疫苗接种与疾病预防专题 doi:.799/j.issn.8-883.9.3. 新生儿百日咳致病株抗菌药物敏感性和抗原基因型研究 李丽君刘莹贾举袁林史伟孟庆红姚开虎 ( 国家儿童医学中心 / 首都医科大学附属北京儿童医院 / 北京市儿科研究所 / 儿科学国家重点学科 / 国家呼吸系统疾病临床医学研究中心 / 教育部儿科重大疾病研究重点实验室 / 儿童呼吸道感染性疾病研究北京市重点实验室, 北京 ) [ 摘要 ] 目的探讨新生儿百日咳抗菌药物的可选方案, 阐明致病株的抗原基因型 方法以 3 年 月至 8 年 7 月分离到的 32 株新生儿百日咳鲍特菌为研究对象 采用 E-test 法检测红霉素 磺胺甲基异噁唑 - 甲氧苄啶 (SMZ) 氨苄西林等共 8 种抗菌药物的最低抑菌浓度 (MIC); 扩增分离株 23S rrna 基因并测序, 检测红霉素耐药基因的突变位点, 分析菌株抗原相关的 7 个基因型 (ptxa ptxc ptxp prn fim2 fim3 和 tcfa) 结果 株 (/32,78%) 百日咳鲍特菌对红霉素 阿奇霉素 克拉霉素 克林霉素的 MIC 值均 >6 mg/l, 且 23S rrna 基因均有红霉素耐药 A7G 突变 所有菌株对 SMZ 的 MIC 值均.6 mg/l 氨苄西林 阿莫西林 阿莫西林 克拉维酸和头孢曲松的 MIC 值波动在.32~ mg/l 大环内酯类耐药菌株的抗原基因型均为 ptxa/ptxc/ptxp/prn/fim2-/fim3-/tcfa2 结论新生儿百日咳鲍特菌对大环内酯类抗菌药物耐药常见, 体外试验支持超说明书使用磺胺类抗菌药物是治疗大环内酯类耐药的新生儿百日咳的可靠方案 耐药菌流行更加强调了免疫预防的重要性 [,9,2(3):8-23] [ 关键词 ] 百日咳 ; 耐药性 ; 抗菌药物 ; 新生儿 Antimicrobial susceptibility and antigen genotypes of Bordetella pertussis strains isolated from neonates LI Li-Jun, LIU Ying, JIA Ju, YUAN Lin, SHI Wei, MENG Qing-Hong, YAO Kai-Hu. National Center for Children's Health/Beijing Children's Hospital, Capital Medical University/Beijing Pediatric Research Institute/National Key Discipline of Pediatrics (Capital Medical University)/National Clinical Research Center for Respiratory Diseases/ Key Laboratory of Major Diseases in Children, Ministry of Education/Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infection Diseases, Beijing, China (Yao K-H, Email: jiuhu26@sina.com) Abstract: Objective To investigate the alternative antimicrobial drugs for the treatment of neonatal pertussis and the antigen genotypes of Bordetella pertussis (B. pertussis) strains. Methods A total of 32 B. pertussis strains isolated from neonates between May 3 and July 8 were used in this study. E-test stripes were used to measure the minimal inhibitory concentration (MIC) of 8 antimicrobial drugs including erythromycin, sulfamethoxazole-trimethoprim (SMZ) and ampicillin. The 23S rrna gene of isolated strains was amplified and sequenced to identify the mutation site of erythromycin resistance gene, and the seven antigen genotypes of B. pertussis strains (ptxa, ptxc, ptxp, prn, fim2, fim3 and tcfa2) were