 铂溶液 每孔设 3 个重复 置 CO2 培养箱中培养 72 纯生长量 100% 其中纯生长量 mm = 菌饼生 h 后 每 孔 加 入 20 μl 浓 度 为 5 mg/ml MTT 溶 液 长直径 -4 37 培养 4 h 后 小心吸去上清液 每孔加入 DMSO 1.2.4 最低抑菌浓度的测定 采用连续稀释法 最低抑菌浓度的测定 150 μl 振荡 10 min 使紫蓝色结晶完全溶解后 用 7 提取液按试管二倍稀释法 将 酶标仪测定每孔 490 nm 吸光值 OD490 取 3 孔平 细菌用 LB 液体培养基 真菌用 PDB 液体培养基按 均吸光值 按以下公式计算提取物对细胞生长的抑 1 2 1 4 1 8 1 16 1 32 以及 1 64 mg/ml 制率 比例稀释 提取液浓度分别为 25 12.5 3.125 25 及 0.7812 mg/ml 吸 取 不 同 浓 度 的 提 取 液 100 μl 于试管中 再分别加入 100 μl 菌液 使细菌 的含菌量达 106-107CFU/mL 真菌含孢子数 106-107 个 /ml 细菌以 LB 液体培养基 真菌以 PDB 液体 培养基分别代替提取液作为空白对照组 细菌置于 30 恒温箱培养 24 h 真菌置于 28 恒温箱培养 72 细胞生长抑制率 = 1-OD 样品组 /OD 对照组 100 采用 SigmaPolot 10.0 软件计算对肿瘤细胞株的 IC50 值 2 2.1 结果 对细菌的抑制作用 梅花状青霉 FS83 提取物对 4 种供试细菌的抑制 h 然后于含相应培养基的平皿上划线培养 细菌培 养 24 h 真菌培养 72 h 观察生长情况 以试管澄清 效果 见表 1 结果显示 对枯草芽 划线培养不长菌的浓度为最低抑菌浓度 MIC 值 孢杆菌抑制效果最好 抑制圈直径达 16.4 mm 对 8 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌也有一定的抑制效 分别取对数生长期的 NCI-H460 细胞 MCF-7 细胞 果 抑菌圈直径均为 9.5 mm 对金黄 SF-268 细胞 用胰酶消化 台盼蓝染色计数 台盼 色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌有较强的抑制作用 抑 1.2.5 肿瘤细胞毒活性测定 采用 MTT 法测定 蓝排斥试验检测细胞活力大于 95 后 用新鲜培养 4 菌圈直径分别为 18.1 mm 17.3 mm 对铜绿假单胞 基调整细胞浓度为 3 10 个 /ml 将细胞分别接种 菌也有一定的抑制作用 但抑菌圈不明显 两种提 于 96 孔板 每孔加入 180 μl 的细胞悬液 并设 3 取物对大肠杆菌均没有抑制作用 表1 梅花状青霉 Penicillium herquei FS83 提取物对细菌的抑制效果 n=3 抑菌圈直径 mm 空白对照 阳性对照 枯草芽孢杆菌 6.0±0.65 16.4±0.92 17.3±0.22 30.2±0.12 金黄色葡萄球菌 6.0±0.33 9.5±0.83 18.1±0.43 16.2±0.22 铜绿假单胞菌 6.0±0.42 9.5±0.51 6.6±0.86 7.0±0.35 大肠杆菌 6.0±0.11 6.0±0.45 6.0±0.26 6.0±0.72 药物组每片滤纸含提取物 500 μg 阳性对照组每片滤纸含药物 2 μg 2.2 对细菌的最低抑制浓度 取物对金黄色葡萄球菌也有很好抑制效果 最低抑 梅花状青霉 FS83 提取物对细菌的最低抑制浓 制浓度为 μg/ml 度 见表 2 两种提取物对枯草芽孢杆菌的抑制效 果最好 最低抑制浓度均为 μg/ml 菌丝体提 2.3 对真菌的抑制作用 梅花状青霉 FS83 提取物对 5 种供试真菌的抑制
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 154 表 2 梅花状青霉 Penicillium herquei FS83 提取物对 细菌的最低抑菌浓度 MICs 最低抑制浓度 mg/ml 样品 铜绿假单胞菌 抑制试验显示 表 5 对 NCI-H460 MCF-7 SF-268 有 较 好 的 抑 制 作 用 抑 制 率 均 达 80% 以上 而仅对 MCF-7 有较好的细 枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌 胞毒活性 抑制率为 84.38% 对细胞株 