应用简报 食品检测 代谢组学 农药化学 环境 使用 LC/MS 检测通过亲水相互作用色谱 (HILIC) 对植物基质中的未衍生化氨基酸进行定量分析 作者 Yuxiong Huang Weiwei Li 和 Arturo Keller 美国加州大学圣塔芭芭拉分校 Tarun Anumol 和 Adam Bivens 安捷伦科技公司 摘要 本应用简报介绍了一种使用三重四极杆液质联用系统定量分析多种未衍生化氨基酸的方法 结果显示, 即使在存在大量植物基质 ( 黄瓜茎叶组织萃取物 ) 的情况下, 灵敏度 线性与回收率均十分出色 使用亲水相互作用色谱 (HILIC) 可分离强极性氨基酸 在 LC/MS 兼容条件下, 充分利用新一代 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z 固定相优异的分离度和峰形
前言 多种氨基酸以百万分之一 (ppm) 和十亿分之一 (ppb) 级的水平广泛存在于植物材料中 之前的研究中发现 1, 使用配备低 ph 与正离子模式质谱检测的亲水相互作用色谱 (HILIC) 模式分析未衍生化氨基酸, 能够获得出色的分离度与灵敏度 本应用简报对这些条件进一步优化, 以对植物中的氨基酸进行定量分析 试剂与化学品所有试剂均为 HPLC 级或更高等级 超 LC/MS 级乙腈购自 J.T. Baker (Center Valley, PA, U.S.A.) 水的净化处理由 EMD Millipore Milli-Q Integral 系统 (Darmstadt, Germany) 完成 试剂级甲酸 (FA, 部件号 G2453-85060) 来自安捷伦科技公司 甲酸铵和氨基酸标样购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) 氨基酸在使用前于 70 C 下储存 Agilent InfinityLab 接头 色谱柱前端 :Agilent InfinityLab Quick Connect 快速连接液相色谱接头 ( 部件号 5067-5965) 色谱柱末端 :Agilent InfinityLab Quick Turn 液相色谱接头 ( 部件号 5067-5966) 安捷伦样品瓶, 螺口盖, 棕色, 带书写签, 经认证,2 ml ( 部件号 5182-0716) 安捷伦固定螺口盖, 带 PTFE/ 红色硅胶隔垫 ( 部件号 5190-7024) Eppendorf 移液器和连续分液器 涡旋器和多管涡旋器 (VWR, Radnor, PA, USA) Agilent InfinityLab 溶剂瓶, 棕色,1000 ml( 部件号 9301-6526) Agilent InfinityLab Stay Safe 溶剂瓶安全盖,GL45,3 个插口,1 个放空阀 ( 部件号 5043-1219) 离心机 (VWR, Radnor, PA, USA) 超声仪 (VWR, Radnor, PA, USA) 仪器 Agilent 1260 Infinity 二元泵 (G1312B) Agilent 1260 Infinity 自动进样器 (G7129A) Agilent 1260 Infinity 柱温箱 (G1316A) Agilent 1290 Infinity 液相色谱系列超低扩散工具包 (5067-5189) Agilent MassHunter 工作站软件 Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统 安捷伦喷射流电喷雾离子源 样品前处理将氨基酸标准品与水混合至规定浓度, 无需进一步样品前处理即可直接分析 接下来, 将 15 N 富集的氘代内标 (ISTD) 加入到下列每个样品中, 至最终浓度为 1500 ng/ml: 异亮氨酸 - 15 N 1 甲硫氨酸 -d 8 丙氨酸-d 3 甘氨酸-d2 谷氨酸- 15 N 1 天冬氨酸-d 3 和赖氨酸 -d 8 新鲜采集黄瓜叶片并立即置于液氮中快速冷冻, 制备得到黄瓜茎叶组织萃取物 使用研钵和研杵将冷冻的黄瓜茎叶组织在液氮中均质研磨成细粉, 然后储存于 85 C 的冰箱中 仪器条件 色谱柱 HPLC 条件 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z,2.1 100 mm, 2.7 µm ( 部件号 685775-924) 流动相 A 20 mm 甲酸铵水溶液,pH = 3 流动相 B 流速 柱温 25 C 进样量 1 µl 总运行时间 梯度 20 mm 水相甲酸铵,pH = 3, 溶于乙腈 / 水 (9:1) 溶液 0.50 ml/min 15 分钟 时间 (min) %B 0 100 11.5 70 12 100 质谱条件 电离模式 ESI 正离子模式 干燥气温度 330 C 气体流速 雾化器 13.0 L/min 35 psi 鞘气温度 390 C 2 鞘气流速 毛细管电压 喷嘴电压 12 L/min 1500 V 0 V