analyzed. Results Of the 32 B. pertussis strains, (78%) were resistant to erythromycin, azithromycin, clarithromycin and clindamycin, with an MIC of >6 mg/l, and A7G mutation was observed in the 23S rrna gene. All strains had an MIC of.6 mg/l for SMZ. The MIC of ampicillin, amoxicillin, amoxicillinclavulanic acid and ceftriaxone ranged from.32 to mg/l. The strains resistant to macrolide antibiotics had an antigen genotype of ptxa/ptxc/ptxp/prn/fim2-/fim3-/tcfa2. Conclusions B. pertussis strains from neonates are often resistant to macrolides, and the in vitro test shows that off-label use of sulfonamides is a reliable regimen for the [ 收稿日期 ]9--;[ 接受日期 ]9-2- [ 基金项目 ] 国家自然科学基金 (876); 首都医科大学基础 - 临床科研合作项目 (7JL) [ 作者简介 ] 李丽君, 女, 硕士研究生 [ 通信作者 ] 姚开虎, 男, 研究员 Email:jiuhu26@sina.com 8
treatment of neonates with macrolide-resistant pertussis. The prevalence of drug-resistant strains further emphasizes the importance of immunoprophylaxis. [, 9, 2(3): 8-23] Key words: Pertussis; Drug resistance; Antimicrobial drug; Neonate 百日咳主要由百日咳鲍特菌感染引起 自 世纪 年代起百日咳疫苗已开始推广使用, 但至 今百日咳仍是威胁全球公共健康的重要疾病 [-2] 世纪 9 年代开始很多高疫苗接种率发达国家 ( 如 美国 澳大利亚等 ) 报道百日咳再现 百日咳再 现过程中, 发现百日咳感染群体主要是未接种或 未完成全程免疫的婴儿, 以及年长儿和成人, 后 者还常常是婴幼儿的重要感染源 有研究指出百 日咳鲍特菌对疫苗的适应性变化是百日咳再现的 原因之一 [3] 多个国家报道临床分离株出现与疫苗 株不同的抗原基因型, 如 ptxa ptxp3 prn2 等 [-6] 既往研究显示近几年国内临床分离的百日咳菌株 抗原基因型主要为 ptxa/ptxc/ptxp/prn/fim2-/ fim3-/tcfa2, 仅 ptxa 与疫苗株 (ptxa2) 不同, 且对大环内酯类抗菌药物耐药常见 [] 大环内酯类 抗菌药物一直是预防及治疗百日咳的首选药物 二线药物 磺胺不推荐新生儿等小婴儿使用 新生儿可选用的其他抗菌药物种类也有限, 且患 百日咳有致命风险 因此, 有必要及早探索有效 治疗新生儿百日咳的抗菌药物备选方案 资料与方法. 菌株来源 本研究 32 株百日咳鲍特菌均分离自 3 年 月至 8 年 7 月北京儿童医院新生儿科疑诊的 32 例百日咳患儿 患儿年龄范围为 7~3 d, 年龄中 位数为 d; 其中男 例, 女 2 例.2 菌株的分离培养及鉴定 采集鼻咽拭子后, 立即接种至百日咳鲍特菌 选择培养基, 置于 37 恒温箱孵育 3~ d, 每日观 察细菌生长情况 挑取圆形 光滑 隆起 带珠 光 不透明的可疑菌落, 使用百日咳鲍特菌 副 百日咳鲍特菌特异抗血清 ( 英国 Remel Europe 公 司 ) 观察玻片凝集反应, 前者阳性 后者阴性鉴 定为百日咳鲍特菌 分离纯化的菌株冻存在磁珠 式菌种保存管 ( 加拿大 PRO-LAB Microbank 公司 ) 中,-6 低温冰箱贮存.3 抗菌药物敏感性实验采用 E-test 纸条法检测临床分离株对红霉素 阿奇霉素 克拉霉素 克林霉素 磺胺甲基异噁唑 - 甲氧苄啶 (SMZ) 环丙沙星 左氧氟沙星 氨苄西林 阿莫西林 阿莫西林 - 克拉维酸 头孢曲松 亚胺培南 美罗培南 庆大霉素 妥布霉素 阿米卡星 四环素和利福平共 8 种抗菌药物的敏感性 细菌培养 96 h 后读取抗菌药物最低抑菌浓度 (MIC) 值 以金黄色葡萄球菌标准株 ATCC2923 作为质控菌株 ( 美国模式培养物集存库 ) 由于美国临床和实验室标准协会 (CLSI) 和欧盟药敏试验委员会 (EUCAST) 没有百日咳鲍特菌的抗菌药物敏感性判定标准, 药敏结果以 MIC MIC9 和 MIC 范围显示, 同时借用流感嗜血杆菌和大肠埃希菌的 CLSI 和 EUCAST 标准分析百日咳鲍特菌对抗菌药物的敏感性. 