第 27 卷第 2 期 2017 年 3 月 江苏大学学报 ( 医学版 ) JournalofJiangsuUniversity(MedicineEdition) Vol.27 No.2 Mar.2017 小 GTP 酶 Rac1 对肺癌 A549 细胞凋亡和吞噬作用的影响 齐晨 1, 彭静静 1, 张淡宜 1,2, 苏兆亮 1,3, 王胜军 1,2 1, 许化溪 (1. 江苏大学医学院免疫学系, 江苏镇江 212013;2. 江苏大学附属人民医院医学检验科, 江苏镇江 212002;3. 江苏大学附属第四医院中心实验室, 江苏镇江 212001) [ 摘要 ] 目的 : 分析肺癌 A549 细胞 Rac1 的表达水平及其对细胞吞噬功能的影响 方法 : 采用姜黄素诱导 A549 细胞凋亡 ; 采用流式细胞术检测 Rac1 抑制剂对 A549 细胞凋亡的影响 ; 将 A549 细胞与同系凋亡细胞共培养, 应用荧光显微镜技术观察 Rac1 下调对 A549 细胞清除凋亡细胞能力的影响 用 qrt PCR 检测细胞 Rac1mRNA 表达水平 结果 : 流式双染和 Hoechst 染色荧光显微镜观察结果显示,Rac1 抑制剂能够明显增强姜黄素诱导的 A549 细胞凋亡, 凋亡细胞率相对于未加入 Rac1 抑制剂时显著上升, 且呈现与 Rac1 抑制剂的剂量依赖特性 此外,Rac1 抑制剂能明显下调 A549 细胞的吞噬能力 结论 :Rac1 可抑制肺癌 A549 细胞的凋亡, 增强其吞噬功能 [ 关键词 ] 肺癌 A549 细胞 ;Ras 相关 C3 肉毒素底物 1; 细胞凋亡 ; 细胞吞噬 [ 中图分类号 ] R392.12 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] 1671-7783(2017)02-0093-05 DOI:10.13312/j.isn.1671 7783.y170081 [ 引用格式 ] 齐晨, 彭静静, 张淡宜, 等. 小 GTP 酶 Rac1 对肺癌 A549 细胞凋亡和吞噬作用的影响 [J]. 江苏大学学报 ( 医学版 ),2017,27(2):93-97. SmalGTPaseRac1regulatesapoptosisandphagocytosisinA549celline QIChen 1,PENGJing jing 1,ZHANGDan yi 1,2,SUZhao liang 1,3,WANGSheng jun 1,2,XUHua xi 1 (1.DepartmentofImmunology,SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212013;2.DepartmentofLaboratoryMedi cine,theafiliatedpeople shospitalofjiangsuuniversity,zhenjiangjiangsu212002;3.thecentrallaboratory,thefourthafiliated HospitalofJiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212001,China) [Abstract] Objective:ToinvestigatetheRac1expresionlevel,andanalyzetheefectofRac1onthe clearanceofapoptoticcelsandregulationofphagocytosisina549celline.methods:a549celwasse lectedasthecelmodel.thecurcuminwasusedtoinduceapoptosis,andthea459celsandapoptotic celsco culturemethodwasusedforanalyzingtherelationshipbetweenthedown regulationofrac1func tionandtheabilityofapoptoticcelclearance.theqrt PCRwasusedtodetecttheexpresionlevelof Rac1mRNA.Flowcytometryandfluorescencemicroscopytechniqueswereusedtoobserveandanalyze