称取 100 mg 冷冻的黄瓜叶片粉末到 2 ml Eppendorf 微量离 心管中, 加入 1 ml 0.5 M 盐酸水溶液进行萃取 将离心管以 8000 rpm 的转速涡旋混合 20 分钟, 在 25 C 水浴中超声 20 分钟, 然后在 20000 g 下离心 20 分钟 最后, 将 250 µl 萃取上清液转移到已加入 ISTD 的液相色谱样品瓶中, 然后用 80% 乙腈水溶液稀释至 1 ml 数据采集 索引 开始时间 (min) 扫描类型 离子模式 分流阀 Delta EMV 存储 加标回收率测试中, 将氨基酸混标与萃取上清液和 ISTD 同时加入液相色谱样品瓶中, 然后用 80% 乙腈水溶液稀释至 1 ml 稀释后, 氨基酸的总增量分别为 500 1000 和 2000 ng/ml 流动相配制用水配制 200 mm 甲酸铵储备液, 并用甲酸将 ph 调节至 3 将水与储备液按 9:1 稀释制得流动相 A( 水相 ), 将乙腈与储备液按 9:1 稀释制得流动相 B( 两流动相的最终离子强度均为 = 20 mm) 1 0 dmrm ESI + 安捷伦喷射流至废液 0 否 3 2.5 dmrm ESI + 安捷伦喷射流至质谱 200 是 质谱参数 化合物 保留时间 (min) 母离子 (m/z) 定量离子 (m/z) 碰撞能量 (V) 氨基酸 子离子定性离子 (m/z) 碰撞能量 (V) 碎裂电压 (V) 苯丙氨酸 2.95 166.1 120.1 13 103 29 80 亮氨酸 3.38 132.1 86.1 9 30.2 17 75 色氨酸 3.41 205.1 188.0 8 146 20 80 异亮氨酸 3.75 132.1 86.1 9 44.2 25 75 甲硫氨酸 4.22 150.1 104.0 9 56.1 17 75 缬氨酸 4.95 118.1 72.1 9 55.1 25 70 脯氨酸 4.96 116.1 70.1 17 43.2 37 75 酪氨酸 5.01 182.1 136.1 13 91.1 33 85 半胱氨酸 5.63 122.0 59.1 29 76 13 65 丙氨酸 6.61 90.1 44.2 9 45.3 40 40 苏氨酸 6.72 120.1 74.1 9 56.1 17 75 高丝氨酸 6.91 120.1 74.1 9 56.1 21 70 甘氨酸 7.00 76.0 30.3 12 NA NA 35 谷氨酰胺 7.23 147.1 84.1 17 130.1 9 80 丝氨酸 7.26 106.1 88.1 8 42.2 24 67 天冬酰胺 7.31 133.1 87.1 5 74 17 75 谷氨酸 7.68 148.1 84.1 17 130 5 75 瓜氨酸 7.89 176.1 159.1 9 70.1 25 80 天冬氨酸 8.38 134.0 88.1 9 74 13 70 组氨酸 9.06 156.1 110.1 13 83.1 29 90 精氨酸 9.54 175.1 70.1 24 60.1 12 100 赖氨酸 10.16 147.1 84.1 17 130.1 9 75 内标 异亮氨酸 - 15 N 1 3.75 133.1 87.1 8 NA NA 75 甲硫氨酸 -d 8 4.26 158.1 112.1 8 NA NA 75 丙氨酸 -d 3 6.61 93.1 47.2 12 NA NA 40 甘氨酸 -d 2 7.00 78.1 32.2 12 NA NA 40 谷氨酸 - 15 N 1 7.68 149.1 85.1 16 NA NA 75 天冬氨酸 -d 3 8.37 137.1 75.0 16 NA NA 60 赖氨酸 -d 8 10.16 155.2 92.1 20 NA NA 80 3