基因分型及 23S rrna 基因检测采用 DNA 提取试剂盒 ( 北京赛百盛基因技术有限公司 ) 提取百日咳鲍特菌 DNA, 实验步骤参照说明书革兰阴性菌提取方法 采用聚合酶链反应 (PCR) 扩增 ptxa ptxc ptxp prn fim2 fim3 和 tcfa 7 个毒力相关基因型, 采用 BLAST 软件比对扩增产物序列与相应分型标准序列, 判定致病株型别 同时 PCR 扩增红霉素耐药基因 (23S rrna), 并与标准序列 (Genbank 序列号 : X68323) 进行比对, 分析突变位点 PCR 扩增测 序引物参见文献 []. 统计学分析采用 SPSS 7. 和 WHONET.3 软件对数据进行统计学分析 计数资料以例数或率 (%) 表示 2 结果 2. 抗菌药物的敏感性 32 株新生儿百日咳致病株对 8 种抗菌药物的 MIC MIC9 和 MIC 范围见表, 红霉素 SMZ 左氧氟沙星 阿莫西林 庆大霉素和四环素的详细 MIC 值分布见图 大环内酯类抗菌药物 9
( 红霉素 阿奇霉素 ) 对 株 (/32,78%) 百日咳鲍特菌完全没有抑制作用, 其余 7 株 (2.9%) MIC 值很低 (.6 mg/l), 参考流感嗜血杆菌的标准可判定为敏感 SMZ 的最大 MIC 值为.6 mg/l 氨苄西林 阿莫西林 阿莫西林 克拉维酸和头孢曲松的 MIC 值相似,MIC9 波动在.~. mg/l,mic 最大值波动在.~ mg/l 参考流感嗜血杆菌 EUCAST 界值, 除头孢曲松外,32 例新生儿百日咳临床分离株对其他 β- 内酰胺类抗菌药物 ( 氨苄西林 阿莫西林及阿莫西林 - 克拉维酸 ) 均敏感 环丙沙星和左氧氟沙星的 MIC 值差别明显,MIC9 分别为 2 mg/l 和. mg/l 四环素和利福平对百日咳鲍特菌没有明显抑菌作用 三种氨基糖甙类抗菌药物中, 庆大霉素 妥布霉素的 MIC 值 (.~ mg/l) 比阿米卡星 (2~8 mg/l) 要低 根据大肠埃希菌 CLSI 和 EUCAST 的判定标准, 所有菌株对三种氨 基糖甙类抗菌药物均敏感 2.2 23S rrna 基因分析所有红霉素耐药分离株 (>6 mg/l) 检测到 23S rrna A7G 突变, 其余 MIC.6 mg/l 的 7 株菌没有检测到该突变 2.3 基因型 32 株百日咳鲍特菌的抗原基因型分布见表 2 全部分离株的 ptxa fim2 tcfa 型别均一致, 分别为 ptxa fim2- tcfa2 根据其他 种抗原的等位基因可分为 3 种抗原基因型, 其中主要基因型为 ptxa/ptxc/ptxp/prn/fim2-/fim3-/tcfa2, 占 78%(/32) ptxp3 型菌株共检出 7 株, 所有 ptxp3 型菌株均同时携带 ptxc2/prn2 基因, 株 ptxp3 菌株携带 fim3-3 基因 7 株 ptxp3 型菌株的红霉素 MIC 值均.6 mg/l, 所有 ptxp 型菌株的红霉素 MIC 值均 >6 mg/l, 提示不同 ptx P 型菌株对大环内酯类抗菌药物的耐药情况不同 表 32 株百日咳鲍特菌的抗菌药物敏感性检测结果 抗菌药物 MICs (mg/l) 参考流感嗜血杆菌界值的敏感率 (%) 参考大肠埃希菌界值的敏感率 (%) MIC MIC9 MIC 范围 CLSI EUCAST CLSI EUCAST 红霉素 >6 >6.32~>6-2.9 - - 阿奇霉素 >6 >6.6~>6 2.9 2.9 2.9 2.9 克拉霉素 >6 >6.~>6 2.9 2.9 - - 克林霉素 >6 >6.~>6 - - - - SMZ.32.6.2~.6 环丙沙星 2 ~2 7. 7. 左氧氟沙星...~2 96.9 96.9 氨苄西林...32~. 阿莫西林...~ - - 阿莫西林 - 克拉维酸...~. 头孢曲松...6~. 78. - 亚胺培南 32 32 2~32 3.8 3.3 3.3 3.3 美罗培南.6..~. 四环素 32 ~6 6.9.6 9. - 利福平 8 6 ~6 - - - 庆大霉素..~ - - 妥布霉素.~ - - 阿米卡星 8 2~8 - - 注 :[SMZ] 磺胺甲基异噁唑 - 甲氧苄啶 ;[MIC] 最低抑菌浓度 ;[CLSI] 美国临床和实验室标准协会 ;[EUCAST] 欧盟药敏试验委员会 2