theapoptoticcelsandphagocyticcapacity.results:flowcytometryandhoechststainingshowedthat theapoptoticrateofairwayepithelialcelswasincreasedinthepresenceofrac1inhibitor,andthisphe nomenonwasdosedependent.flowcytometryanalysisshowedthattherac1inhibitorcouldmarkedly down regulatethephagocyticabilityina549airwayepithelialcels.conclusion:theexpresionofrac1 playsanegativeroleintheregulationofa549celapoptosis,buthasasignificantlyefectonthephago cytosisofepithelialcels. [Keywords] A549celline;Ras relatedc3botulinumtoxinsubstrate1;apoptosis;phagocytosis 气道上皮细胞作为呼吸系统的屏障维持气道内免疫环境相对平衡的作用已经被广泛认可 [1] 近 [ 基金项目 ] 国家自然科学基金资助项目 (81671567); 江苏省重点研发计划项目 (BE2016716); 江苏省高校自然科学研究重大项目 (16KJA320005); 江苏省博士后基金资助项目 (1601002C) [ 作者简介 ] 齐晨 (1990 ), 男, 硕士研究生 ; 苏兆亮 ( 通讯作者 ), 副教授, 博士生导师,E mail:szl30@yeah.net; 许化溪 ( 通讯作者 ), 教授, 博士生导师,E mail:xuhx@ujs.edu.cn
94 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 27 卷 年来的研究显示, 气道上皮细胞可释放各种炎症介质和细胞因子参与气道变应性炎症反应 [2], 但气道上皮细胞的吞噬潜能及其机制目前还不清楚 Ras 相关 C3 肉毒素底物 1(Ras relatedc3botulinumtox insubstrate1,rac1) 是一种分布广泛的多功能小 GTP 酶, 在细胞周期调控 细胞骨架构建 细胞迁移和侵袭等多个方面均发挥着重要作用 [3-4] 此外, Rac1 在非专职吞噬作用中也扮演了重要的角色 [5-6] 本课题组之前的研究发现, 哮喘模型小鼠肺泡灌洗液中的上皮细胞 Rac1 表达水平明显下降 [7] 鉴于 Rac1 在吞噬和凋亡中的重要作用, 本研究观察了 Rac1 的表达水平对具有气道上皮细胞性质的肺癌 A549 细胞株凋亡和非专职吞噬能力的影响, 为进一步探讨 Rac1 表达对哮喘气道高反应性的影响提供实验基础 1 材料与方法 1.1 材料 DMEM 培养液 胎牛血清 ( 美国 Gibco 公司 ), AnnexinV FITC/PI 凋亡试剂盒 ( 美国 BioVision 公司 ),PI 染料 ( 上海美吉生物医药科技有限公司 ), SYBRPremixExTaq TM ( 日本 TaKaRa 公司 ),IL 33 与 Rac1 引物设计与合成 ( 上海生工生物工程公司 ),Hochest333258 染液 ( 上海吉玛制药技术有限公司 ),Rac1 抑制剂 NSC23766( 美国 SeleckChemi cals 公司 ) 肺癌 A549 细胞株 (ATCC 细胞库 ) 1.2 细胞培养采用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液, 将 A549 细胞培养于 37 5%CO 2 饱和湿度的培养箱 细胞处于对数生长期时用于后续实验 1.3 姜黄素诱导 A549 细胞凋亡的实验分组及干预措施将对数生长期 A549 细胞以每孔 1.5 10 5 接种于 24 孔板并混匀, 于 5%CO 2,37 恒温培养箱过夜 将细胞分为 3 组, 分别为空白对照组 DMSO 组 ( 阴性对照 ) 姜黄素组 待细胞生长密度达 50% ~ 70% 汇合度时, 姜黄素组加入姜黄素诱导细胞凋亡, 依照文献 [8] 中的最适浓度比例使姜黄素终浓度达到 50μmol/L,DMSO 组加入相同浓度的 DMSO 分别于 12,24 和 48h 收集细胞 采用流式仪检测各组细胞凋亡率或荧光显微镜观察细胞形态 因 48h 显示 A549 