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PowerPrep TM Rapid DNA Library Kit for illumina Platform Protocol 目录 产品介绍... 3 试剂盒组分... 4 保存条件... 4 试剂盒中未提供的试剂耗材或主要设备... 4 操作注意事项... 5 操作步骤... 5 附 1: 扩增循环数选择... 8 附 2:24 种 Index 信息... 9 附 3: 适用于非完整短接头的 96 种 Index 信息... 9 附 4: 适用于完整短接头的 96 种 Index 信息... 10 附 5: 常见问题分析与解决方案... 12 更多技术问题请联系 :techsupport@rx-coshare.com.cn 订购邮箱 :sales@rx-coshare.com.cn 网址 :www.rx-coshare.com.cn 2

产品介绍 PowerPrep TM Rapid DNA Library Kit 是一款为 illumina 测序平台设计的 DNA 文库构建试剂盒 由于试剂盒连接步骤中可以兼容含有与 flowcell 芯片杂交的序列以及测序引物结合序列的接头, 因此试剂盒可用于构建 PCR-Free 文库, 构建较高质量基因组 DNA 的 PCR-Free 文库最低起始量为 100 ng 试剂盒也提供了文库 PCR 扩增引物和针对文库扩增优化的高保真聚合酶, 可适用于构建最低起始量为 10 ng 的 cfdna 样本文库 最低起始量为 100 ng 的 FFPE DNA 样本文库 最低起始量为 100 pg 的 ChIP DNA 文库 最低起始量为 10 ng 的较复杂基因组文库等 文库构建流程如下所示 : 片段化的 DNA 末端修复 0.5-1 h 接头连接 15 min 片段分选 ( 可选 ) 文库扩增 ( 可选 ) 更多技术问题请联系 :techsupport@rx-coshare.com.cn 订购邮箱 :sales@rx-coshare.com.cn 网址 :www.rx-coshare.com.cn 3

试剂盒组分 组分 货号 ( 规格 ) RL11106 (6x) RL11124 (24x) RL11196 (96x) 末端 Rapid EndPrep Buffer 70 μl 250 μl 1.2 ml 准备 Rapid EndPrep Enzymes 20 μl 75 μl 320 μl 接头 Rapid Ligation Buffer 105 μl 400 μl 850 μl x 2 连接 Rapid Ligase 20 μl 75 μl 320 μl 扩增 Hifi PCR Mix R3 150 μl 600 μl 1.2 ml x 2 配件 P5/P7 Primers 30 μl 120 μl 480 μl ( 可选 ) PCR Primer R1 15 μl 60 μl 240 μl Adapter R2 15 μl 60 μl 240 μl Low-EDTA TE 800 μl 5 ml 20 ml RA XP Beads 2 ml 8 ml 35 ml 保存条件 试剂盒组分除配件 RA XP Beads 和 Low-EDTA TE 在 2~8 环境中保存之外, 均在 -20 环境中长期保存, 在适当的环境中试剂盒组分保质期一年 试剂盒中未提供的试剂耗材或主要设备 连接步骤中如使用含有测序接头序列及 index 的完整接头组分 Adapter Stocks, 需单独采购 PowerPrep TM Adapter Stocks Index kit,24 种单端 Index 货号为 RC-321A/B,96 种单端 Index 货号为 RC-32A/B/C/D, 如使用非完整接头扩增引物组分 PCR Index (n), 需单独采购 PCR Index Oligos Kit,24 种单端 Index 货号为 RI0124A/B,96 种单端 Index 货号为 RI0396A/B; 磁力架 ; 可设程序的热循环仪 ; 涡旋震荡器 ; 小型离心机 ; 0.2 ml PCR 管和 1.5 ml 低吸附离心管 ; 带有滤芯的低吸附移液吸头及移液器 ; 无水乙醇 ; 无核酸酶水 更多技术问题请联系 :techsupport@rx-coshare.com.cn 订购邮箱 :sales@rx-coshare.com.cn 网址 :www.rx-coshare.com.cn 4

