克肺癆 結核菌感染診斷試管組 QuantiFERON -TB Gold(QFT ) 衛署醫器輸字第 020770 號 供體外診斷使用 For In Vitro Diagnostic Use 使用前請務必詳閱原廠之使用說明書並遵照指示使用 1. 效能 QuantiFERON -TB Gold (QFT ) 為一種體外模擬診斷試驗, 利用胜肽 (ESAT-6,CFP-10,TB7.7) 刺激肝素化之全血中的細胞, 再經由酵素聯結免疫吸附分析法 (ELISA) 測定對該胜肽抗原體外反應所產生的干擾素 -γ, 以鑑定測試者是否受到結核菌的感染 QFT 是一種間接檢測結核菌感染 ( 含結核病 ) 的測試, 並可結合風險評估 放射攝影及其他醫療與診斷上的評估 2. 產品敘述結核病是一種具傳染性的疾病, 係由結核菌複合體 [ 結核分枝桿菌 (M. tuberculosis) 牛分枝桿菌 (M. bovis) 非洲分枝桿菌(M. africanum)] 所致 一般是從呼吸性結核病患者藉由空氣飛沫傳染至新病患 被傳染的病患, 從感染到發病的時間, 短則幾週 長可至幾個月, 但大部分被感染的患者還算是能維持良好病況 而潛伏性結核菌感染 (latent tuberculosis infection, LTBI) 是一種非傳染性 無症狀的情況, 結核菌會潛伏在那些已受感染的患者身上數月 甚至數年之後才發病 診斷 LTBI 的主要目的為預防結核病的醫療方式 結核菌素皮膚測試 (tuberculin skin test, TST) 是之前唯一可以診斷 LTBI 的方法 TST 陽性反應會在感染後 2~10 週產生 然而, 有些受感染的病患對 TST 呈現陰性反應, 包括那些免疫功能受到大範圍阻礙或甚至未有免疫受阻情況的人 相反地, 有些不像是感染結核菌的病患, 卻對結核菌素產生反應 ( 即出現陽性結果 ), 包括接種卡介苗 (bacilli Calmette-Guérin, BCG) 之後 非結核菌之其他分枝桿菌感染 或其他不確定因素的病人 雖然其他器官系統也有可能被感染, 但 LTBI 必須從結核病中被區分出來, 通常診斷肺部及下呼吸道是否有受感染的報告 而結核病可由病史 生理 放射 組織及分枝桿菌學的發現來診斷 QFT 是一種利用模擬分枝桿菌蛋白質的胜肽抗原, 並檢測其所引發細胞媒介免疫 (Cell Mediated Immune, CMI) 反應的測試 所有的 BCG 菌株及大部份的非結核分枝桿菌並不存在 ESAT-6 CFP-10 及 TB7.7(p4) 這三種蛋白質, 但 M. kansasii M. szulgai 及 M. marinum 1 除外 受感染的患者, 其血液中通常有淋巴球能辨認抗原是來自結核菌分枝桿菌或是其他分枝桿菌, 這種辨識過程會產生並分泌細胞激素, 亦即 IFN-γ 而檢測 IFN-γ 與後續的定量便成為本測試的基礎 用於 QFT 的抗原是模擬 ESAT-6 CFP-10 及 TB7.7(p4) 蛋白質的胜肽 多項研究證實這些胜肽抗原能刺激感染結核菌患者之 T 細胞產生 IFN-γ 的反應, 但在未感染者 或接種卡介苗但無結核病或無 LTBI 風險者, 則不會產生反應 1-32 然而, 病人若有接受減弱免疫的治療或有免疫功能下降的病況時, 有可能會減少 IFN-γ 的反應 當病患感染下列分枝桿菌時, 則可能對 ESAT-6 CFP-10 及 TB7.7(p4) 有反應, 因為這些蛋白質的基因會在 M. kansasii M. szulgai 及 M. marinum 出現 1,23 QFT 暨可以檢測 LTBI, 對於發病患者是否感染結核菌分枝桿菌的診斷亦有所幫助 陽性結果代表診斷出感染結核病 不過, 其他分枝桿菌 ( 如 :M. kansasii) 的感染, 也可能導致陽性結果 為了確認或排除是否罹患結核病, 其他醫學或診斷上的評估是必要的 檢測原理 QFT 系統, 係使用特殊的採血管來採集全血 將血液連同試管培養 16 至 24 小時後, 取出血漿, 1
並測定對 TB 抗原有反應而產生之 IFN-γ 含量 QFT 測試分二階段進行 首先, 將全血採集至每個 QFT 採血管, 包括無抗原 (Nil) 對照管及結核菌 (TB) 抗原管, 與 Mitogen 對照管 Mitogen 對照管可作為本測試的陽性對照 當無法肯定測試者的免疫狀況時, 測定 Mitogen 管能確保其檢測結果 Mitogen 對照管亦可作為是否正確採血及培養的對照 採血管必須在採血後 16 小時內, 盡快於 37 C 培養 在 16-24 小時的培養後, 將試管離心, 取出上層血漿, 並以 ELISA 測定 IFN-γ (IU/ml) 含量 TB 抗原管的 IFN-γ 反應若顯著高於 Nil 對照之 IFN-γ 值, 則視為結核菌感染陽性 若有加測 Mitogen 管, 其所刺激的血漿樣本則作為每位測試者的陽性對照 對 Mitogen 反應較低 (< 0.5 IU/ml), 且對 TB 抗原無反應者, 其結果則視為不確定 這種現象可能發生在淋巴球不足 不適當的採檢而降低淋巴球的活動力 Mitogen 採血管充血或混合不適當 或因病人的淋巴球無法產生 IFN-γ 所致 Nil 樣本可調整血液樣本中的背景值 異嗜性抗體效應 或非特異的 IFN-γ 因此 Nil 管中 IFN-γ 的值, 會於 TB 抗原及 Mitogen 對照 ( 若有加測 ) 之 IFN-γ 的結果判讀中被減去 檢測所需時間 QFT 測試 ( 含多個樣本檢測 ) 所需時間預估如下 : 37 C 血液試管培養 : 16~24 小時 ELISA: 1 個 ELISA 盤 (28-44 位測試者 ) 大約 3 小時 人力部分少於 1 小時 每多 1 盤需增加 10~15 分鐘 3. 