利用 Poroshell 0 色谱柱对胆固醇和固醇类相关化合物进行 LC/ELSD 和 LC/ MS/MS 分析 应用报告 生物制药 作者 Rongjie Fu 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司 Maureen Joseph 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司 引言 使用安捷伦 Poroshell 0 色谱柱和 LC/ELSD 和 LC/MS/MS 法对胆固醇及其代谢物, 以及其他几种植物甾醇进行了分离, 比较了 Poroshell 0 EC-C8 和 SB-C8 两种固定相对甾醇的分离效果 Poroshell 0 EC-C8 对这些甾醇具有更好的选择性和分离度 LC/MS/MS 成功分离了保留时间相近的化合物, 例如 7- 烯胆甾烷醇和胆固醇
引言 胆固醇及其代谢物, 以及许多植物甾醇, 包括胆甾烷醇和 β- 谷甾醇, 由于各种原因都引起了研究人员极大的兴趣 胆固醇在人体中起着非常重要的作用, 因为其在许多关键激素的合成中扮演着关键的角色 胆固醇的代谢物 ( 链甾醇和 7- 烯胆甾烷醇 ) 被认为是人体中胆固醇合成的指示剂, 而分析这些化合物对研究影响体内总胆固醇水平的化合物是非常有价值的 胆固醇以及相关化合物的分析可以由 GC 和 LC 实现 液相色谱方法的优势在于分析前无需衍生甾醇, 减少了样品处理时间, 简化了分析步骤 此外, 液相色谱柱更能承受 脏样品 胆固醇天然存在于脏样品中, 例如血浆 安捷伦 Poroshell 0 色谱柱可以用于此类分析, 因为其具有 UHPLC 的高效率和高通量, 并且粒径为.7 µm, 色谱柱背压相对较低 此外, 与亚 µm UHPLC 色谱柱常用的 0. µm 筛板相比,Poroshell 0 色谱柱带有的 µm 筛板更不容易堵塞, 使得 Poroshell 0 色谱柱成为脏样品分析中一款耐用的色谱柱 实验部分 本实验采用了安捷伦 00 Infinity 系列液相色谱系统, 包括二元泵 (GB) SL 型恒温柱温箱 (G6B) 高性能自动进样器 (G67D) 和安捷伦 LT-ELSD 或安捷伦 660A 三重四极杆检测器 使用的色谱柱为 : Agilent Poroshell 0 EC-C8,.0 00 mm,.7 µm (p/n 6997-0) Agilent Poroshell 0 EC-C8,.6 7 mm,.7 µm (p/n 69797-90) Agilent Poroshell 0 SB-C8,.6 7 mm,.7 µm (p/n 68797-90) LC 分析时对甾醇的检测可以由 MS UV 或 ELSD( 蒸发光散射检测器 ) 完成 根据分离需要的灵敏度选择检测器,LC/MS/MS 具有更高的灵敏度 分离方法开发时我们选择同时使用 ELSD 和 MS 结合安捷伦 660A 三重四极杆 LC/MS(APCI 正离子模式 ) 进行检测 [] 7- 烯胆甾烷醇和胆固醇是本次实验中最难分离的化合物, 原因有两个 : 这两个化合物分子量相同, 难以完全分离, 而且需要在 MS/MS 检测时完全分离 此外, 血浆样品中胆固醇的浓度比 7- 烯胆甾烷醇高得多 由于甾醇化合物为非极性化合物, 我们选择大气压化学电离 (APCI) 的正离子模式进行检测 这些化合物无需衍生化, 即可通过 APCI 获得良好的灵敏度