结果与讨论 色谱分析 Agilent InfinityLab Poroshell 120 2.7 µm HILIC-Z 柱具有出色的峰形结果与分离能力, 能够在 15 分钟内对氨基酸的复杂 混合物实现分离 ( 图 1 和图 2) 亮氨酸/ 异亮氨酸和苏氨酸 / 高丝氨酸两对同质异位素均实现了基线分离 ( 图 3) 响应 10 5 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 500 ng/ml 标准品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 12 14 10 11 13 15 17 18 16 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 采集时间 (min) 19 20 21 23 22 1. 苯丙氨酸 2. 亮氨酸 3. 色氨酸 4. 异亮氨酸 5. 甲硫氨酸 6. 缬氨酸 7. 脯氨酸 8. 酪氨酸 9. 半胱氨酸 10. 丙氨酸 11. 苏氨酸 12. 高丝氨酸 13. 甘氨酸 14. 谷氨酰胺 15. 丝氨酸 16. 天冬酰胺 17. 谷氨酸 18. 瓜氨酸 19. 天冬氨酸 20. 组氨酸 21. 精氨酸 22. 赖氨酸 23. 鸟氨酸 图 1. 浓度为 500 ng/ml 的氨基酸标准品 响应 (%) 15 500 ng/ml 标准品 10 2 14 1 3 4 5 6,7 9 10 13 17 18 19 20 21 22 23 1.00 8 1. 苯丙氨酸 12 16 0.95 2. 亮氨酸 0.90 3. 色氨酸 4. 异亮氨酸 0.85 5. 甲硫氨酸 0.80 6. 缬氨酸 0.75 7. 脯氨酸 0.70 0.65 0.60 0.55 2 8. 酪氨酸 9. 半胱氨酸 10. 丙氨酸 11. 苏氨酸 12. 高丝氨酸 0.50 11 13. 甘氨酸 0.45 14. 谷氨酰胺 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 15. 丝氨酸 16. 天冬酰胺 17. 谷氨酸 18. 瓜氨酸 19. 天冬氨酸 20. 组氨酸 0.15 21. 精氨酸 0.10 22. 赖氨酸 0.05 23. 鸟氨酸 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 采集时间 (min) 图 2. 图 1 中氨基酸标准品的峰高归一化结果 4
10 5 10 4 1.8 A 异亮氨酸 B 1.7 3.0 1.6 2.8 1.5 2.6 1.4 2.4 1.3 2.2 1.2 亮氨酸 2.0 1.1 1.0 1.8 0.9 1.6 响应 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 2.8 2.9 3.0 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 4.0 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 采集时间 (min) 图 3. 亮氨酸 / 异亮氨酸与苏氨酸 / 高丝氨酸的分离 响应 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 苏氨酸 高丝氨酸 5.8 6.0 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 7.0 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 采集时间 (min) 定量分析使用浓度为 50 10000 ng/ml 的七点校准曲线对每种氨基酸进行定量分析, 并与紧邻洗脱出的同位素标记内标物进行对比 ( 图 4) 响应和保留时间的相对标准偏差 (RSD) 显示出每次运行间优异的重现性 ( 表 2) 表 1. 校准结果与信噪比 (S/N) 化合物 内标 校准曲线 R 2 (50 10000 ng/ml) 50 ng/ml 时的 S/N 苯丙氨酸异亮氨酸 - 15 N 1 0.9999 281.2 亮氨酸异亮氨酸 - 15 N 1 0.9979 244.4 色氨酸异亮氨酸 - 15 N 1 0.9999 748.7 异亮氨酸异亮氨酸 - 15 N 1 0.9978 379.4 相对响应 相对响应 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 A 甲硫氨酸 y = 1.364178* x + 0.024666 R 2 = 0.99964255 0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 相对浓度 B 20 瓜氨酸 18 y = 5.897078* x + 0.114882 16 R 2 = 0.99968035 14 12 10 8 6 4 2 0 甲硫氨酸 甲硫氨酸 -d 8 0.9996 2315.6 缬氨酸 丙氨酸 -d 3 0.9981 349.2 