Code No. R010Q 研究用 PrimeSTAR HS DNA Polymerase 说明书 v201702da
目 录 内容 页码 制品说明 1 制品内容 1 保存 1 特点 1 PCR 反应液组成 4 PCR 反应条件 4 参数优化 4 扩增产物的电泳 克隆及测序 5 Troubeshooting 6 实验例 6 关联产品 6
制品说明 PrimeSTAR HS DNA Polymerase 是 Takara Bio 特别开发的兼具高保真性和高扩增效率的 PCR 用 DNA 聚合酶 因其具有非常强的 3 5 Exonuclease 活性而显示出很好的校正功能, 同时还具有优于 Taq DNA Polymerase 的高扩增效率 制品中添加了在常温状态下能够抑制 DNA Polymerase 活性及 3 5 Exonuclease 活性的抗体, 有效防止 PCR 反应前的引物错配和引物消化 此外, 因其还具有很强的 Priming 效率, 可以设定较短的退火时间, 从而缩短了反应时间 与最适反应 Buffer 配合使用, 可以实现对广泛靶序列的高保真性 高灵敏度 高特异性 高成功率的扩增, 对于 cdna 克隆等要求高保真的 PCR 反应发挥强大的威力 制品内容 (40 次量 50 μl 反应体系 ) PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5 U/μl) *1 5 PrimeSTAR Buffer(Mg 2+ plus) *2 dntp Mixture( 各 2.5 mm) 20 μl 400 μl 180 μl *1: 贮存溶液 50 mm Tris-HCl (ph8.2, 4 ) 100 mm NaCl 0.1 mm EDTA 1 mm DTT 0.1% Tween 20 0.1% Nonidet P-40 50% Glycerol 活性定义 用活性化的大马哈鱼精子 DNA 作为模板 / 引物, 在 74 30 分钟内, 摄入 10 nmol 的全核苷酸为酸性不溶物的活性定义为 1 个活性单位 (U) *2:Mg 2+ 浓度为 5 mm(5 ) 保存 : -20 特点 A. 保真性通过分析大量序列数据检验 PrimeSTAR HS 的突变频率 方法 以 Thermus thermophilus HB8 genomic DNA 为模板, 任选 8 个富含 CG 的区域 ( 各约 500 bp), 使用 PrimeSTAR HS 及其他几种不同高保真酶进行 PCR 扩增后, 将各自 PCR 产物克隆到合适的载体中, 并对每种序列挑取复数的克隆进行测序 结果 分析使用 PrimeSTAR HS 扩增的 DNA 片段序列,249,941 个数据中只有 12 个数据显示错配 其保真性比 Company A 的高保真酶高, 且为 Taq DNA Polymerase 的 10 倍 这种检测突变率的方法是实际 PCR 反应中非常适合获得保真度的方法 基于以上序列分析结果, 对于注重保真性的 PCR 扩增反应, 建议使用 PrimeSTAR HS -1-
Fidelity comparison with other enzymes 本公司比较结果 B. Priming 效率高, 退火时间短 PrimeSTAR HS DNA Polymerase 有很高的 Priming 效率 因此,5-15 sec. 的较短退火时间即可达到高特异性扩增 P53 (0.5 kb) M1 1 2 C. 扩增效率高 P53 (4 kb) M2 1 2 1:55 退火 5 sec. 2:55 退火 30 sec. M1:pHY Marker M2:λ-Hind III digest 模板 : 人基因组 DNA 100 ng 50 μl PCR 反应体系, 3 step PCR Method,30 cycles 1) 与 Company A 和 Company B 的高保真酶比较扩增效率 (Target: 人源 DCLRE1A 基因 [2 kb], E.coli [4 kb]) 根据操作方法 (50 μl PCR 反应体系 ) 配制反应液及设定 PCR 反应条件 以下结果表明,PrimeSTAR 比其他高保真酶的扩增效率更高 另外, 检测灵敏度也高一个数量级 PrimeSTAR HS Company A Company B M N 1 2 3 4 M N 1 2 3 4 M N 1 2 3 4 M <Target: 人 DCLRE1A 基因 [2 kb]> N:No Template 1: 人基因组 DNA 100 pg 2: 人基因组 DNA 1 ng 3: 人基因组 DNA 10 ng 4: 人基因组 DNA 100 ng M: λ-hind III digest PrimeSTAR HS Company A Company B M N 1 2 3 4 M N 1 2 3 4 M N 1 2 3 4 M <E.coli [4 kb]> N: No Template 1:JM109 基因组 DNA 1 pg 2:JM109 基因组 DNA 10 pg 3:JM109 基因组 DNA 100 pg 4:JM109 基因组 DNA 1 ng M: λ-hind III digest -2- 本公司比较结果