结果和讨论 总共有 个甾醇被分离检测出来, 色谱柱为 Poroshell 0 EC- C8 和 SB-C8 色谱柱, 检测器为 ELSD 如果忽略灵敏度的因素, ELSD 是一个出色的检测器, 尤其是当分析物缺乏发色基团从而使紫外检测器无法检测时,ELSD 是检测这些分析物的理想检测器 分离过程使用等度模式, 色谱柱温度控制在 0 C 以获得更好的分离度 图 中的色谱图显示, 相较于 Poroshell 0 SB-C8, Poroshell 0 EC-C8 有更好的分离度 值得注意的是难分离的化合物 (7- 烯胆甾烷醇和胆固醇 ) 在 Poroshell 0 EC-C8 上也被完全分开了, 而这种情况在 SB-C8 上却没有发生 完全封端的 EC-C8 对非极性甾醇的保留比未封端的 SB-C8 更强 这两种不同固定相的选择性略有不同, 却对分离有非常明显的影响 mv 70 60 0 0 0 0 0 0 Agilent Poroshell 0 EC-C8.6 7 mm.7 µm 0 6 8 0 6 7 8 峰号. 骨化二醇. 链甾醇. 维他命原 D. -Cholesten--one. 7- 烯胆甾烷醇 6. 胆固醇 7. 肾固醇 8. 菜油甾醇 9. 豆甾醇 0. 胆甾烷醇 9. 0 谷甾醇 mv Agilent Poroshell 0 SB-C8.6 7 mm.7 µm 70, 6 60 0 0 0 7 8, 9 0 0 0 0 0 6 8 0 图. 利用蒸发光散射检测器比较安捷伦 Poroshell 0 不同键合固定相对胆固醇和其他甾醇的分离效果 色谱条件 样品 : 进样 µl, 种甾醇溶于甲醇中 流动相 : 80% 乙腈 : 0% 甲醇 流速 :. ml/min 温度 : 0 C 检测器 : ELSD, 增益 =8, 过滤器 = s, 蒸发温度 60 C
实际血浆样品中胆固醇的浓度比甾醇高得多 血浆样品中胆固醇与 7- 烯胆甾烷醇的比率大约为 000 :, 因此, 从高浓度的胆固醇中分离 7- 烯胆甾烷醇是非常困难的 图 显示了 个甾醇的分离色谱图, 其中胆固醇 : 其他甾醇 =000 : 为了能够在 ELSD 上获得足够的灵敏度, 采用了以下两种措施 首先,ELSD 检测低浓度甾醇的浓度需要达到 0 ppb 其次, 我们选择了灵敏度更高的 内径.0 mm 的色谱柱 通过这两种措施增加低浓度甾醇的灵敏度, 从而降低了化合物的浓度, 而胆固醇的浓度仍然较高, 达 0 ppm 如此高浓度的胆固醇会使 Poroshell EC-C8 超载, 从而降低对 7- 烯胆甾烷醇的分离度 如果需要更高灵敏度,LC/MS/MS 是更好的选择 尽管如此, 7- 烯胆甾烷醇和胆固醇是同重化合物, 仍然需要一定的分离度才能检测 因此, 用相同的 Poroshell EC-C8,.0 0 mm,.7 µm 色谱柱进行分离, 配备 660A 三重四极杆 LC/MS 检测器 为了评价甾醇的分离, 胆固醇和 7- 烯胆甾烷醇的比例跟血浆样品中一样, 仍然是 000 : 不过, 混合液用甲醇稀释十倍, 以使胆固醇浓度为 ppm, 其他甾醇浓度为 ppb 对于三重四极杆, 小进样体积 ( µl) 已足够检测 mv 7 0 00 7 6 峰号. 骨化二醇. 链甾醇. 维他命原 D. -Cholesten--one. 7- 烯胆甾烷醇 6. 胆固醇 7. 肾固醇 8. 菜油甾醇 9. 豆甾醇 0. 胆甾烷醇. 谷甾醇 0 7 8 9 0 0 0 6 8 0 6 图. 利用蒸发光散射检测器检测 Agilent Poroshell 0 EC-C8, 00 mm,.7 µm 色谱柱对甾醇混合物 ( 胆固醇与其他甾醇浓度比例为 000 : ) 的分离效果 色谱条件 样品 : 进样体积 µl, 种甾醇溶于 IPA( 胆固醇 0 ppm, 其他甾醇 0.0 ppm) 流动相 : 80% 乙腈 : 0% 甲醇 流速 : 0.6 ml/min 温度 : 0 C 检测器 : ELSD, 增益 =0, 过滤器 = s, 蒸发温度 60 C