型號及規格採血管 ( 型號 :0590-0201 T0593-0201 和 T0590-0301) 1. Nil 對照 ( 灰蓋 ) 2. TB 抗原 ( 紅蓋 ) 3. Mitogen 對照 ( 紫蓋 ) 型號 0590-0201: 每盒含 Nil 對照 ( 灰蓋 ) 及 TB 抗原 ( 紅蓋 ) 各 100 支 型號 T0593-0201: 每盒含 Mitogen 對照 ( 紫蓋 )100 支 型號 T0590-0301: 每盒含 Nil 對照 ( 灰蓋 ),TB 抗原 ( 紅蓋 ) 及 Mitogen 對照 ( 紫蓋 ) 各 100 支 ELISA 套組 ( 型號 :0594-0201) 1. 微量盤 2 盤 12 x 8 凹槽 2. 凍晶乾燥之人類 IFN-γ 標準品 1 小瓶 3. 綠色稀釋劑 1 瓶 x 30 ml 4. 凍晶乾燥之 100 倍濃縮軛合劑 1 瓶 x 0.3 ml 5. 20 倍濃縮之清洗緩衝液 1 瓶 x 100 ml 6. 酵素受質液 1 瓶 x 30 ml 7. 酵素停止液 1 瓶 x 15 ml 8. QFT ELISA 仿單 1 本 未提供之材料 37 C 培養器, 不需 CO 2 有拋棄式吸取尖端之已校正的可調容量微量吸管, 可遞送 10 1000 µl 的容量 有拋棄式吸取尖端之已校正的多爪式微量分吸管, 可遞送 50 100 µl 的容量 微量盤振盪器 2
2L 去離子水或蒸餾水 微量盤清洗器 ( 建議使用自動清洗器 ) 微量盤判讀儀, 裝有 450 nm 濾鏡及 620-650 nm 參考濾鏡 儲存採血管 : 請置於 4 C - 25 C ELISA 套組 : 請置於 2 C - 8 C 酵素受質液須避免陽光直射 已配製與未使用之試劑 : 有關如何配製試劑, 請見 6. 操作步驟之第二階段 當儲存於 2 C - 8 C 時, 已配製的套組標準品可維持至多 3 個月 請註明套組標準品的標準品的配製配製日期日期 一旦配製後, 未使用的 100 倍濃縮軛合劑必須再存放於 2 C - 8 C, 並於 3 個月內使用 請註明軛合軛合液的配製配製日期日期 具作功強度 (working strength) 的軛合液必須於配製後 6 小時內使用 具作功強度 (working strength) 的清洗緩衝液可於室溫儲存至多 2 週 4. 警告及注意事項警告 當檢測結果呈陰性時, 仍不排除有感染結核菌或結核病的可能性 : 偽陰性結果有可能起因於感染階段 ( 如 : 檢體在發展出 CMI 反應前取得 ) 同時患有會同時患有會影響免疫功能影響免疫功能的疾病的疾病 經靜脈穿刺的採血操作的採血操作不正確不正確 測定的操作不正確測定的操作不正確 或其他免疫或其他免疫學上的變數學上的變數 當檢測結果呈陽性時, 切勿視為視為判定感染結核判定感染結核菌的唯一菌的唯一或絕對或絕對性依據依據 測定時不正確的操作, 可能會造成偽陽性反應造成偽陽性反應 當檢測結果呈陽性時, 應進一步進一步進行開放性開放性結核病的醫學結核病的醫學及診斷及診斷評估評估 ( 如 :AFB 抹片及培養 胸部 X 光 ) 雖然所有的 BCG 菌株及大部份已知的非結核分枝桿菌並不存在 ESAT-6 CFP-10 及 TB7.7(p4), 但可能因感染 M. kansasii M. szulgai 或 M. marinum 而使檢測結果呈使檢測結果呈陽性陽性 若懷疑有這類的有這類的感染, 則應加做其它做其它測試測試 注意事項 僅供體外診斷使用 操作化學物品時, 請穿戴實驗衣 操作手套操作手套 和護目鏡和護目鏡 更多更多相關相關資訊, 請參考參考安全安全資料表 (SDSs) 所有資訊皆放於網站上 www.qiagen.com/safety, 可線上讀取 PDF 格式, 或是列印出 QIAGEN 套組內容物的 SDS 注意 : 處理血液時, 請視其為潛在的傳染源 請參閱處理血液之相關規範請參閱處理血液之相關規範 以下列出的風險與安全警語皆標示標示於每個 QFT ELISA 套組中 有害物質 : 濃縮軛合劑 包含硼酸 (boric acid), 危險!可能造成可能造成生殖系統或是胎兒的危害生殖系統或是胎兒的危害 欲丟棄丟棄內容物內容物與容器時, 需由核准由核准的廢棄物處理場的廢棄物處理場處理處理 如果如果不慎接觸或不慎接觸或有疑慮, 請向醫護人員向醫護人員諮詢諮詢 於使用前於使用前取得操作指南指南 請將濃縮軛濃縮軛合液合液存放於存放於固定位置位置並上並上鎖 請配戴手套請配戴手套 穿著實驗實驗室的防護衣物 護目鏡護目鏡及防護面罩面罩 有害物質 : 酵素停止液 包含硫酸 (Sulfuric acid), 危險!會導致皮膚灼傷導致皮膚灼傷與眼睛傷眼睛傷害 對金屬金屬有腐蝕腐蝕性 欲丟棄內容物與容器時, 需由核准的廢棄物處理場處理核准的廢棄物處理場處理 如果如果酵素停止溶酵素停止溶液不慎接觸液不慎接觸到眼睛, 請立 3
即以大以大量清水沖洗量清水沖洗數分數分鐘, 如果有佩戴隱形眼隱形眼鏡請取下, 繼續用水清洗水清洗 如果如果碰觸到皮膚 ( 或頭髮 ), 請立即脫掉立即脫掉所有所有被汙染的衣物, 使用清水清水沖洗, 並立即立即向毒物中物中心與醫與醫師聯絡聯絡 請將酵素停止將酵素停止液存放於存放於固定位置位置並上並上鎖 請配戴手套請配戴手套 穿著實驗實驗室的防護衣物護衣物 護目鏡及護目鏡及防護面罩面罩 有害物質 : 酵素受質液質液 注意!會導致皮膚導致皮膚輕微輕微發炎 若有若有皮膚皮膚發炎情況情況發生, 請向醫護人員向醫護人員諮詢諮詢 有害物質 : 綠色稀釋稀釋劑含有 trisodium 5-hydroxy-1-(4-sulphophenyl)-4-(4-sulphophenylazo)pyrazole-3- carboxylate 注意!接觸會造成接觸會造成皮膚過敏皮膚過敏反應反應 欲丟棄內容物與容器時, 需由核准的廢棄物處理場處理 脫下被汙被汙染的衣物並染的衣物並清洗清洗 若皮膚皮膚有過敏過敏或起疹子疹子的狀況, 請向醫護人員諮詢 請配戴手套請配戴手套 穿著實驗實驗室的防護衣物護衣物 護目鏡及護目鏡及防護面罩面罩 有害物質 :IFN-γ 標準品含有硼酸 (boric acid) 危險危險!