操作注意事项 1 操作前需将试剂盒组分 ( 除配件外均为 -20 保存 ) 从 -20 环境中放置冰水混合物中缓慢融化, 试剂盒组分达到 4 之前至少融化 10 min, 确保组分充分融化, 适当离心后进行移液操作 ; 2 为避免交叉污染, 推荐使用带滤芯的低吸附移液吸头, 操作不同样品时须更换吸头 ; 3 纯化步骤中使用的 80% 乙醇需现配现用 ; 4 纯化步骤中使用的磁珠除试剂盒配套供应的 RA XP Beads 以外, 测试过同等使用比例的其他商业化磁珠有 Beckman Coulter 公司的 AMPure XP 磁珠 美基生物 (Magen) 的 A4 XP 磁珠 诺唯赞生物 (Vazyme) 的 VAHTS DNA Clean Beads, 如使用其他商业化磁珠, 需要重新摸索磁珠的使用比例 ; 5 使用磁珠前需要平衡至室温, 并用涡旋震荡器充分混匀 ; 6 对分离纯化后的各类 DNA 样本推荐使用 Qubit 定量, 或其他类似原理的荧光法进行浓度测定 ; 7 对建库过程进行质控或者对文库浓度进行定量, 推荐使用基于 qpcr 的绝对定量方法 操作步骤 步骤 1: 末端修复 1) 按照下表将试剂与样本进行预混, 在冰上操作 : 片段化 DNA Rapid EndPrep Buffer Rapid EndPrep Enzymes Total volume 37 μl 10 μl 3 μl 50 μl 2) 使用移液器进行往复吸吹混匀, 如样品不足 37 ul, 可用 Low-EDTA TE 缓冲液补齐 3) 放置于 PCR 仪器上, 热盖温度 75 C, 反应程序如下 : 20 C 30 min* 65 C 30 min 4 C * 末端修复反应时间兼容 15 min 反应如需调整可咨询公司技术支持 techsupport@rx-coshare.com.cn 步骤 2: 接头连接 1) 用 Low-EDTA TE 缓冲液稀释接头浓度, 如下所示 : Input DNA Adapter dilution Adapter R2/Adapter Stocks 1 μg~ 50 ng No dilution 15 μm 49 ng ~ 25 ng 1.5-fold 10 μm 24 ng ~ 10 ng 2-fold 7.5 μm 9 ng ~ 5 ng 5-fold 3 μm <5 ng 10-fold 1.5 μm 更多技术问题请联系 :techsupport@rx-coshare.com.cn 订购邮箱 :sales@rx-coshare.com.cn 网址 :www.rx-coshare.com.cn 5

2) 按照下表进行预混, 在冰上操作 : 末端准备预混液 Rapid Ligation Buffer Adapter R2 Total volume 50 μl 16.5 μl 2.5 μl ~69 μl 3) 在上述预混液中加入 3 μl Rapid Ligase, 使用移液器进行往复吸吹混匀后立刻放置于 PCR 仪器上, 反应程序 :22 C 孵育 15 min, 热盖关闭, 反应后 4 C 放置 4) 加入 0.8x RA XP Beads (~57 μl), 使用移液器进行往复吸吹混匀 5) 室温放置 5 min 6) 放置于磁力架, 静置 2~5 min 7) 待上清澄清后, 丢弃上清液 ( 注意 : 千万不要损失磁珠, 磁珠不离开磁力架, 可残留 < 5 ul 液体 ) 8) 使用 200 μl 80% 乙醇洗涤磁珠, 孵育 20 s 后丢弃上清液 ( 此过程注意磁珠不要离开磁力架, 不要损失磁珠 ) 9) 重复步骤 8) 10) 室温空气干燥磁珠 ( 注意 : 干燥前可用离心机适当离心后移去残留乙醇液体, 不要干燥磁珠至干裂, 室温放置不要超过 5 min) 11) 使用 22 μl Low-EDTA TE 缓冲液重悬磁珠, 室温静置 1 min( 注意 : 此时磁珠需与磁力架分离 ) 12) 再次放置于磁力架上, 静置 2~5 min 13) 吸取上清 (~20 μl) 用于后续文库鉴定 ( 包括 PCR Free 文库 ) 或 PCR 扩增 如构建 PCR-Free 文库, 则使用以下连接步骤 : 1) 接头稀释方式和浓度参考上述非完整接头建库方案接头连接步骤 1) 中表格 ; 2) 按照下表进行预混, 在冰上操作 : 末端准备预混液 50 μl Rapid Ligation Buffer 16.5 μl Adapter Stock (AS_x) 2.5 μl Total volume ~69 μl 3) 在上述预混液中加入 3 μl Rapid Ligase, 使用移液器进行往复吸吹混匀后立刻放置于 PCR 仪器上, 反应程序 :22 C 