图 显示了即使胆固醇与 7- 烯胆甾烷醇的比率达 000 :, 采用 Poroshell 0 EC-C8 色谱柱仍然可以获得足够的分离度, 并且分离所有化合物的时间不到 分钟 因为是等度分离, 不需要 在色谱柱再平衡上花费时间 这是一种分离这 9 种甾醇的可行和高效的方法 0 峰号.. 骨化二醇. 链甾醇. -Cholesten--one 0.9. 7- 烯胆甾烷醇. 胆固醇 0.8 6. 菜油甾醇 0.7 7. 豆甾醇 8. 胆甾烷醇 0.6 9. 谷甾醇 0. 0. 0. 0. 0. 6 7 8 9.76 6 7 8 9 0 图. LC/MS/MS 检测 Agilent Poroshell 0 EC-C8, 00 mm,.7 µm 色谱柱对 9 种甾醇混合物 ( 胆固醇与其他甾醇浓度比例为 000 : ) 的分离效果 色谱条件 样品 : 进样体积 µl, 种甾醇溶于甲醇 ( 胆固醇 ppm, 其他甾醇 ppb) 流动相 : 80% 乙腈 : 0% 甲醇 流速 : 0.6 ml/min 温度 : 0 C 质谱离子源参数 干燥气温度 : C 雾化器 : 0 C 气体流速 : L/min 雾化器 : 60 psi 正离子毛细管 : 000 V 电晕针 : µa APCI 采集参数和跃迁 碰撞能量 保留时间 化合物名称 前体离子 子离子 裂解电压 (ev) (min) 骨化二醇 8...7 骨化二醇 8. 07..7 链甾醇 67. 6. 00 7 6. 链甾醇 67. 9 00 6. -Cholesten--one 8. 09. 8 0 9.0 -Cholesten--one 8. 97 8 9.0 7- 烯胆甾烷醇 69. 9. 9 9. 7- 烯胆甾烷醇 69. 8. 0 9. 胆固醇 69. 6. 66 0 9.87 胆固醇 69. 9. 66 8 9.87 菜油甾醇 8. 6. 6.6 菜油甾醇 8. 9 0.6 豆甾醇 9. 8. 8 7.9 豆甾醇 9. 8. 8 7.9 胆甾烷醇 7. 9 0.7 胆甾烷醇 7. 9 0 0.7 谷甾醇 97. 6 8.78 谷甾醇 97...78
小结 本文利用 Poroshell 0 EC-C8 色谱柱结合安捷伦 660A 三重四极杆 LC/MS 检测器 APCI 正离子检测模式高效地分离了胆固醇及其代谢物 即使胆固醇与 7- 烯胆甾烷醇 ( 人体胆固醇合成的指示剂 ) 的比率高达 000 :, 使用本色谱柱也能获得足够的分离度 由于这两种化合物具有相同的分子量, 需要足够的分离度才能对这两个分析物进行有效定量 显然,Poroshell 0 EC-C8 色谱柱出色地完成了任务 参考文献. N. Kornél, A. Jakab, F. Pollreisz, D. Bongiorno, L. Ceraulo, M. R. Averna, D. Noto, K. Vékey. Rapid Commun. Mass Sp. 0, (006). www.agilent.com/chem/cn 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供 展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任 本资料中的信息 说明和指标如有变更, 恕不另行通知 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司,0 0 年 月 0 日, 中国印刷 99-0CHCN