细胞明显凋亡, 以此作为后续诱导细胞凋亡的时间 此条件下收集的凋亡细胞用于后续的 A549 吞噬同系凋亡细胞实验 1.4 NSC23766 对 A549 细胞凋亡的影响取对数生长期的 A549 细胞, 以每孔 1.5 10 5 的细胞数接种于 24 孔板并混匀, 于 5%CO 2 37 恒温培养箱过夜 待细胞生长密度达到 40% ~50% 时, 将细胞分为 3 组 其中, 对照组加入等量培养液, 另外两组分别加入 50μmol/L 和 100μmol/L 的 NSC23766 24h 后更换培养液, 并在各组内同时加入 50μmol/L 姜黄素 再于 12h 和 24h 后, 收集细胞以凋亡试剂盒染色后进行流式细胞术检测 1.5 Hoechst 核染色取洁净盖玻片在 70% 乙醇中浸泡 5min,PBS 洗 3 次 将盖玻片置于孔板孔底部, 并接种 A549 细胞于孔板内过夜 48h 后吸尽培养液, 加入 Ho echst 固定液 0.5mL, 固定 10min 去除固定液后 PBS 洗 2 次 加入 Hoechst33258 染液 0.5mL, 孵育 5min 弃用染色液,PBS 洗 2 次, 加 1 滴封片剂 荧光显微镜检测细胞核, 设定激发波长 350nm 发射波长 460nm 1.6 流式细胞术检测凋亡细胞比例依 1.3 和 1.4 方法中设置的不同条件诱导细胞凋亡, 然后收集细胞 用 PBS 和 1 结合缓冲液分别洗细胞 1 次 离心弃上清液,100μL1 结合缓冲液重悬细胞, 加入 5μLAnnexinV 和 10μL PI, 避光室温孵育 10min 离心收集细胞,PBS 洗 2 次, 加入 300μL 结合缓冲液重悬细胞,4h 内采用流式细胞仪检测各组 A549 细胞的凋亡率 1.7 A549 吞噬同系凋亡细胞的实验分组及处理选取对数生长期 A549 细胞, 分为空白组和吞噬组 以每孔 4 10 5 个细胞接种于 6 孔细胞培养板, 置 5%CO 2 37 恒温培养箱过夜 将 1.3 中姜黄素诱导 48h 的凋亡细胞重悬后以 PI 染色 5min, PBS 洗 2 遍, 以 2 倍于正常 A549 细胞量加入到生长密度达 50% ~60% 吞噬组细胞中, 而空白组细胞正常培养而不做处理 两组细胞于 37 恒温共培养 90min 后分别进行流式细胞分析和荧光显微镜观察 以 PI 荧光信号强度作为 A549 细胞吞噬能力强弱的依据 实验重复 3 次 1.8 实时荧光定量 PCR 检测 A549 细胞 IL 33 和 Rac1mRNA 表达水平细胞分组和干预同 1.7, 以 Trizol 法提取两组细胞的总 RNA, 然后反转录为 cdna 依照 SYBR PremixExTaq TM 说明书操作, 将 SYBR PremixEx Taq TM Ⅱ 5μL,PCR 上下游引物各 0.25μL,cDNA1 μl, 高压灭菌蒸馏水 3.5μL 混合, 混合体系总体积
第 ２期 齐晨 等 小 ＧＴＰ酶 １对肺癌 Ａ５ ９细胞凋亡和吞噬作用的影响 ９５ 定容为 １０μＬ 置定量 ＰＣＲ仪 ９５ ５ｍｉ ｎ预变 析 选用独立样本 ｔ检验 Ｐ ０ ０ ５为差异有统计 性 ９５ １０ｓ变性 ０ｓ退火 ７２ １ｍｉ ｎ延伸 共 学意义 所有实验均重复 次以上 ΔΔＣｔ ８个循环 根据所测 Ｃｔ值计算各基因的 ２ 其 目的基因 Ｃｔ β 肌动蛋白 ΔΔＣｔ 中 ΔＣｔ Ｃｔ ２ 结果 吞噬组 ΔＣｔ 空白组 所有样本均重复测定 ΔＣｔ 次 引 物 序 列 Ｉ 上 游 ＴＣＣＣＡＡＣＡＧＡＡＧＡＣ １ 姜黄素对 Ａ５９细胞凋亡的诱导作用 ＣＡＡＡＧＡＡ 下 游 ＣＣＧＴＧＧＡＴＡＧＧＣＡＧＡＧＡＡＧＴ 产 细胞开始发生凋亡 ２ｈ后凋亡比例增加 但凋亡 物长度为 １ ６２ｂ ｐ １上游 ＧＴＡＡＡＡＣＣＴＧＣＣＴＧＣ 比例并没有趋于稳定 图略 而 ８ｈ后 Ａ５９细胞 ＣＴＧＣＴＣＡＴＣＡ 下游 ＧＧＡＣＧＣＡＡＴＣＴＧＴＣＡＴＡＡＴＣＴ 发生明显凋亡 且晚期凋亡率达到 ９０ 见图 １ ＴＣ 产物长度为 １６ｂｐ Ｈｏ ｔ核染色后 荧光显微镜下 姜黄素组的 Ｈｏ １ ９ ＮＳＣ２ ７ ６６对 Ａ５ ９细胞吞噬功能影响实验分 ｔ染色细胞出现核固缩 偏移和破碎等晚期凋亡 组和干预 形态学变化 见图 ２ 结果提示 姜黄素可有效诱 将细胞分为 Ａ５ ９对照组 Ａ５ ９ 凋亡细胞组 吞噬组 Ａ５ ９ 凋 亡 细 胞 抑 制 剂 组 抑 制 剂 组 吞噬实验依照 １ ７ 中的步骤进行 抑制剂 流式细胞术检测结果显示 加入姜黄素 １ ２ｈ后 导 Ａ５ ９细胞凋亡 ２ １抑制剂对 Ａ５９细胞凋亡的影响 流式细 胞 术 检 测 结 果 显 示 与 未 加 ＮＳＣ２７６ ６ 组 加 入 抑 制 剂 时 将 浓 度 为 １ ０ ０ μｍｏ Ｌ的 的对照组比较 加入 １抑制剂后 Ａ５ ９细胞凋亡 ＮＳＣ２７ ６６提前 ２ｈ加入孔内 ２ ｈ后弃培养液 比例上调 并且随着处理时间的延长 ２ ｈ后 更加 ＰＢＳ清洗 １遍 重新加入培养液后再加入处理后的 明显 １ ００μｍｏ Ｌ的 １抑制剂组的晚期凋亡细 Ａ５ ９凋亡细胞 此后将 组细胞进行流式分析 胞比例 高 于 ５ ０μｍｏ Ｌ组 见 图 该 结 果 提 示 １ １０ 统计学分析 １可抑制 Ａ５９细胞的凋亡 且这一作用具有时 应用 Ｇｒ ａ ｐ ｈｐａ ｄｐｒ ｉ ｓ ｍ软件进行相关统计学分 间和剂量依赖性 图 １ 姜黄素诱导 ８ｈ的 Ａ５ ９细胞凋亡率 图 ２ 姜黄素诱导 Ａ５ ９细胞凋亡 Ｈｏ ｔ核染色 Ａ５９具有吞噬凋亡细胞的能力 流式细 胞 术 分 析 显 示 与 凋 亡 细 胞 共 培 养 的 颗粒 提示 Ａ５ ９细胞具有吞噬同系凋亡细胞的能 力 见图 Ａ５ ９细胞内具有较强的荧光信号 平均荧光强度 ６ Ａ５ ９细胞吞噬凋亡细胞后 Ｉ 和 １ｍＲ 倍于空白组 ｔ ７ ２５８ Ｐ ０ ０１ 同时 荧光显微 ＮＡ表达水平 镜下可观察到 Ａ５ ９细胞内存在着大量的红色荧光 实时荧光定量 ＰＣＲ检测结果显示 吞噬凋亡细
江苏大学学报 医学版 ９６ 第２ ７卷 图 １抑制剂对 Ａ５ ９细胞凋亡的影响 图 Ａ５ ９细胞对凋亡细胞的吞噬作用 胞后的 Ａ５ ９细胞 Ｉ ｍｒｎａ表达明显上升 ｔ Ａ５ ９细胞荧光信号明显减弱 ｔ ８７６ Ｐ ０ ０５ ０ ５ 而 １ｍＲＮＡ的表达水平则变化 ９ ０ Ｐ ０ 接近空白对照组 荧光强度分析也显示类似结果 不明显 见图 ５ １抑 制 剂 ＮＳＣ２ ７６ ６可 抑 制 见图 ６ 结果 表 明 Ａ５ ９细胞吞噬凋亡细胞的能力 讨论 １对细胞增殖和凋亡的调控一直是研究的 热点 有文献报道 １参与了许多非专职细胞的 吞噬过程 ５ ６ 姜黄素经由线粒体途径影响细胞呼 吸链而诱导细胞凋亡 ９ 这与哮喘发病时气道上 皮细胞由于缺氧和气道高压而导致的细胞凋亡途径 一致 近年来 上皮细胞的吞噬作用正引起人们的 关注 已有研究报道 肾病综合征时肾上皮具有吞 噬 作 用 而 视 网 膜 色 素 上 皮 细 胞 也 有 类 似 的 作 用 １０ １２ 本研究中使用的 Ａ５９细胞 与其他上皮 图 ５ 吞噬凋亡细胞的 Ａ５ ９细胞 Ｉ 和 １ｍＲＮＡ表达水平 细胞一样均属非专职吞噬细胞 以整合素为受体 识 别一种被称作 ａ ｔｍ 的信号分子而传递吞噬信 ５ ＮＳＣ２ ７ ６６对 Ａ５ ９吞噬功能的影响 号 １ 近年来研究表明 气道上皮细胞能够分泌细 流式细胞术检测结果显示 与吞噬组比较 抑制 剂组 在 加 入 １０ ０μｍｏ ＬＮＳＣ２ ７６ ６处 理 ２ｈ后 胞因子或炎性介质 参与炎症应答 然而 气道上皮 细胞吞噬作用的机制和意义需要重新认识 尽管气
第 2 期 齐晨, 等. 小 GTP 酶 Rac1 对肺癌 A549 细胞凋亡和吞噬作用的影响 97 图 6 Rac1 抑制剂对 A549 细胞吞噬凋亡细胞的影响 道上皮细胞的吞噬能力远不如巨噬细胞等专职吞噬细胞, 但其作为原驻细胞对气道微环境中凋亡细胞和其他有害物质的清除作用值得关注 本研究应用 Rac1 抑制剂 NSC23766 首先分析了 Rac1 的表达水平对 A549 细胞凋亡的影响, 继而观察了 A549 细胞对同系凋亡细胞的吞噬能力, 并探讨 Rac1 在其中的调控作用 结果表明,Rac1 抑制剂能够明显增强姜黄素诱导的 A549 细胞凋亡, 且呈剂量依赖特性 ; 此外,Rac1 抑制剂还能明显影响 A549 细胞对凋亡细胞的吞噬能力, 提示 Rac1 的表达对上皮细胞凋亡起着负向调节作用, 而对上皮细胞的吞噬功能则有明显的促进效应 我们在观察 A549 对凋亡细胞的吞噬实验时还发现, 在 A549 吞噬凋亡细胞后,IL 33 的表达明显增加 IL 33 分子是重要的警报分子, 在哮喘时, 是调控二型固有免疫细胞 (ILC2) 分化和发育的关键分子, 而该细胞的调控在哮喘的发生发展中发挥着至关重要的作用 [14] 这种 Rac1 相关的气道上皮细胞吞噬功能和凋亡细胞发生率, 不仅与凋亡细胞的形成量有关, 而且关乎对凋亡细胞的清除能力, 其与气道高反应性可能存在着密切关系 [ 参考文献 ] [1] GaoW,LiL,WangY,etal.Bronchialepithelialcels: Thekeyefectorcelsinthepathogenesisofchronicob structivepulmonarydisease?