可能造成生殖系統或是胎兒的危害可能造成生殖系統或是胎兒的危害 欲丟棄欲丟棄內容物與容器時, 需由核准的廢棄物處理場處理 如果不慎接觸或有疑慮, 請向醫護人員諮詢諮詢 於使用前取得操作指南指南 請將濃縮軛合液濃縮軛合液存放於存放於固定位置位置並上並上鎖 請配戴手套請配戴手套 穿著實驗實驗室的防護衣物 護目鏡及護目鏡及防護面罩面罩 有害物質 : 20 倍濃縮濃縮清洗清洗緩衝緩衝液含有 Prolin 300 注意注意!會引起皮膚皮膚過敏過敏反應反應 請配戴手套請配戴手套 穿著實驗實驗室的防護衣物護衣物 護目護目鏡及防護面罩面罩 更多相關資訊 : 請參考參考安全資料表 :www.qiagen.com/safety 未遵照本仿單仿單操作步操作步驟進行進行測定測定可能可能會獲得錯誤錯誤結果結果 請於使用前請於使用前仔細研仔細研讀 使用前試劑瓶已有已有任何破損任何破損或裂漏現象漏現象的套組, 請勿使用 請勿混合或使用或使用來自來自其它其它批次批次的 ELISA 套組 根據當據當地法地法規規定規定來丟棄未使用的試劑及生物樣品 請勿使用已過期之採血管採血管或是 ELISA 套組 確認實驗實驗室的設備例設備例如微量盤清洗微量盤清洗器與微量盤微量盤判讀判讀儀於使用前已於使用前已被校被校正 5. 檢體採集及處理本測試會使用到下列採血管 : 1. Nil 對照 ( 灰蓋 ) 2. TB 抗原 ( 紅蓋 ) 3. Mitogen 對照 ( 紫蓋 )( 選擇使用 ) 由於抗原經過乾燥附著於採血管的內層上, 因此充分混合試管內含物與血液是必要的 採血管必須在採血後 16 小時內, 盡快移至 37 C 培養器中培養 為了得到最佳結果, 應遵守下列步驟 : 1. 以靜脈穿刺採集測試者血液, 並直接於每支採血管各充入 1 ml 血液 由於 1 ml 試管在抽血時相對較慢, 請讓採血管持續與針頭連接 2-3 秒直至試管顯示完全充滿血液, 並確保所抽的血量正確 採血管旁的黑線處表示為 1 ml 容量 QFT 採血管已被確認所採的血量範圍為 0.8-1.2 ml 若採血後的容量不太接近 1 ml 指示線處, 建議重新採血 若以蝴蝶針採血, 在 QFT 採血管採血前, 必須先使用乾淨的真空管以確保所連接的管路充滿血液 若要將抽血管的血液轉移至 QFT 採血管中時, 只選用 lithium heparin 為抗凝血劑的採血管 ; 因為其他的抗凝血劑會干擾分析 採血管必須維持在室溫 (17 C ~27 C) 並於採血後 16 小時內, 盡快移至 QFT 採血管以進入 37 C 培養器中培養 4
2. QFT 採血管完成填充血液之後, 立即上下震盪搖晃採血管 10 次, 以確保整個試管內層都被血液覆蓋, 以將採血管管壁上的抗原溶解 採血時, 採血管必須全程維持在溫度 (17 C ~25 C) 過度劇烈的搖晃會導致採血管底部的膠體破裂, 而使實驗結果異常 如果是使用 heparin 管採血, 血液必須先均勻的混合後再分裝到 QFT 採血管 分裝前上下倒轉以確保血液充分的混合, 之後分別取 1.0 ml 到 Nil TB Antigen 及 Mitogen 管 人員操作時要避免被血液樣本污染, 應採取適當的保護措施 : 移開 QFT 採血管的蓋子並且分別加入 1 ml 的血液 ( 到管壁外標示的黑線 ), 再蓋好蓋子並且混合 3. 正確地標示每個採血管 確認每個管子 (Nil TB Antigen Mitogen) 都有做標示 4. 採血 搖晃以及標示採血管之後的 16 小時之內, 必須盡快移到 37 C ± 1 C 培養箱中培養, 培養前採血管必須全程維持在室溫 (17 C ~27 C) 切勿冷藏或冷凍血液樣本 6. 操作步驟第一階段 血液培養及血漿取得已提供之材料 QFT 採血管 ( 請見 3. 型號及規格 ) 未提供之材料及設備請見 3. 型號及規格 步驟 1. 如 5. 檢體採集及處理所述, 若未能在採血後立即進行培養, 則培養前, 採血管必須再迅速上下倒轉十次重複混合步驟 2. 將採血管以直立方式, 於 37 C ± 1 C 培養 16-24 小時 培養箱不需 CO 2 或濕氣 3. 37 C 培養結束後, 採血管於離心前至多可於 4 C - 27 C 放置 3 天 4. 37 C 培養結束後, 採血管以轉速 2000-3000 RCF(g) 離心 15 分鐘, 分隔出血球細胞及血漿後, 吸取血漿 若未出現分隔, 則採血管須以更高轉速再次離心 亦可不經離心就吸取血漿, 但在吸取時必須特別注意不要擾動血球 5. 離心完後, 使用 pipet 吸取前, 請勿重複吸放或用其他方式混合血漿, 注意勿擾動膠體上方的物質 取出之血漿樣本可直接加入所附的 ELISA 盤中, 包括利用自動 ELISA 工作檯來檢測時 血漿可於 2 C - 8 C 儲存至多 28 天, 若採集保存於 -20 C 以下則能儲存更長時間 取得適量的檢體, 至少取得 150 µl 的血漿 第二階段 人類 IFN-γ 之 ELISA 已提供之材料 QFT ELISA 套組 ( 請見 3. 型號及規格 ) 未提供之材料及設備請見 3. 型號及規格 步驟 1. 100 倍濃縮軛合劑以外的其他全部血漿樣本及試劑, 必須於測定前調整至室溫 (17 C ~ 27 C), 且至少要 60 分鐘來達到溫度平衡 2. 先從微量盤框架取出此次還用不到的微量盤條, 再回封於鋁箔袋內, 送至冰箱存放 留下的微量盤條中, 至少有一條要供標準品使用, 其他的則必須足夠此次測定所有測試者之用 ( 見圖 2A 測 2 管及圖 2B 測 3 管的建議配置圖 ) 此次使用後, 保留微量盤框架與蓋子供回封存放之剩餘微量盤條使用 5