.32.6. 8 32 红霉素 (mg/l) 28 6.2. SMZ(mg/L).8.6.32.6... 2 8 6 32 6 四环素 (mg/l).32.6... 2 庆大霉素 (mg/l) 左氧氟沙星 (mg/l) 阿莫西林 (mg/l)..32.6...32.6... 2 图 32 株百日咳鲍特菌对 6 种抗菌药物的 MIC 值分布 [SMZ] 磺胺甲基异噁唑 - 甲氧苄啶 表 2 32 株百日咳鲍特菌的抗原基因型与红霉素 MIC 值的分布 基因型 百日咳鲍特菌 [ 例 (%)] 红霉素 MIC (mg/l) ptxa/ptxc/ptxp/prn/fim2-/fim3-/tcfa2 (78) >6 ptxa/ptxc2/ptxp3/prn2/fim2-/fim3-/tcfa2 6(9).6 ptxa/ptxc2/ptxp3/prn2/fim2-/fim3-3/tcfa2 (3).6 3 讨论 本研究从新生儿中共分离出 32 株百日咳鲍特 菌, 虽然有限, 但其意义非常重要 这不 但确证当前存在新生儿百日咳病例, 而且, 因新 生儿生活方式特殊, 间接证明了成人百日咳的客 观存在 文献 [7] 显示, 成年人至婴幼儿的传播模 式是百日咳家庭聚集发病的主要传播模式 美国 2~6 年间, 每年死于百日咳者 6~ 例, 绝大多数都是未接种百日咳疫苗的小婴儿 [8] 我国近年也有新生儿百日咳死亡的病例报告 [9] 本 研究中确诊的 32 例百日咳患儿中, 死亡 例, 提 示对新生儿百日咳应高度重视 研究显示, 妊娠 后期母亲接种百日咳疫苗可为新生儿提供一定免 疫保护 [] 我国调查显示, 孕妇及新生儿百日咳 毒素抗体水平普遍很低, 免疫策略有待改进 [] 虽然 CLSI 和 EUCAST 没有百日咳鲍特菌对 抗菌药物敏感性的判定标准, 但不影响本研究中 大环内酯类抗菌药物耐药的判断, 所有耐药菌株 MIC 值均 >6 mg/l, 提示大环内酯类抗菌药物完全不能抑制这部分百日咳鲍特菌的生长 且所有大环内酯类耐药菌株均检测到 23S rrna 基因发生 A7G 耐药突变, 和国内外既往研究结果相同 [] 大环内酯类抗菌药物是治疗及预防百日咳的首选药物 [2], 耐药株的流行对此提出了挑战 本研究中,3%(/32) 的患儿在采集鼻咽拭子前已使用大环内酯类抗菌药物治疗, 其中 例患儿大环内酯类治疗已超过 7 d, 但仍可分离出百日咳鲍特菌, 提示大环内酯类可能不能有效清除患儿体内的耐药菌 SMZ 是治疗百日咳的二线药物 [2], 本研究中体外试验也显示其对百日咳鲍特菌仍具有较强抑菌作用, 但 SMZ 不推荐用于新生儿及小于 2 月龄婴儿, 因其易形成肾小管结晶, 还可能会增加胆红素脑病的危险性 但根据本研究体外试验结果, 对于大环内酯类耐药的百日咳鲍特菌感染, 应考虑超说明书使用 SMZ 治疗的问题, 根据已有推荐意见可以获得可靠的治疗效果 目前分离株大环 2
内酯类耐药已经相当多见, 应积极开展相关临床 研究进行评估使用 SMZ 的可行性 β- 内酰胺类抗菌药物并不是治疗百日咳的推 荐药物 既往认为 β- 内酰胺类抗菌药物用药后呼吸 道局部药物浓度较低, 可能不能有效清除细菌 [2] 实际上 世纪 8 年代曾有部分权威专家提出氨 苄西林可用于治疗百日咳 [3] Islur 等 [] 的研究显 示 36 例使用氨苄西林治疗的患儿疗效不如 3 例 红霉素治疗的患儿, 但氨苄西林治疗 8 d 后只有 8 例仍可分离培养出百日咳鲍特菌 Trollfors [] 的 研究显示口服阿莫西林 ( 每日 ~3 mg/kg) 治疗 ~7 d 后,3 例复查的患儿中仍有 例培养阳 性 这些研究证实 β- 内酰胺类抗菌药物的治疗效 果虽不如红霉素, 但确有清除细菌的作用,Simon 等 [6] 的研究显示氨苄西林 ( 每日 mg/kg) 口服 治疗 7 d 可达到满意效果 既往研究表明氨苄西林 的唾液浓度可达.2~.7 mg/l [7], 比本研究测得的 MIC 值要高, 提示其用于临床百日咳的治疗应可 取得一定的治疗效果 但是,β- 内酰胺类抗菌药 物用于治疗百日咳有几个问题亟待解决 第一,β- 内酰胺类抗菌药物用于治疗百日咳的剂量 参考流 感嗜血杆菌的 CLSI 和 EUCAST 标准, 百日咳鲍特 菌对阿莫西林 阿莫西林 - 克拉维酸 氨苄西林 和头孢曲松均敏感 但百日咳鲍特菌的 MIC 值比 既往报道的敏感流感嗜血杆菌的 MIC 值高, 如头 孢曲松抗流感嗜血杆菌的 MIC 及 MIC9 分别为.6 mg/l.7 mg/l, 而本研究中头孢曲松抗百 日咳鲍特菌的 MIC 及 MIC9 分别为. mg/l. mg/l, 较高的 MIC 值可能意味着临床使用剂 量需增大 第二,β- 内酰胺类抗菌药物的疗程并 不清楚, 需要开展研究 Hoppe 等 [3] 的研究表明 常规剂量治疗 7~ d 的效果较大环内酯类抗菌药 物差, 提示 β- 内酰胺类抗菌药物需要更长疗程 第三, 不同 β- 内酰胺类抗菌药物的治疗效果可能 存在差异 本研究中亚胺培南和美罗培南的 MIC 值分布及敏感率差异较大, 提示临床治疗效果可 能存在差异 有关使用氨基糖甙类 四环素类抗菌药物及 利福平治疗百日咳的研究很少 庆大霉素抗流感 嗜血杆菌的敏感和耐药界值分别为.2 mg/l 和.8 mg/l [8], 而本研究中庆大霉素抗百日咳鲍特 菌的 MIC 和 MIC9 