孵育 15 min, 热盖关闭, 反应后 4 C 放置 4) 加入 0.8x RA XP Beads (~57 μl), 使用移液器进行往复吸吹混匀 5) 室温放置 5 min 6) 放置于磁力架, 静置 2~5 min 7) 待上清澄清后, 丢弃上清液 ( 注意 : 千万不要损失磁珠, 磁珠不离开磁力架, 可残留 < 5 ul 液体 ) 8) 使用 200 μl 80% 乙醇洗涤磁珠, 孵育 20 s 后丢弃上清液 ( 此过程注意磁珠不要离开磁力架, 不要损失磁珠 ) 9) 重复步骤 8) 10) 室温空气干燥磁珠 ( 注意 : 干燥前可用离心机适当离心后移去残留乙醇液体, 不要干燥磁珠至干裂, 室温放置不要超过 5 min) 11) 使用 22 μl Low-EDTA TE 缓冲液重悬磁珠, 室温静置 1 min( 注意 : 此时磁珠需与磁力架分离 ) 更多技术问题请联系 :techsupport@rx-coshare.com.cn 订购邮箱 :sales@rx-coshare.com.cn 网址 :www.rx-coshare.com.cn 6

12) 再次放置于磁力架上, 静置 2~5 min 13) 吸取上清 (~20 μl) 用于后续文库鉴定 ( 包括 PCR Free 文库 ) 或 PCR 扩增 步骤 3: 双轮分选 ( 可选, 如进行此步骤, 接在 步骤 2 中第 3) 步之后, 包括 PCR-Free 文库方案 ) 1) 按照下表选择不同长度文库每一步分选所用磁珠的体积 : 插入片段长度 (bp) 250~400 300~450 400~600 500~700 文库长度 (bp) 350~500 400~550 500~700 600~700 第一轮磁珠分选 0.35 0.30 0.25 0.20 第二轮磁珠分选 0.20 0.15 0.12 0.10 2) 将连接步骤中完成连接反应的体系 (~72 μl) 用 ddh 2O(~28 μl) 补齐至 100 μl 3) 按照双轮分选 1) 中表格第一轮磁珠分选比例加入对应体积的磁珠 (0.35 表示加入 0.35 100 μl=35 μl 体系的磁珠 ), 使用移液器进行往复吸吹混匀 4) 室温放置 5 min, 之后放置于磁力架, 静置 2~5 min 5) 小心吸取上清 ( 避免吸入磁珠 ) 并转移至另一新的干净的离心管中 6) 按照双轮分选 1) 中表格第二轮磁珠分选比例加入对应体积的磁珠 (0.20 表示加入 0.20 100 μl=20 μl 体系的磁珠 ), 使用移液器进行往复吸吹混匀后, 于室温静置 5 min 7) 放置于磁力架, 静置 2~5 min 8) 待上清澄清后, 丢弃上清液 ( 注意 : 千万不要损失磁珠, 磁珠不离开磁力架, 可残留 < 5 ul 液体 ) 9) 使用 200 μl 80% 乙醇洗涤磁珠, 孵育 20 s 后丢弃上清液 ( 此过程注意磁珠不要离开磁力架, 不要损失磁珠 ) 10) 重复步骤 9) 11) 室温空气干燥磁珠 ( 注意 : 干燥前可用离心机适当离心后移去残留乙醇液体, 不要干燥磁珠至干裂, 室温放置不要超过 5 min) 12) 使用 22 μl Low-EDTA TE 缓冲液重悬磁珠, 室温静置 1 min( 注意 : 此时磁珠需与磁力架分离 ) 13) 再次放置于磁力架上, 静置 2~5 min 14) 吸取上清 (~20 μl) 用于后续文库鉴定 ( 包括 PCR Free 文库 ) 或 PCR 扩增 步骤 4: PCR 扩增 1) 请按照下表配制 PCR 扩增体系 : 连上接头的 DNA 文库 2x Hifi PCR Mix R3 PCR Primer R1 PCR Index (n) Total volume 20 μl 25 μl 2.5 μl 2.5 μl 50 μl 如构建 PCR-Free 文库, 在建库后需要对文库进一步进行适当循环数的扩增, 扩增步骤 按照下表配制 PCR 扩增体系 : 更多技术问题请联系 :techsupport@rx-coshare.com.cn 订购邮箱 :sales@rx-coshare.com.cn 网址 :www.rx-coshare.com.cn 7