3. 依標準品標籤所示, 在凍晶乾燥之人類 IFN-γ 標準品小瓶內加入指示量的去離子水或蒸餾水來配製 溫和混合以防起泡, 並確保完全溶解 配製後的標準品溶液 ( 即套組標準品 ) 濃度為 8.0 IU/ml 注意 : 不同批次的標準品所的標準品所指示的示的配製配製水量水量會不同不同 套組標準品將用綠色稀釋劑 (GD) 稀釋成 4 個濃度一組的 IFN-γ 標準液 請見圖 1 S1( 標準液 1) 為 4 IU/ml S2( 標準液 2) 為 1 IU/ml S3( 標準液 3) 為 0.25 IU/ml S4( 標準液 4) 為 0 IU/ml( 只有 GD) 這些標準液在檢測時必須多組測定( 至少同時測 2 組 ) 2 組標準液之標準液之建議稀釋建議稀釋步驟 a. 分別標示 4 根試管為 S1 S2 S3 S4 b. 分別加入 150 µl 的 GD 於 S1 S2 S3 S4 c. 加入套組標準品 150 µl 於 S1, 並充分混合 d. 由 S1 吸取 50 µl 加 S2, 並充分混合 e. 由 S2 吸取 50 µl 加 S3, 並充分混合 f. 只含有 GD 的 S4 則為零標準品 3 組標準液之標準液之建議稀釋建議稀釋步驟 a. 分別標示 4 根試管為 S1 S2 S3 S4 b. 加入 150 µl 的 GD 於 S1 試管 c. 分別加入 210 µl 的 GD 於 S2 S3 S4 試管 d. 加入套組標準品 150 µl 於 S1, 並充分混合 e. 由 S1 吸取 70 µl 加 S2, 並充分混合 f. 由 S2 吸取 70 µl 加 S3, 並充分混合 g. 只含有 GD 的 S4 則為零標準品 圖 1: 標準液稀釋稀釋示意示意圖 每次 ELISA 測定前, 必須當場製作新的稀釋標準液 150 µl 50 µl 50 µl 套組標準品 8.0 IU/ml 標準液 1 4.0 IU/ml 標準液 2 1.0 IU/ml 標準液 3 0.25 IU/ml 標準液 4 0 IU/ml ( 只有 GD) 4. 在凍晶乾燥之 100 倍濃縮軛合劑小瓶內加入 0.3 ml 的去離子水或蒸餾水來配製 溫和混合以防起泡, 並確保軛合劑完全溶解 具工作強度的軛合液乃依表 1 指示, 視所需的測定量, 由綠色稀釋劑去稀釋 100 倍濃縮軛合劑配製而成 表 1: 軛合液之液之配製微量盤條數 100 倍濃縮軛合劑 綠色稀釋劑 2 10 µl 1.0 ml 3 15 µl 1.5 ml 4 20 µl 2.0 ml 5 25 µl 2.5 ml 6 30 µl 3.0 ml 6
7 35 µl 3.5 ml 8 40 µl 4.0 ml 9 45 µl 4.5 ml 10 50 µl 5.0 ml 11 55 µl 5.5 ml 12 60 µl 6.0 ml 充分但溫和地混合以防起泡 配製後, 立即將未使用的 100 倍濃縮軛合劑再存放回 2-8 C 只能使用綠色稀釋劑來配製 5. 血漿樣本如果是之前採集起來冷凍保存或採集後存放超過 24 小時, 請先混合均勻後才加入 ELISA 微量盤凹槽 若血漿是由 QFT 採血管離心後直接吸出加入, 則請避免混合 6. 用多爪式微量分吸管將 50 µl 新配製具工作強度的軛合液加至所附的 ELISA 微量盤凹槽中 7. 同樣用多爪式微量分吸管, 再將血漿樣本 50 µl 加至上述微量盤之適當凹槽中 ( 見圖 2A 及 2B 的建議配置圖 ) 最後, 再加入標準液 1 至 4 各 50 µl 圖 2A: 以 2 管 (Nil + TB) 測定樣本樣本之建議建議配置圖, 每盤 44 位 排 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1N 5N 9N 13N 17N S1 S1 25N 29N 33N 37N 41N B 1A 5A 9A 13A 17A S2 S2 25A 29A 33A 37A 41A C 2N 6N 10N 14N 18N S3 S3 26N 30N 34N 38N 42N D 2A 6A 10A 14A 18A S4 S4 26A 30A 34A 38A 42A E 3N 7N 11N 15N 19N 21N 23N 27N 31N 35N 39N 43N F 3A 7A 11A 15A 19A 21A 23A 27A 31A 35A 39A 43A G 4N 8N 12N 16N 20N 22N 24N 28N 32N 36N 40N 44N H 4A 8A 12A 16A 20A 22A 24A 28A 32A 36A 40A 44A S1( 標準液 1) S2( 標準液 2) S3( 標準液 3) S4( 標準液 4) 1N( 樣本 1 Nil 對照血漿 );1A( 樣本 1 TB 抗原血漿 ) 圖 2B: 以 3 管 (Nil + TB + Mitogen) 測定樣本樣本之建議建議配置圖, 每盤 28 位 排 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1N 1A 1M S1 S1 S1 13N 13A 13M 21N 21A 21M B 2N 2A 2M S2 S2 S2 14N 14A 14M 22N 22A 22M C 3N 3A 3M S3 S3 S3 15N 15A 15M 23N 23A 23M D 4N 4A 4M S4 S4 S4 16N 16A 16M 24N 24A 24M E 5N 5A 5M 9N 9A 9M 17N 17A 17M 25N 25A 25M F 6N 6A 6M 10N 10A 10M 18N 18A 18M 26N 26A 26M G 7N 7A 7M 11N 11A 11M 19N 19A 19M 27N 27A 27M H 8N 8A 8M 12N 12A 12M 20N 20A 20M 28N 28A 28M S1( 標準液 1) S2( 標準液 2) S3( 標準液 3) S4( 標準液 4) 1N( 樣本 1 Nil 對照血漿 );1A( 樣本 1 TB 抗原血漿 );1M( 樣本 1 Mitogen 對照血漿 ) 8. 用微量盤振盪器, 將軛合液與血漿樣本或標準液充分混合 1 分鐘 9. 以蓋子覆蓋微量盤, 並於室溫 (17~27 C) 培養 120 ± 5 分鐘 培養時, 微量盤不可暴露於陽光下直射 7