2) 以人基因组和 E. Coli 基因组 DNA 为模板扩增不同大小的 DNA 片段 模板 : 人基因组 DNA [50 ng/50 μl PCR 反应体系 ] PCR 仪器 :TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice PCR 反应条件 : 0.5-6 kb: 3 step PCR Method 7.5-8.5 kb: 2 step PCR Method 98 10 sec. 98 10 sec. 60 5 sec. 30 cycles 68 8 min. 72 1 min./kb M1 1 2 3 4 5 6 7 M2 30 cycles 1: 0.5 kb 2: 1 kb 3: 2 kb 4: 4 kb 5: 6 kb 6: 7.5 kb 7: 8.5 kb M1: phy Marker M2: λ-hind III digest 模板 :E.coli 基因组 DNA [100 pg/50 μl PCR 反应体系 ] PCR 仪器 :TaKaRa PCR Thermal Cycle Dice PCR 反应条件 : 3 step PCR Method 98 10 sec. 60 5 sec. 72 1 min./kb M 1 2 3 4 5 M 30 cycles 1: 2 kb 2: 4 kb 3: 6 kb 4: 8 kb 5: 10 kb M: λ-hind III digest D. 高耐热性 1)3 step PCR Method 30 cycles 后残留的酶活性约 80% (98 10 sec.; 55 15 sec.; 72 4 min.) 2)2 step PCR Method 30 cycles 后残留的酶活性约 85% (98 10 sec.; 68 4 min.) -3-
PCR 反应液组成 ( 共 50 μl) Volume 5 PrimeSTAR Buffer (Mg 2+ Plus) 10 μl 1-4- Final conc. dntp Mixture (2.5 mm each) 4 μl 200 μm each Primer 1 10-15 pmol 0.2-0.3 μm Primer 2 10-15 pmol 0.2-0.3 μm Template <200 ng PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μl) 0.5 μl 灭菌水 up to 50 μl * : 可在室温下配制 PCR 反应液 但是, 当配制反应液时, 请将各组份放于冰上 PCR 反应条件 1 3 Step 法 98 10 sec. 55 5 sec. 或 15 sec. 30 cycles 72 1 min./kb 2 2 Step 法 98 10 sec. 68 1 min./kb 30 cycles 1.25 units/50 μl Takara Bio 推荐使用 PrimeSTAR HS DNA Polymerase 时, 首先尝试 3 step PCR 反应 1) 变性条件 设定 98 5-10 sec. 另外, 设定较低的变性温度 (94 ) 时, 请设定变性时间为 10-15 sec. 2) 退火温度 首先尝试 55 ( 可能需要优化 ) 3) 退火时间 * 退火时间取决于引物的 Tm 值 使用以下公式计算 Tm 值 当 Tm 55 时, 设定为 5 sec. 当 Tm<55 时, 设定为 15 sec. * :Tm 值 ( )=2 (NA+NT)+4 (NC+NG)-5, 该公式适用于长度 25 mer 的引物 25 mer 以上长 重要 度的引物设定退火时间为 5 sec. 1. 由于本酶退火效率高, 退火时间只需设定 5 sec. 或 15 sec. 退火时间过长可能导致扩增产物电泳时 出现 Smear 现象 2. 当采用 3 step PCR 或 Tm 值 70 的引物产生电泳弥散的 PCR 产物时, 请尝试 2 step PCR 其他请 参考 参数优化 和 Troubleshooting 来调整 PCR 条件 参数优化 为了更好地发挥 PrimeSTAR HS 的性能 获得良好的 PCR 扩增结果, 需要设定最适反应参数 1) 酶量 一般 50 μl 反应体系推荐使用 1.25 units 根据扩增片段大小 模板纯度和加量, 酶量也要进行适当调整 2) 模板 DNA 使用量 模板 DNA 的推荐使用量 (50 μl 反应体系 ) 人基因组 DNA : 5-200 ng 大肠杆菌基因组 DNA : 100 pg - 100 ng cdna library : λ DNA : Plasmid DNA : 1-200 ng 10 pg - 10 ng 10 pg - 1 ng
使用过量模板 DNA 会导致酶活性降低 经亚硫酸氢钠处理后的含尿嘧啶 DNA 为模板时, 不能使用本制品 3) dntp 和 Mg 2+ 浓度因为 dntp 有螯合作用,dNTP 浓度过高会降低反应液中有效 Mg 2+ 浓度 在反应液中,5 PrimeSTAR Buffer 终浓度为 1 mm MgCl2 与 200 μm dntp 是最适合的比例, 因此, 不必调整 dntp 浓度 NOTE: 反应液中不能用 dutp 代替 dttp 使用 dutp 会大大降低酶活性 4) 引物和 PCR 条件建议使用专业引物设计软件, 如 OLIGO Primer Analysis Software (Molecular Biology Insights), 来获得合适的引物序列 引物设计准则 :a) 引物长度 : 对于一般 DNA 片段的扩增可用 20-25 mer 正确 PCR 条件参考 PCR 反应条件 b) 修饰碱基 : 使用 PrimeSTAR HS DNA Polymerase 时, 引物避免含有 inosine(i) c) 简并引物 : 简并引物可以与 PrimeSTAR HS DNA Polymerase 一同使用 5) 退火条件根据 PCR 反应条件 设定退火条件 当扩增产物收量低时, 按以下方法解决 : 琼脂糖凝胶上出现 Smear 条带和杂带时 a) 缩短退火时间 例如, 从 15 sec. 