连上接头的 DNA 文库 2x Hifi PCR Mix R3 P5/P7 Primer Total volume 2) 使用移液器进行往复吸吹混匀 3) 参考以下程序进行 PCR 扩增 : 20 μl 25 μl 5 μl 50 μl 98 C 45 s 98 C 15 s 60 C 30 s 0-15 PCR cycles 72 C 30 s 72 C 1 min 12 C 4) 加入 1.0x RA XP Beads(~50 μl), 使用移液器进行往复吸吹混匀 5) 室温放置 5 min 6) 放置于磁力架, 静置 2~5 min 7) 待上清澄清后, 丢弃上清液 ( 注意 : 千万不要损失磁珠, 磁珠不离开磁力架, 可残留 < 5 ul 液体 ) 8) 使用 200 μl 80% 乙醇洗涤磁珠, 孵育 20 s 后丢弃上清液 ( 此过程注意磁珠不要离开磁力架, 不要损失磁珠 ) 9) 重复步骤 8) 10) 室温空气干燥磁珠 ( 注意 : 干燥前可用离心机适当离心后移去残留乙醇液体, 不要干燥磁珠至干裂, 室温放置不要超过 5 min) 11) 使用 22 μl Low-EDTA TE 缓冲液重悬磁珠, 室温静置 1 min( 注意 : 此时磁珠需与磁力架分离 ) 12) 再次放置于磁力架上, 静置 2~5 min 13) 吸取上清 (~20 μl) 用于后续文库鉴定 附 1: 扩增循环数选择 扩增循环数可参考下表选择, 当样本 DNA 质量较差 文库长度较长时选择较大循环数 : 建库前 DNA 起始量 获得 1μg 文库所需 PCR 循环数 1 ng 12-15 5 ng 11-13 10 ng 9-11 50 ng 7-9 100 ng 6-8 250 ng 4-6 500 ng 3-5 1 μg 2-3 更多技术问题请联系 :techsupport@rx-coshare.com.cn 订购邮箱 :sales@rx-coshare.com.cn 网址 :www.rx-coshare.com.cn 8

附 2:24 种 Index 信息 RC-321A/RI0124A Index 信息 RC-321B/RI0124B Index 信息 AS_1/PCR Index_1 ATCACG AS_13/PCR Index_13 AGTCAA AS_2/PCR Index_2 CGATGT AS_14/PCR Index_14 AGTTCC AS_3/PCR Index_3 TTAGGC AS_15/PCR Index_15 ATGTCA AS_4/PCR Index_4 TGACCA AS_16/PCR Index_16 CCGTCC AS_5/PCR Index_5 ACAGTG AS_18/PCR Index_18 GTCCGC AS_6/PCR Index_6 GCCAAT AS_19/PCR Index_19 GTGAAA AS_7/PCR Index_7 CAGATC AS_20/PCR Index_20 GTGGCC AS_8/PCR Index_8 ACTTGA AS_21/PCR Index_21 GTTTCG AS_9/PCR Index_9 GATCAG AS_22/PCR Index_22 CGTACG AS_10/PCR Index_10 TAGCTT AS_23/PCR Index_23 GAGTGG AS_11/PCR Index_11 GGCTAC AS_25/PCR Index_25 ACTGAT AS_12/PCR Index_12 CTTGTA AS_27/PCR Index_27 ATTCCT 附 3: 适用于非完整短接头扩增引物的 96 种 Index 信息 RI0396A Index RI0396A Index PCR index oligos 1 TTACCGAC PCR index oligos 25 TTCCAGGT PCR index oligos 2 AGTGACCT PCR index oligos 26 TCATCTCC PCR index oligos 3 TCGGATTC PCR index oligos 27 GAGAGTAC PCR index oligos 4 CAAGGTAC PCR index oligos 28 GTCGTTAC PCR index oligos 5 TCCTCATG PCR index oligos 29 GGAGGAAT PCR index oligos 6 GTCAGTCA PCR index oligos 30 AGGAACAC PCR index oligos 7 CGAATACG PCR index oligos 31 CAGTGCTT PCR index oligos 8 TCTAGGAG PCR index oligos 32 CTTGCTAG PCR index oligos 9 CGCAACTA PCR index oligos 33 TGGAAGCA PCR index oligos 10 CGTATCTC PCR index oligos 34 AGCTAAGC