10. 在培養期間可進行清洗緩衝液的配製 將 20 倍濃縮之清洗緩衝液與去離子水或蒸餾水, 以 1 比 19 之比例稀釋並充分混合 每個 ELISA 套組所提供的 20 倍濃縮清洗緩衝液, 足夠配製 2 L 的清洗緩衝液 每個凹槽需要 400 µl 具作功強度的清洗緩衝液來清洗至少 6 次 建議使用自動化的微量盤清洗器進行 徹底清洗對本測定的效能極為重要 需確保每個凹槽在各次清洗時, 能完全被清洗緩衝液充滿至頂 建議每次清洗間隔, 能保持至少有 5 秒鐘的浸泡期 放流貯水槽須添加標準實驗室消毒劑, 並建立有關去除潛在傳染物質污染之處理程序 11. 將微量盤面向下, 於吸收拭巾上輕敲, 以去除殘餘清洗滌緩衝液 然後在每個凹槽內加入 100 µl 酵素受質液, 並用微量盤振盪器充分混合 12. 以蓋子覆蓋微量盤, 並於室溫 (17~27 C) 培養 30 分鐘 培養時, 微量盤不可暴露於陽光下直射 13. 培養 30 分鐘後, 在每個凹槽內加入 50 µl 酵素停止液並混合 本步驟必須與步驟 11 酵素受質液的添加用相同順序且以近乎相同速度添加至各凹槽 14. 在停止反應後的 5 分鐘內, 使用裝有 450 nm 濾鏡及 620-650 nm 參考濾鏡的微量盤判讀儀, 來測量每個凹槽的光密度 (Optical Density, OD) 7. 計算及結果結果判讀 QFT 分析軟體是用來分析原始資料與計算結果, 可從網站 www.quantiferon.com 取得, 請確認所使用的軟體是最新版本 此軟體為品管分析, 能提供測定 產生標準品曲線 及各樣本的測定結果 請詳見結果判讀部分 除使用 QFT 分析軟體外, 結果亦可根據下列方法進行判讀 標準品曲線的產生 ( 若未使用 QFT 分析軟體 ) 計算每個微量盤中各濃度標準液所測得之平均 OD 值 以平均 OD 對數值為 y 軸, 標準液 IFN-γ 濃度 (IU/ml) 對數值為 x 軸, 作 log (e) -log (e) 圖 ( 此處省略零標準品之值 ) 藉回歸分析, 求出標準液之最佳回歸線 ( 標準品曲線 ) 利用此標準品曲線從每個樣本之 OD 值, 來推定每個血漿樣本的 IFN-γ 濃度 (IU/ml) 這些計算可使用微量盤判讀儀所附的軟體, 以及標準試算表或統計軟體 ( 如 :Microsoft Excel) 來完成 建議所使用的軟體必須能夠計算回歸分析 變異差係數 (%CV) 及相關係數 (r) 檢測之品管檢測結果的準確度取決於是否產生準確的標準品曲線 因此, 在判讀樣本結果前, 必須先檢驗由標準品所得的結果 為了讓 ELISA 測定可信 : 標準液 1 的平均 OD 值, 必須 0.600 標準液 1 及標準液 2 多組測定之 OD 值的 %CV, 必須 15% 標準液 3 及標準液 4 多組測定之 OD 值與其與其平均值平均值之差, 不可超過 0.040 光密度單位密度單位 由所有所有標準標準液之液之平均吸平均吸光值所計算計算而得的相關得的相關係數 (r), 必須 0.98 QFT 分析軟體可計算這些品管參數並提供報告 若測定未符合前述條件, 則該測定為無效且必須再重新執行 零標準品 ( 綠色稀釋劑 ) 的平均 OD 值, 必須 0.150 若平均 OD 值 > 0.150, 則必須必須檢查微量盤清洗查微量盤清洗步驟 8
結果判讀 QFT 檢測的結果是依下列條件來判讀 : 注意 : 當利用本測試測試去診斷或排除診斷或排除罹患結核病結核病及評估及評估是否有 LTBI 的可能性時, 須將流將流行病學 病史 醫學醫學 與診斷上的發與診斷上的發現等資訊一同列資訊一同列入考慮考慮 當只用 Nil + TB 管時 : Nil (IU/ml) 8.0 > 8.0 2 TB 抗原減去 Nil (IU/ml) < 0.35 0.35 和 < 25% Nil 值 0.35 和 25% Nil 值 任何 本測試結果陰性 1 陽性不確定 3 判讀不太可能感染結核菌很可能感染結核菌對 TB 抗原的反應結果無法判定 1 當不像有感染結核菌, 但初次結果呈陽性反應者, 該原始血漿樣本必須再重複進行本試驗 ( 同時測兩組 ) 若重複試驗中有任一組或兩組的結果仍為陽性, 則該測試者應被判讀有陽性反應 2 在臨床試驗中, 少於 0.25% 的測試者對 Nil 對照的 IFN-γ 反應會 > 8.0 IU/ml 3 可能原因請見 10. 技術資訊 所測得的 IFN-γ 濃度, 其幅度不會與感染階段或程度 免疫反應程度 或可能進展至開放性疾病有相互關係 圖 3: 判讀流程圖 只用 Nil + TB 管 9
當用 Nil + TB + Mitogen 管時 : Nil TB 抗原減去 Nil Mitogen 減去本測試 (IU/ml) (IU/ml) Nil (IU/ml) 1 判讀結果 < 0.35 0.5 陰性不太可能感染結核菌 0.35 和 < 25% Nil 值 0.5 2 8.0 0.35 和 25% Nil 值任何陽性很可能感染結核菌 < 0.35 < 0.5 3 對 TB 抗原的反應無法 0.35 和 < 25% Nil 值 < 0.5 不確定判定 > 8.0 4 任何任何 1 2 3 4 對 Mitogen 陽性對照抗原 ( 有時是 TB 抗原 ) 的反應結果, 可能會落在微量盤判讀儀的範圍之外, 這不會對檢測結果判讀造成影響 當不像有感染結核菌, 但初次結果呈陽性反應者, 該原始血漿樣本必須再重複進行本試驗 ( 同時測兩組 ) 若重複試驗中有任一組或兩組的結果仍為陽性, 則該測試者應被判讀有陽性反應 可能原因請見 10. 技術資訊 在臨床試驗中, 少於 0.25% 的測試者對 Nil 對照的 IFN-γ 反應會 > 8.0 IU/ml 所測得的 IFN-γ 濃度, 其幅度不會與感染階段或程度 免疫反應程度 或可能進展至開放性疾病有相互關係 圖 4: 判讀流程圖 用 Nil + TB + Mitogen 管 8. 限制本測試的結果, 必須結合各測試者的流行病史 目前病況及其他診斷評估 測試者的 Nil 值若高於 8 IU/ml 時, 將被視為 不確定 因為在此情況下, 對 TB 抗原的反應可能 25% Nil 值, 而使其落在本測試可測量範圍之外 不可靠或不確定的結果, 可能起因於以下幾點 : 未依本仿單描述的步驟來操作 1 0