分别为. mg/l mg/l, 数 值较高, 但根据大肠埃希菌 ( 新生儿呼吸道感染的常见致病菌 ) 的判定界值, 菌株对氨基糖甙类抗菌药物均敏感 这些药物是否可用于百日咳治疗尚需进一步研究 成人百日咳患者可选择喹诺酮类抗菌药物治疗 [2] 本研究结果显示根据流感嗜血杆菌的判定标准, 所有菌株对左氧氟沙星敏感, 可作为成人患者或密切接触者的可选药物, 及时阻断病原传播 需要注意的是, 本研究显示环丙沙星和左氧氟沙星的 MIC 值及敏感性分布明 显不同 Ohtsuka 等 [9] 在日本发现 6 株萘啶酸耐药 的百日咳菌株, 这几株菌对诺氟沙星 环丙沙星 司帕沙星 左氧氟沙星和加替沙星的敏感性下降, 需持续关注 除 ptxa 外, 大多数临床菌株的抗原基因型与我国疫苗株相同, 为 ptxc/ptxp/prn/fim2-/fim3- /tcfa2, 疫苗株为 ptxa2 型, 临床菌株为 ptxa 型, 与既往报告相符 [] 本研究共检出 7 株 ptxp3 型菌株 (22%), 所有的 ptxp3 型菌株对大环内酯类抗菌药物敏感, 而 ptxp 型菌株对大环内酯类抗菌药物耐药 这也解释了美国 欧洲和澳大利亚目前没有红霉素耐药株流行的原因, 与其流行菌株为 ptxp3 型有关 [-2] 本研究量较少, 也只是一家单位的数据 但是本研究确证我国当前有新生儿百日咳, 其感染来源分析可间接证明成人百日咳的客观存在, 需要引起临床重视 新生儿百日咳致病株对大环内酯类抗菌药物耐药常见, 抗菌药物选择面临挑战 本研究中将目前新生儿科可能用到的抗菌药物均进行了体外试验检测, 为进一步深入研究打下了基础 本研究体外试验支持超说明书使用磺胺类抗菌药物是治疗大环内酯类耐药的新生儿百日咳的可靠方案 另一方面, 应开展研究评估 β- 内酰胺类抗菌药物治疗新生儿百日咳的可行性 此外, 耐药菌流行更加强调了免疫预防的重要性, 应积极开展免疫策略研究, 保护婴儿免于感染百日咳 [ 参考文献 ] [] Yang Y, Yao K, Ma X, et al. Variation in Bordetella pertussis susceptibility to erythromycin and virulence-related genotype changes in China (97-)[J]. PLoS One,, (9): e389. 22
[2] World Health Organization. Pertussis vaccines: WHO position paper-august [J]. Wkly Epidemiol Rec,, 9(3): 33-6. [3] Warfel JM, Zimmerman LI, Merkel TJ. Acellular pertussis vaccines protect against disease but fail to prevent infection and transmission in a nonhuman primate model[j]. Proc Natl Acad Sci USA,, (2): 787-792. [] Kim SH, Lee J, Sung HY, et al. Recent trends of antigenic variation in Bordetella pertussis isolates in Korea[J]. J Korean Med Sci,, 29(3): 328-333. [] Mosiej E, Zawadka M, Krysztopa-Grzybowska K, et al. Sequence variation in virulence-related genes of Bordetella pertussis isolates from Poland in the period 99-3[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis,, 3(): 7-2. [6] Advani A, Gustafsson L, Ahrén C, et al. Appearance of Fim3 and ptxp3-bordetella pertussis strains, in two regions of Sweden with different vaccination programs[j]. Vaccine,, 29(8): 338-32. [7] Wiley KE, Zuo Y, Macartney KK, et al. Sources of pertussis infection in young infants: a review of key evidence informing targeting of the cocoon strategy[j]. Vaccine, 2, (): 68-6. [8] Centers for Disease Control and Prevention. Pertussis surveillance reports[db/ol]. (--2)[8-2-27]. https:// www.cdc.gov/pertussis/surv-reporting.html. [9] 郭丹, 李耿. 