PCR index oligos 11 GTACACCT PCR index oligos 35 GAACGGTT PCR index oligos 12 CGGCATTA PCR index oligos 36 GGAATGTC PCR index oligos 13 TCGTCTGA PCR index oligos 37 TACGGTCT PCR index oligos 14 AGCCTATC PCR index oligos 38 CCAGTATC PCR index oligos 15 CTGTACCA PCR index oligos 39 TCTACGCA PCR index oligos 16 AGACCTTG PCR index oligos 40 GTAACCGA PCR index oligos 17 AGGATAGC PCR index oligos 41 GACGTCAT PCR index oligos 18 CCTTCCAT PCR index oligos 42 CTTACAGC PCR index oligos 19 GTCCTTGA PCR index oligos 43 TCCATTGC PCR index oligos 20 TGCGTAAC PCR index oligos 44 AGCGAGAT 更多技术问题请联系 :techsupport@rx-coshare.com.cn 订购邮箱 :sales@rx-coshare.com.cn 网址 :www.rx-coshare.com.cn 9

PCR index oligos 21 CACAGACT PCR index oligos 45 CAATAGCC PCR index oligos 22 TTACGTGC PCR index oligos 46 AAGACACC PCR index oligos 23 CCAAGGTT PCR index oligos 47 CCAGTTGA PCR index oligos 24 CACGCAAT PCR index oligos 48 TGGTGAAG RI0396B Index RI0396B Index PCR index oligos 49 AAGACCGT PCR index oligos 73 TAGGAGCT PCR index oligos 50 TTGCGAGA PCR index oligos 74 CGAATTGC PCR index oligos 51 GCAATTCC PCR index oligos 75 GTCCTAAG PCR index oligos 52 GAATCCGT PCR index oligos 76 CTTAGGAC PCR index oligos 53 CCGCTTAA PCR index oligos 77 TCCACGTT PCR index oligos 54 TACCTGCA PCR index oligos 78 CAACACAG PCR index oligos 55 GTCGATTG PCR index oligos 79 GCCTTAAC PCR index oligos 56 TATGGCAC PCR index oligos 80 GTAAGGTG PCR index oligos 57 CTCGAACA PCR index oligos 81 AGCTACCA PCR index oligos 58 CAACTCCA PCR index oligos 82 CTTCACTG PCR index oligos 59 GTCATCGT PCR index oligos 83 GGTTGAAC PCR index oligos 60 GGACATCA PCR index oligos 84 GATAGCCA PCR index oligos 61 CAGGTTCA PCR index oligos 85 TACTCCAG PCR index oligos 62 GAACGAAG PCR index oligos 86 GGAAGAGA PCR index oligos 63 CTCAGAAG PCR index oligos 87 GCGTTAGA PCR index oligos 64 CATGAGCA PCR index oligos 88 ATCTGACC PCR index oligos 65 GACGAACT PCR index oligos 89 AACCAGAG PCR index oligos 66 AGACGCTA PCR index oligos 90 GTACCACA