血液中原生的 IFN-γ 濃度過高或出現異嗜性抗體 從抽血到開始於 37 C 中培養的時間超過 16 小時 9. 效能特性 臨床試驗由於尚未有明確的標準去評估 LTBI, 因此本測試的靈敏度及特異性幾乎難以評估 本測試的特異性是藉由評估低結核菌感染風險 ( 無已知風險因子 ) 群之偽陽性比例來估計 靈敏度則是藉由評估經痰液培養確認是開放性結核病之患者群來估計 特異性在美國的研究中, 有 866 位自願者接受 TST 測試時, 同時抽血進行本測試, 並以標準方式調查基本資料及結核病風險因子 其中 432 人無已知結核菌感染風險因子, 但完成本測試及 TST 者只有 391 人, 且沒有人接受過卡介苗接種 另一個特異性研究則在日本, 同樣利用本測試評估低風險者, 其中約有 90% 的人曾經接受卡介苗接種 兩個特異性的研究結果請見表 2 表 2: 特異性 低結核菌感染結核菌感染風險風險者 研究 卡介苗測試者本測試結果 本測試結果 本測試測試之 TST 結果為 TST* 之 接種率 總數 為不確定 為陽性 / 有效測試者數 特異性 (95% CI) 陽性 / 測試者數 特異性 (95% CI) 美國 99.2% 98.5% 0% 391 1 3 / 390 6 / 391 ( 未發表 ) (98-100) (97-99) 日本 15 ~90% 168 6 2 / 162 98.8% (95-100) 總計 559 7 / 559 99.1 % 5 / 552 (1.3 %) (98-100) * 以 10mm 為 TST 診斷標準 若用 15mm, 則 TST 之特異性為 99.1% 對開放性結核病的靈敏度本測試之靈敏度, 是藉由檢測美國 澳洲及日本之疑似的結核病患者 ( 後續經痰液培養確認有結核病 ) 來評估 由於尚未有明確的標準去評估 LTBI, 只好根據感染到該病的定義, 即微生物學培養發現結核分枝桿菌, 來作為合適的替代指標 而患者在抽血進行本測試前, 所接受的治療必須少於 8 天 表 3 摘要出三個地區陽性患者之研究 本測試對開放性結核病的整體靈敏度為 89% (157/177) 表 3: 靈敏度 開放性結核病患者研究本測試結果為陽性 / 有效測試者數 本測試之測試之靈敏度 (95% CI) 15 日本 TB 病患 86 / 92 93% (86-97%) 澳洲 24 / 27 89% (70-97%) 美國 47 / 58 81% (68-90%) 總計 157 / 177 89% (83-93%) LTBI 的診斷 許多已發表的研究證明本測試能於不同族群診斷出 LTBI 一些主要的研究結果請見表 4 1 1
表 4:QuantiFERON -TB Gold(QFT ) 於不同族群族群的 LTBI 研究 研究 測試者總者總數 印度健康照護者 (Pai et al 2005) 26 726 丹麥 HIV 患者 (Brock et al 2006) 5 590 住院病童 (Dogra et al 2006) 10 105 德國接觸者 (Diel et al 2006) 9 309 結果與發現 結核菌感染率極高 本測試陽性為 40%,TST 陽性 (10 mm) 為 41%, 兩者相當一致, 且皆未有卡介苗接種的影響 兩測試皆發現風險因子與年紀及進行健康照護的時間有關 本測試測得 HIV 陽性患者之整體 LTBI 盛行率為 4.6% (27/590) 陽性結果與結核病風險有關 有 2 位檢測為陽性的患者在 1 年內發展為開放性結核病 結果不確定者 (n=20,3.4%) 顯著與 CD4 數 < 100/µl 有關 於疑似感染或曾與結核病患接觸的兒童同時檢測本測試及 TST 本測試陽性為 10.5%,TST 陽性 (10 mm) 為 9.5% 兩者結果於全體有 95.2% 之一致性, 於未受卡介苗接種者則 100% 一致 測試者依接觸程度有 15 類 51% 有接種卡介苗,27% 於國外出生 TST 陽性 (5 mm) 於接種卡介苗者有 70%, 未接種者有 18% 同群以本測試檢測為陽性者則分別有 9% 及 11% 顯示本測試與結核病風險有關, 而 TST 只與卡介苗接種與否有關 有更多已發表的文獻探討 QFT 及其前代產品 ( 靈敏度稍低 ) 的效能差異 這些研究使用本測試去探討不同族群, 包括與開放性結核病患接觸者 9,11,19,25 兒童 6-10,25,28 HIV 陽性患者健康照護者 13,26,32 免疫抑制者 3,4,22,23,27,30,31 7,8,10,18, 以及疑似感染結核病者與低風險測試者 15 2,5,20 重複性與 TST 對後續本後續本測試的影響前述於美國之特異性研究, 有部分測試者於初次檢測之 4-5 週後, 再次進行本測試 有 260 人完成此兩次的檢測, 其結果一致性達 99.6% (259/260) 顯示前面的 TST 測試不會引發本測試產生陽性反應 10. 技術資訊技術資訊對於操作時可能發生的問題提供協助, 更多的技術資訊於網站 www.quantiferon.com 查詢不確定的結果不確定的結果並非常態, 可能與測試者的免疫狀況有關, 但也可能起因於一些技術因素 : 從抽血到開始於 37 C 中培養的時間超過 16 小時 未在建議的溫度範圍內 (17~27 C) 儲存血液 採血管未充分混合 ELISA 微量盤的清洗不完全 若疑似採血或處理血液樣本的技術有問題時, 須以新的血液樣本再重新開始本測試 若懷疑是不當的清洗或其他 ELISA 操作上的誤差時, 可將已刺激血漿樣本再重新進行 ELISA 檢測 除非 ELISA 檢測時有錯誤, 否則因過低 Mitogen 值或過高 Nil 值所造成的不確定結果, 並不會因再次檢測而有所改變 不確定的結果應該如實報告 醫師可選擇重新採血或以適當的步驟進行檢測 結塊的血的血漿樣本長時間儲存血漿樣本可能會導致血纖維蛋白結塊, 若有此情形可離心樣本來沉澱結塊以幫助 1 2