[j].respirology,2015, 20(5):722-729. [2] HiemstraPS,MccrayPB,BalsR,etal.Theinnateim munefunctionofairwayepithelialcelsininflammatory lungdisease[j].eurrespirj,2015,45(4):1150-1162. [3] Rathinam R,BerierA,AlahariSK,etal.RoleofRho GTPasesandtheirregulatorsincancerprogresion[J]. FrontBiosci,2011,16(1):2561-2571. [4] PaiS,Kim C,WiliamsDA,etal.RacGTPasesinhu mandiseases[j].dismakers,2010,29(3):177-187. [5] FinnemannSC.Roleofαvβ5integrininregulatingphag ocytosisbytheretinalpigmentepithelium[j].advexp MedBiol,2003,533:337-342. [6] MLAlbertML,Kim JI,BirgeRB,etal.αvβ5integrin recruitsthecrki Dock180 rac1complexforphagocyto sisofapoptoticcels[j].natcelbiol,2000,2(12): 899-905. [7] XuYY,HuangL,ZhangMY,etal.DecreasedRac1ex presionleadstoupregulationofilc2 relatedcytokines andaggravationofairwayinflammationinalergicasthma mice[j].intjclinexppathol,2016,9(6):5902-5911. [8] 何秋霞, 侯海荣, 袁延强, 等. 姜黄素对肺腺癌 A549 细胞增殖与凋亡的影响 [J]. 中华中医药学刊,2010 (10):2130-2132. [9] 杨甫文, 黄金中, 林晓岚, 等. 姜黄素诱导鼻咽癌 NCE 细胞凋亡机制的研究 [J]. 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2006,41(8):612-616. [10] ParinotC,RieuQ,ChatagnonJ,etal.Large scalepuri ficationofporcineorbovinephotoreceptorouterseg mentsforphagocytosisasaysonretinalpigmentepitheli alcels[j].jvisexp,2014(94):e52100. [11] BhatSS,ParayAA,MushtaqU,etal.Actindepolymer izationmediated losofsnta1 phosphorylation and Rac1activityhasimplicationsonROSproduction,cel migrationandapoptosis[j].apoptosis,2016,21(6): 737-748. [12] ForsgrenA.Complementdependentphagocytosisinidio pathicnephroticsyndromeandinhealthycontrols[j]. Lakartidningen,1975,72(28/29):2876-2879. [13] PenberthyKK,RavichandranKS.Apoptoticcelrecog nitionreceptorsandscavengerreceptors[j].immunol Rev,2016,269(1):44-59. [14] BarlowJL,McKenzieAN.Nuocytes:expandingthein natecelrepertoireintype 2immunity[J].JLeukocBi ol,2011,90(5):867-874. [ 收稿日期 ] 2017-03-10 [ 编辑 ] 陈海林