PCR index oligos 67 ATAACGCC PCR index oligos 91 GGTATAGG PCR index oligos 68 GAATCACC PCR index oligos 92 CGAGAGAA PCR index oligos 69 GGCAAGTT PCR index oligos 93 CAGCATAC PCR index oligos 70 GATCTTGC PCR index oligos 94 CTCGACTT PCR index oligos 71 CAATGCGA PCR index oligos 95 CTTCGGTT PCR index oligos 72 GGTGTACA PCR index oligos 96 CCACAACA 附 4: 适用于完整长接头的 96 种 Index 信息 RC-32A Index RC-32A Index Adapter Stock 01 AACGTGAT Adapter Stock 13 AACAACCA Adapter Stock 02 AAACATCG Adapter Stock 14 AACCGAGA Adapter Stock 03 ATGCCTAA Adapter Stock 15 AACGCTTA Adapter Stock 04 AGTGGTCA Adapter Stock 16 AAGACGGA Adapter Stock 05 ACCACTGT Adapter Stock 17 AAGGTACA Adapter Stock 06 ACATTGGC Adapter Stock 18 ACACAGAA Adapter Stock 07 CAGATCTG Adapter Stock 19 ACAGCAGA Adapter Stock 08 CATCAAGT Adapter Stock 20 ACCTCCAA Adapter Stock 09 CGCTGATC Adapter Stock 21 ACGCTCGA 更多技术问题请联系 :techsupport@rx-coshare.com.cn 订购邮箱 :sales@rx-coshare.com.cn 网址 :www.rx-coshare.com.cn 10

Adapter Stock 10 ACAAGCTA Adapter Stock 22 ACGTATCA Adapter Stock 11 CTGTAGCC Adapter Stock 23 ACTATGCA Adapter Stock 12 AGTACAAG Adapter Stock 24 AGAGTCAA RC-32B Index RC-32B Index Adapter Stock 25 AGATCGCA Adapter Stock 37 CCGAAGTA Adapter Stock 26 AGCAGGAA Adapter Stock 38 CCGTGAGA Adapter Stock 27 AGTCACTA Adapter Stock 39 CCTCCTGA Adapter Stock 28 ATCCTGTA Adapter Stock 40 CGAACTTA Adapter Stock 29 ATTGAGGA Adapter Stock 41 CGACTGGA Adapter Stock 30 CAACCACA Adapter Stock 42 CGCATACA Adapter Stock 31 GACTAGTA Adapter Stock 43 CTCAATGA Adapter Stock 32 CAATGGAA Adapter Stock 44 CTGAGCCA Adapter Stock 33 CACTTCGA Adapter Stock 45 CTGGCATA Adapter Stock 34 CAGCGTTA Adapter Stock 46 GAATCTGA Adapter Stock 35 CATACCAA Adapter Stock 47 CAAGACTA Adapter Stock 36 CCAGTTCA Adapter Stock 48 GAGCTGAA RC-32C Index RC-32C Index Adapter Stock 49 GATAGACA Adapter Stock 61 TATCAGCA Adapter Stock 50 GCCACATA Adapter Stock 62 TCCGTCTA Adapter Stock 51 GCGAGTAA Adapter Stock 63 TCTTCACA Adapter Stock 52 GCTAACGA