新生儿百日咳 [J]. 儿科学大查房,, (6): 26-27. [] Abu Raya B, Srugo I, Kessel A, et al. The effect of timing of maternal tetanus, diphtheria, and acellular pertussis (Tdap) immunization during pregnancy on newborn pertussis antibody levels - a prospective study[j]. Vaccine,, 32(): 787-793. [] Meng QH, Luo J, Yang F, et al. A general lack of IgG against pertussis toxin in Chinese pregnant women and newborns[j]. Pediatr Infect Dis J, 8, 37(9): 93-938. [2] Tiwari T, Murphy TV, Moran J, et al. Recommended antimicrobial agents for the treatment and postexposure prophylaxis of pertussis: CDC Guidelines[J]. MMWR Recomm Rep,, (RR-): -6. [3] Hoppe JE, Haug A. Treatment and prevention of pertussis by antimicrobial agents (Part II)[J]. Infection, 988, 6(3): 8-2. [] Islur J, Anglin CS, Middleton PJ. The whooping cough syndrome: a continuing pediatric problem[j]. Clin Pediatr (Phila), 97, (2): 7-76. [] Trollfors B. Effect of erythromycin and amoxycillin on Bordetella pertussis in the nasopharynx[j]. Infection, 978, 6(): 228-23. [6] Simon C, Bontemps M, Wiese K, et al. Ampicillin therapy of whooping cough[j]. Dtsch Med Wochenschr, 969, 9(7): 23-237. [7] Smith BR, LeFrock JL. Bronchial tree penetration of antibiotics[j]. Chest, 983, 83(6): 9-98. [8] Wang LM, Qiao XL, Ai L, et al. Isolation of antimicrobial resistant bacteria in upper respiratory tract infections of patients[j]. 3 Biotech, 6, 6(2): 66. [9] Ohtsuka M, Kikuchi K, Shimizu K, et al. Emergence of quinolone-resistant Bordetella pertussis in Japan[J]. Antimicrob Agents Chemother, 9, 3(7): 37-39. [] Clarke M, McIntyre PB, Blyth CC, et al. The relationship between Bordetella pertussis genotype and clinical severity in Australian children with pertussis[j]. J Infect, 6, 72(2): 7-78. [2] van Gent M, Heuvelman CJ, van der Heide HG, et al. Analysis of Bordetella pertussis clinical isolates circulating in European countries during the period 998-2[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis,, 3(): 82-83. ( 本文编辑 : 万静 ) 23