缩短至 5 sec. b) 如果退火时间已经是 5 sec., 则升高退火温度至 58-65 c) 尝试 2 step PCR 法 无目的扩增产物 a) 延长退火时间 例如, 从 5 增至 15 sec. b) 降低退火温度至 50-53 扩增产物的电泳 克隆及测序 1) 扩增产物的电泳 PrimeSTAR HS DNA Polymerase 的 PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳时, 建议使用 TAE Buffer NOTE: 使用 TBE Buffer 时, 电泳带会出现聚集在凝胶底部呈扩散的现象 2) 扩增产物末端 PrimeSTAR HS DNA Polymerase 的 PCR 扩增产物大部分为平滑末端 因此, 它们可直接克隆到平滑末端载体中 ( 必要时, 克隆前进行磷酸化反应 ), 建议使用 Mighty Cloning Reagent Set (Blunt End) (Code No. 6027) 克隆到 T 载体时, 需要在 PCR 产物的 3 末端附加 da 碱基 建议使用 Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR(Code No. 6019) 3) 限制性内切酶处理时限制性内切酶消化 PCR 产物前, 请使用 NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Code No. 740609.10/.50/.250) 或苯酚 / 氯仿抽提除去蛋白质 特别是使用 3 - 末端突出的限制酶时 ( 例如 Pst I 等 ), 由于 PrimeSTAR HS DNA Polymerase 具有 3 5 外切酶活性, 如果该活性残留, 在限制酶处理中会将 3 - 突出末端切掉 4) 直接测序由于本酶具有 3 5 外切酶活性, 直接测序前, 建议使用苯酚 / 氯仿抽提或使用 NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Code No. 740609.10/.50/.250) 等除去蛋白质 -5-
Troubleshooting 1) 问题 : 无扩增产物或扩增效率低解决 : a) 延伸时间 : 延伸时间 >1 min./kb b) 退火时间 : 设定为 15 sec. c) 退火温度 : 以 2 为梯度降低退火温度 另外, 选择 3 step PCR d) 模板 DNA 加量及纯度 : 使用适合的模板 DNA 加量 ; 使用高度纯化的模板 DNA e) 引物浓度 : 在 0.2-0.5 μm 范围内调整引物终浓度 2) 问题 : 琼脂糖凝胶电泳时出现杂带或 Smear 解决 : a) 退火时间 : 设定为 5 sec. b) 退火温度 : 以 2 为梯度升高退火温度 另外, 选择 2 step PCR c) 延伸时间 : 设定为 1 min./kb 避免延伸时间过长 d) 模板 DNA: 使用适合的模板 DNA 加量 ; 避免使用过量的模板 DNA e) 循环数 :25-30 cycles f) 酶量 : 在推荐范围内减少酶量 ;PrimeSTAR HS 加量最低为 0.625 units/50 μl g) 引物浓度 :0.2-0.3 μm (final conc.) 范围内选择最适浓度 实验例使用相同 PCR 条件扩增不同长度的人类基因组 DNA 结果表明,PrimeSTAR HS DNA Polymerase 可以在相同条件下有效地扩增 0.5-8.5 kb 长度不等的目的片段 PrimeSTAR HS 的高保真性和高效性使其成为从 cdna library 扩增 DNA 的理想选择 模板 : 人基因组 DNA 100 ng/50 μl PCR PCR 反应条件 : 98 10 sec. 30 cycles 68 8 min. M2 M1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M1 M2 1:DCLRE1A 4 kb 2:β-globin 8.5 kb 3:β-globin 6 kb 4:DCLRE1A 1 kb 5:p53 0.5 kb 6:p53 4 kb 7:β-globin 7.5 kb 8:DCLRE1A 8 kb 9:DCLRE1A 2 kb 10:p53 6 kb M1:pHY Marker M2:λ-Hind III digest 关联产品 PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Code No. R045A/B) PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(Code No. R050A/B) PrimeSTAR HS (Premix)(Code No. R040A) Mighty Cloning Reagent Set (Blunt End)(Code No. 6027) Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR (Code No. 6019) NucleoSpin Gel and PCR Clean-up(Code No. 740609.10/.50/.250) -6-
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