SF-268 和 12.5 NCI-H460 的抑制作用则不明显 通过进一步测试 对 3 种肿瘤细胞株 NCI-H460 MCF-7 效果 如表 3 所示 对绿色木霉 黑 曲霉 黄曲霉 链格孢都有显著的抑制活性 抑菌 率达 70% 以上 对绿色木霉 黑曲霉 SF-268 的 IC50 值分别为 55.8 62.5 63.5 μg/ml 表 6 表5 梅花状青霉 Penicillium herquei FS83 提取物对 3 种肿瘤细胞株的抑制率 n=3 胶孢炭疽菌有一定抑制效果 抑制率均达 50% 以上 肿瘤细胞株 表3 梅花状青霉 Penicillium herquei FS83 提取物对 真菌的抑制作用 抑制率 % 抑制率 % NCI-H460 96.4±0.96 1.33±0.26 98.6±0.11 顺铂 MCF-7 84.2±0.08 84.3±0.73 98.7±0.33 SF-268 84.1±0.12 33.9±0.49 96.7±0.78 药物的作用浓度为 200 μg/ml 顺铂的作用浓度为 10 μg/ml 绿色木霉 78.0±0.42 94.1±0.25 黑曲霉 60.6±0.16 77.5±0.61 黄曲霉 36.6±0.32 73.2±0.56 链格孢 42.1±0.25 71.1±0.31 期 才 开 始 有 零 星 的 报 道 1986 年 Schiehser 等 9 胶孢炭疽菌 51.5±0.76 51.5±0.43 从海洋真菌 Leptosphaeria oraemaris 中分离到第一个 每平皿含提取物 5 mg 2.4 讨论 海洋真菌活性成分的研究自 20 世纪 80 年代中 具有抗菌活性的天然产物 Leptosphaerin 使人们认 识到海洋真菌是寻找活性物质的重要资源 从中可 对真菌的最低抑制浓度 从表 4 可以看出 对绿色木霉的 抑制效果最好 最低抑制浓度仅为 0.78 mg/ml 对 胶孢炭疽菌的最低抑制浓度最高 为 3.12 mg/ml 对其他 3 种真菌的最低抑制浓度均为 mg/ml 梅花状青霉 FS83 对绿色木霉 黑曲 霉具有较好的抑制活性 最低抑制浓度均为 mg/ml 以筛选到结构新颖 具有生物活性的代谢产物 王 书锦等 10 从中国黄 渤海 辽宁近海地区分离得 到 海 洋 真 菌 508 株 主 要 有 青 霉 属 Penicillum 曲 霉 属 Aspergillus 镰 刀 菌 属 Fusarium 等 10 以上发酵产物具有抗细菌或抗真菌生物活性 徐宇航等 11 从厦门海域红树 海藻和海洋沉积物 样品中分离得到 24 株具有抗肿瘤活性的菌株中 青 霉属 Penicillum 真菌有 9 株 占全部活性菌株的 表 4 梅花状青霉 Penicillium herquei FS83 提取物对 真菌的最低抑菌浓度 MICs 3 最低抑制浓度 mg/ml 37% 因此 青霉属真菌是发掘新的海洋活性物质 的重要来源 近年来已从海洋青霉中发现了不少具 有药用价值的活性代谢产物 如 Gao 等 12 从海藻 内生真菌 Penicillium chrysogenum 中分离得到两个多 绿色木霉 0.78 黑曲霉 黄曲霉 链格孢 胞毒活性 Li 等 13 从海洋青霉 Penicillium terrestre 胶孢炭疽菌 3.12 3.12 中分离得到的含氯聚酮类化合物 Chloctanspirones A 聚氧化性类固醇化合物 Penicisteroids A 和 B 其中 Penicisteroids A 具有很强的抗菌活性和选择性的细 对 肿 瘤 细 胞 株 HL-60 和 A-549 具 有 明 显 的 抑 制 活 2.5 对肿瘤细胞的抑制作用 性 IC50 分别为 9.2 和 39.7 μmol/l Zhuang 等 14 从 梅花状青霉 FS83 提取物对 3 种肿瘤细胞株的 一株海洋青霉 Penicillium sp. F11 中分离得到新的聚