Adapter Stock 64 TGAAGAGA Adapter Stock 53 GCTCGGTA Adapter Stock 65 TGGAACAA Adapter Stock 54 GGAGAACA Adapter Stock 66 TGGCTTCA Adapter Stock 55 GGTGCGAA Adapter Stock 67 TGGTGGTA Adapter Stock 56 GTACGCAA Adapter Stock 68 TTCACGCA Adapter Stock 57 GTCGTAGA Adapter Stock 69 AACTCACC Adapter Stock 58 GTCTGTCA Adapter Stock 70 AAGAGATC Adapter Stock 59 GTGTTCTA Adapter Stock 71 AAGGACAC Adapter Stock 60 TAGGATGA Adapter Stock 72 AATCCGTC RC-32D Index RC-32D Index Adapter Stock 73 AATGTTGC Adapter Stock 85 CCATCCTC Adapter Stock 74 ACACGACC Adapter Stock 86 CCGACAAC Adapter Stock 75 ACAGATTC Adapter Stock 87 CCTAATCC Adapter Stock 76 AGATGTAC Adapter Stock 88 CCTCTATC Adapter Stock 77 AGCACCTC Adapter Stock 89 CGACACAC Adapter Stock 78 AGCCATGC Adapter Stock 90 CGGATTGC Adapter Stock 79 AGGCTAAC Adapter Stock 91 CTAAGGTC Adapter Stock 80 ATAGCGAC Adapter Stock 92 GAACAGGC Adapter Stock 81 ATCATTCC Adapter Stock 93 GACAGTGC Adapter Stock 82 ATTGGCTC Adapter Stock 94 GAGTTAGC Adapter Stock 83 CAAGGAGC Adapter Stock 95 GATGAATC Adapter Stock 84 CACCTTAC Adapter Stock 96 GCCAAGAC 更多技术问题请联系 :techsupport@rx-coshare.com.cn 订购邮箱 :sales@rx-coshare.com.cn 网址 :www.rx-coshare.com.cn 11

附 5: 常见问题分析与解决方案 2100 生物分析仪或 QSep100 分析仪 ( 下简称分析仪 ) 测得文库峰值与预期有偏移如果是 PCR-Free 文库在高灵敏度芯片上进行分析, 由于缺少 PCR 扩增步骤接头会有部分 Y 型游离结构, 计算插入片段大小时需要附加 300 bp, 例如 200 bp PCR-Free 文库插入片段的最大峰值在约 500 bp 峰值位置 如果是经过 PCR 扩增的文库, 是由于过度扩增导致非特异性退火, 利用体系中多余的 dntp 形成交叉非特异性退火产物, 这部分产物可以通过基于 qpcr 的文库定量试剂盒识别, 降低扩增循环数可以有效避免过度扩增 分析仪显示片段化后的 DNA 峰较宽或者向大分子量区域倾斜进行片段化的 DNA 不纯, 需要用柱法或磁珠法纯化后进行片段化, 如果是物理法打断, 需确认打断器械正常工作, 如果是酶法打断, 需要参考打断酶的说明书排查原因, 酶法打断在终止步骤中应避免体系中过量的金属离子螯合剂, 如条件不满足, 可将片段化产物纯化或分选后溶于 Low-EDTA TE 中 在纯化步骤中 80% 乙醇清洗后有磁珠积块不易被 Low-EDTA TE 洗脱磁珠过于干燥, 干燥过程中肉眼可见磁珠积块有光泽但无裂痕, 此时进行下一步操作, 如有积块较难洗脱, 需用移液器吸头吸入已洗脱液体反复吹打积块, 直至磁珠全部重悬 操作时有部分组分液体残留于移液吸头中不易完全打出试剂盒中部分组分 ( 尤其部分酶组分 ) 浓度较高, 加上保护液的影响液体较粘稠, 操作时建议使用低吸附移液吸头, 移液时反复吹打直至液体尽可能完全打出 更多技术问题请联系 :techsupport@rx-coshare.com.cn 订购邮箱 :sales@rx-coshare.com.cn 网址 :www.rx-coshare.com.cn 12