血漿的吸取 ELISA 疑難排除非特異特異的顏色顏色產生可能原因微量盤清洗不完全 ELISA 凹槽有交叉污染套組 / 任一成分過期 酵素受質液被污染在 QFT 管吸取血漿前, 有混合到血漿 解決方法每個凹槽至少要以 400 µl 清洗緩衝液清洗 6 次以上 視所使用的清洗器, 有可能需要清洗超過 6 次 每次清洗間隔, 應該至少要有 5 秒鐘的浸泡期 樣品的吸取及混合時要注意, 以降低風險 確保所使用的套組仍在有效期限內 確保所使用的已配製標準品及 100 倍濃縮軛合劑仍在配製日後 3 個月內 當出現藍色時, 應丟棄受質液 確保試劑儲存器的清潔 離心後, 吸取血漿前避免使用 pipet 重複吸放或其他方式混合血漿 ; 隨時注意勿碰觸到 QFT 管內膠體上方的物質 標準品的光學準品的光學密度密度過低 可能原因 解決方法 標準品稀釋錯誤 確保套組標準品之稀釋標準液皆依仿單描述正確地配製 取液錯誤 確保吸量管已校正, 並依循製造商的指示使用 培養溫度過低 ELISA 的培養應在室溫進行 (17-27 C) 培養時間太短 含軛合物 標準品和樣品的微量盤應培養 120 ± 5 分鐘 加入酵素 受質液後應培養 30 分鐘 微量盤判讀儀的濾鏡使 應以裝有 450 nm 濾鏡及 620-650 nm 參考濾鏡的判讀儀來讀取 用錯誤 試劑過冷 100 倍濃縮軛合劑以外的所有試劑, 均應於檢測前置於室溫約 1 小 時 套組 / 任一成分過期 確保所使用的套組仍在有效期限內 確保所使用的已配製標準品及 100 倍濃縮軛合劑仍在配製日後 3 個月內 背景值過高可能原因解決方法微量盤清洗不完全每個凹槽至少要以 400 µl 清洗緩衝液清洗 6 次以上 視所使用的清洗器, 有可能需要清洗超過 6 次 每次清洗間隔, 應該至少要有 5 秒鐘的浸泡期 培養溫度過高 ELISA 的培養應在室溫進行 (17-27 C) 套組 / 任一成分過期確保所使用的套組仍在有效期限內 確保所使用的已配製標準品及 100 倍濃縮軛合劑仍在配製日後 3 個月內 酵素受質液被污染當出現藍色時, 應丟棄受質液 確保試劑儲存器的清潔 非線性標準品標準品曲線及線及多組結果相組結果相異可能原因解決方法微量盤清洗不完全每個凹槽至少要以 400 µl 清洗緩衝液清洗 6 次以上 視所使用的清洗器, 有可能需要清洗超過 6 次 每次清洗間隔, 應該至少要有 5 秒鐘的浸泡期 標準品稀釋錯誤確保套組標準品之稀釋標準液皆依仿單描述正確地配製 混合不足在加入微量盤前, 試劑應藉由翻轉瓶身或溫和旋轉以達充分混合 1 3
不一致的取液技巧或準備檢測時出現干擾 應以連續的方式進行樣本或標準品的添加 開始進行檢測前, 所有試劑都應準備妥當 實驗操作步驟影片以及許多操作問題解決方式皆可於 Gnowee TM 查詢, 請直接於線上網址登錄 www.gnowee.net 產品資訊與技術指引皆免費提供, 請聯繫當地經銷商或參閱網站 www.quantiferon.com 11. 參考文獻所有 QFT 相關文獻皆放置於 QuantiFERON 資料庫 Gnowee, 可於網站 www.gnowee.net 查詢 1. Andersen, P., et al. Specific immune-based diagnosis of tuberculosis. Lancet 2000. 356; 1099-104. 2. Balcells, M.E., et al. A comparative study of two different methods for the detection of latent tuberculosis in HIV-positive individuals in Chile. Int J Infect Dis. 2008. 12; 645-52. 3. Bartalesi, F., et al. QuantiFERON-TB Gold and TST are both useful for latent TB screening in autoimmune diseases. Eur Respir J. 2009. 33; 586-93. 4. Bocchino, M., et al. Performance of two commercial blood IFN-gamma release assays for the detection of Mycobacterium tuberculosis infection in patient candidates for anti-tnf-alpha treatment. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2008. 27; 907-13. 5. Brock, I., et al. Latent tuberculosis in HIV positive, diagnosed by the M.tuberculosis specific interferon-gamma test. Respir Res. 2006.7; 56. 6. Chun, J.K., et al. The role of a whole blood interferon gamma assay for thedetection of latent tuberculosis infection in bacille Calmette-Guerin vaccinated children. Diagn Microbiol Infect Dis. 2008. 62; 389-94. 7. Connell, T.G., et al. A three-way comparison of tuberculin skin testing, QuantiFERON-TB Gold and T-SPOT.TB in children. PLoS ONE 2008. 3; e2624. 