表6 细胞株 155 李浩华等 海洋真菌梅花状青霉 FS83 抗菌抗肿瘤活性研究 梅花状青霉 Penicillium herquei FS83 对 3 种肿瘤细胞株的 IC50 值 n=3 FS83 提取物浓度 μg/ml IC50 值 μg/ml 200 100 80 60 40 20 10 NCI-H460 96.4±1.25 85.3±0.96 73.8±0.11 52.8±0.71 38.6±0.91 28.7±0.69 12.3±1.35 55.8±0.22 MCF-7 95.7±0.41 71.6±0.08 67..6±1.23 46.2±0.25 28.1±0.36 15.3±0.88 8.49±0.33 62.5±0.43 SF-268 85.8±0.64 63.4±0.12 57.8±0.34 48.7±1.36 28.9±0.87 15.2±0.75 11.6±0.40 63.5±0.76 酮类化合物 Penicillone A 对肿瘤细胞株 HT1080 和 Cne2 具有一定的抑制活性 IC50 分别为 45.8 和 46.2 μg/ml 4 7 刘胜贵, 李军, 陈富成, 等. 羊耳菊水提物体外抑菌活性研 究 J. 时珍国医国药, 2009, 20 12 3072-3074. 8 Li ER, Jiang LH, Guo LD, et al. Pestalachlorides A-C, antifungal metabolites from the plant endophytic fungus Pestalotiopsis adus- 结论 本研究对海洋沉积物来源的梅花状青霉 FS83 提 取物的抗菌 抗肿瘤活性进行研究发现 其发酵液 提取物对枯草芽孢杆菌表现出明显的抗菌活性 对 绿色木霉 黑曲霉 胶孢炭疽显示良好的抑制作用 抑菌率均达 50 % 以上 对肿瘤细胞 MCF-7 也有一 定的细胞株毒活性 对金黄色葡萄球 菌 枯草芽孢杆菌有较强的抑制作用 对供试的 5 种真菌均表现出很好的抑制活性 对 3 种肿瘤细胞 株也显示了明显的抑制作用 参考文献 1 阎雪芬, 黄丹虹, 代宇博, 等. 海洋真菌抗氧化活性物质的初步 研究 J. 厦门大学学报, 2007, 4 3 418-421. 2 许实波主编. 海洋生物制药 M. 第 2 版. 北京 化学工业出 版社, 2007. 3 郭跃伟. 海洋天然产物和海洋药物研究的历史 现状和未来 J. 自然杂志, 2008, 31 1 27-32. 4 张伟, 檀建新, 贾英民, 等. 竹叶对食品致病菌的抑菌作用 J. 食品科学, 1998, 19 4 37-40. 5 董金甫, 李瑶青, 洪绍梅. 茶多酚对 8 种致病菌最低抑制浓度 ta J. Bioorg Med Chem, 2008, 16 7894-7899. 9 Schiehser GA, White JD, Matsumoto G, et al. The structure of leptosphaerin J. Tetrahedron Lett, 1986, 46 27 5587-5590. 10 王书锦, 胡江春, 薛德林, 等. 中国黄 渤海 辽宁近海地区 海洋微生物资源的研究 J. 锦州师范学院学报 自然科学版, 2001, 22 01 l-5. 11 徐宇航, 苟晓铁, 郑忠辉, 等. 海洋真菌抗肿瘤活性菌株的 筛选 J. 厦门大学学报 自然科学版, 2008, 47 2 123126. 12 Gao SS, Li XM, Li CS, et al. Penicisteroids A and B, antifungal and cytotoxic polyoxygenated steroids from the marine alga-derived endophytic fungus Penicillium chrysogenum QEN-24S J. Bioorg Med Chem Lett, 2011, 21 2894-2897. 13 Li D, Chen L, Zhu TJ, et al. Chloctanspirones A and B, novel chlorinated polyketides with an unprecedented skeleton, from marine sediment derived fungus Penicillium terrestre J. Tetrahedron, 2011, 67 7913-7918. 14 Zhuang P, Tang XX, Qiu YK, et al. Two new compounds from marine-derived fungus Penicillium sp. F11 J. J Asian Nat Prod Res, 2012, 14 3 197-203. 的研究 J. 食品科学, 1995, 16 1 6-12. 6 张兴, 王兴林. 植物化学保护实验指导 M. 杨凌 西北农林 科技大学出版社, 2000 66-67. 责任编辑 李楠