脯氨酸 丙氨酸 -d 3 0.9983 861.3 酪氨酸 丙氨酸 -d 3 0.9987 161.4 半胱氨酸 丙氨酸 -d 3 0.9999 121.8 丙氨酸 丙氨酸 -d 3 0.9994 94.6 苏氨酸 丙氨酸 -d 3 0.9987 162.0 高丝氨酸 丙氨酸 -d 3 0.9969 336.6 甘氨酸 甘氨酸 -d 2 0.9999 10.8 谷氨酰胺 甘氨酸 -d 2 0.9993 30.8 丝氨酸 甘氨酸 -d 2 0.9957 3.4 天冬酰胺 甘氨酸 -d 2 0.9994 39.7 谷氨酸 谷氨酸 - 15 N 1 0.9978 53.9 瓜氨酸 天冬氨酸 -d 3 0.9997 106.5 天冬氨酸 天冬氨酸 -d 3 0.9999 32.1 组氨酸 天冬氨酸 -d 3 0.9961 35.6 精氨酸 天冬氨酸 -d 3 0.9972 184.6 赖氨酸 赖氨酸 -d 8 0.9992 37.2 0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 相对浓度 图 4. 甲硫氨酸与瓜氨酸的校准曲线示例 5
加标回收率测试用于验证基质存在时的稳定性 先对黄瓜茎叶组织样品进行分析, 然后向同一样品中加入 500 1000 和 2000 ng/ml 氨基酸标准品 不同浓度的回收率以浓度测量值与理论值的百分比表示 ( 表 3) 表 2. 黄瓜茎叶组织萃取物加标 2500 ng/ml 氨基酸的重现性 (n = 15) 表 3. 氨基酸混标加标的黄瓜茎叶组织萃取物的回收率测试结果 化合物 (2500 ng/ml) 响应 RSD (%) RT RSD (%) 氨基酸 预加标浓度 (ng/ml) 回收率 ( 加标浓度 500 ng/ml) 回收率 ( 加标浓度 1000 ng/ml) 回收率 ( 加标浓度 2000 ng/ml) 苯丙氨酸 0.99 0.35 亮氨酸 2.97 0.43 色氨酸 0.65 0.24 异亮氨酸 2.08 0.37 甲硫氨酸 0.96 0.35 缬氨酸 1.21 0.73 脯氨酸 1.04 0.58 酪氨酸 8.77 0.69 半胱氨酸 1.25 0.07 丙氨酸 3.76 0.00 苏氨酸 1.51 0.10 高丝氨酸 1.20 0.00 甘氨酸 1.82 0.06 谷氨酰胺 0.73 0.06 丝氨酸 1.08 0.08 天冬酰胺 1.38 0.00 谷氨酸 1.19 0.00 瓜氨酸 1.29 0.05 天冬氨酸 2.77 0.13 组氨酸 0.70 0.06 精氨酸 0.68 0.09 赖氨酸 1.02 0.06 鸟氨酸 0.63 0.08 苯丙氨酸 1078.36 102 103 102 亮氨酸 2216.61 119 117 114 色氨酸 1218.47 125 126 114 异亮氨酸 493.07 100 99 96 甲硫氨酸 223.24 77 81 77 缬氨酸 1445.24 105 111 93 脯氨酸 524.56 91 102 98 酪氨酸 704.05 101 105 93 半胱氨酸 336.61 94 109 115 丙氨酸 5046.64 70 70 89 苏氨酸 923.93 101 105 96 高丝氨酸 157.02 92 105 103 甘氨酸 293.78 101 92 90 谷氨酰胺 1861.98 139 120 124 丝氨酸 1794.39 110 100 93 天冬酰胺 1145.53 103 92 93 谷氨酸 7358.15 114 79 92 瓜氨酸 < MDL 87 86 85 天冬氨酸 6465.33 107 91 92 组氨酸 4130.88 118 103 127 精氨酸 1083.89 96 91 93 赖氨酸 2380.70 92 92 94 鸟氨酸 < MDL 108 138 160 MDL 方法检测浓度 6
结论 将 Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z 色谱柱的出色分离度和峰形性能与强大的 Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统结合, 实现植物组织中未衍生化氨基酸的痕量分析 结果表明, 该方法即使在基质中也具备可定量 可重现且稳定的优势 参考文献 1. A. Kennedy, A. Bivens. 使用液质联用系统分析未衍生化氨基酸的方法 安捷伦科技公司应用简报, 出版号 5991-8582ZHCN,2017 7
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