8. Detjen, A.K., et al. Interferon-gamma release assays improve the diagnosis of tuberculosis and nontuberculous mycobacterial disease in children in a country with a low incidence of tuberculosis. Clin Infect Dis. 2007. 45; 322-8. 9. Diel, R., et al. Comparative performance of tuberculin skin test, QuantiFERON-TB Gold In Tube assay, and T-Spot.TB test in contact investigations for tuberculosis. Chest. 2009. 135; 1010-8. 10.Diel, R., et al. Predictive value of a whole-blood IFN-γ assay for the development of active TB disease. Am J Respir Crit Care Med. 2008. 177; 1164-70. 11.Diel, R., et al. Tuberculosis contact investigation with a new, specific blood test in a low-incidence population containing a high proportion of BCG-vaccinated persons. Respir Res. 2006. 7; 77. 12.Dogra, S., et al. Comparison of a whole blood interferon-gamma assay with tuberculin skin testing for the detection of tuberculosis infection in hospitalized children in rural India. J Infect. 2007. 54; 267-76. 13. Drobniewski, F., et al. Rates of latent tuberculosis in health care staff in Russia. PLoS Med. 2007. 4; e55. 14.Gerogianni, I., et al. Whole-blood interferon-gamma assay for the diagnosis of tuberculosis infection in an unselected Greek population. Respirology. 2008. 13; 270-4. 15.Harada, N., et al. Comparison of the sensitivity and specificity of two whole blood interferon-gamma assays for M. tuberculosis infection. J Infect. 2008. 56; 348-53. 16.Higuchi, K., et al. Comparison of performance in two diagnostic methods for tuberculosis infection. Med Microbiol Immunol. 2009. 198; 33-7. 17.Kang, Y.A., et al. Discrepancy between the tuberculin skin test and the whole-blood interferon gamma assay for the diagnosis of latent tuberculosis infection in an intermediate tuberculosis-burden country. JAMA. 2005. 293; 2756-61. 1 4
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2. 將採血管以直立方式, 於 37 C ± 1 C 培養 16-24 小時 3. 培養結束後, 採血管以轉速 2000-3000 RCF(g) 離心 15 分鐘, 分隔血球細胞及血漿 4. 離心後, 避免用 pipet 重複吸放或其他方式混合血漿, 從每支採血管取得血漿以進行 IFN-γ 的定量 請隨時注意, 吸取檢體時勿攪動採血管內膠體上方的物質 第二階段 IFN-γ 之 ELISA 1. 平衡 ELISA 試劑 除 100 倍濃縮軛合劑外, 所有試劑在室溫下平衡溫度 (17-27 C) 至少 60 分鐘 2. 以蒸餾水或去離子水配製 8.0 IU/ml 套組標準品, 並接著配製 4 組稀釋標準液 3. 以蒸餾水或去離子配製凍晶乾燥之 100 倍濃縮軛合劑 4. 以綠色稀釋劑配製具工作強度之軛合液, 並於每個凹槽加入 50 µl 5. 於適當凹槽內加入 50 µl 血漿樣本與 50 µl 標準液, 並利用微量盤振盪器混合 6. 室溫下培養 120 ± 5 分鐘 7. 每個凹槽以 400 µl 清洗緩衝液清洗至少 6 次 1 6
8. 將 100 µl 酵素受質液加入凹槽中, 並利用微量盤振盪器混合 9. 室溫下培養 30 分鐘 10. 將 50 µl 酵素停止液加入凹槽中, 並利用微量盤振盪器混合 11. 以裝有 450 nm 濾鏡及 620-650 nm 參考濾鏡的微量盤判讀儀來讀取 12. 分析結果 14. 廠商資訊製造廠名 :QIAGEN 製造廠址 :19300 Germantown Rd, Germantown, MD USA 20874 藥商名稱 : 禾伸堂生技股份有限公司藥商地址 :114 台北市內湖路一段 88 號 4 樓 QFT-G IT / 2016 December / TW03 1 7