中文摘要 氣喘是兒童主要的慢性病, 近年來治療的進步, 如吸入性類固醇 ( 目前主要 治療 ) 茶鹼 長效型 beta 2 -adrenergic agonist 白三烯素拮抗劑和抗 IgE 抗體 等以大幅減少了氣喘的死亡率和併發症, 但仍無法完全控制困難治療的氣喘病 患, 因此本實驗要探討其他的治

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1 國立宜蘭大學生物資源學院碩士在職專班專題討論報告 蜂膠主要成份咖啡酸苯乙酯對於人類樹突細胞的免疫調節功能及其機轉之探討 The Regulatory Effect and Mechanisim of Caffeic Acid Phenethyl Ester on Human Dendritic Cell 作者 : 林湘羚班級 : 生資碩專 5th 碩二學號 :P 指導教授簽名 : 陳怡伶 中華民國一 四年十月十七日

2 中文摘要 氣喘是兒童主要的慢性病, 近年來治療的進步, 如吸入性類固醇 ( 目前主要 治療 ) 茶鹼 長效型 beta 2 -adrenergic agonist 白三烯素拮抗劑和抗 IgE 抗體 等以大幅減少了氣喘的死亡率和併發症, 但仍無法完全控制困難治療的氣喘病 患, 因此本實驗要探討其他的治療方法和其機轉 蜂膠是一種古老的傳統草藥, 將蜂膠萃取物用於輕度至中度的氣喘病人做為輔助治療已被報告可以改善夜間 症狀及肺功能 雖然蜂膠的成分因不同地區的植物不同而有差異, 其中的一種獨 特成分 咖啡酸苯乙酯 [ caffeic acid phenethyl ester ( CAPE) ] 廣泛存在於大部分 蜂膠中, 且被報告有抗腫瘤 抗發炎 抗氧化和抗病毒的作用 由於樹突細胞及 Th2 細胞在氣喘的致病機轉中扮演著重要的角色, 因此此研究以咖啡酸苯乙酯 與來自健康人及過敏病人被刺激活化的樹突細胞及 T 細胞共同培養, 以探討咖 啡酸苯乙酯對於健康人及過敏病人的樹突細胞及 T 細胞的免疫功能影響 首先, 抽取人類週邊血分離出單細胞核中的 CD14 + 單核球, 再以 GM-CSF 及 IL-4 培養出樹突細胞 (monocyte-derived dendritic cells), 以此體外培養系統 來研究咖啡酸苯乙酯對於樹突細胞的影響 我們以咖啡酸苯乙酯與塵螨萃取物或 LPS 共同刺激樹突細胞, 以 ELISA 的方式檢測樹突細胞分密的數種激素 ; 結果 發現咖啡酸苯乙脂可以抑制來自於健康人被 LPS 刺激的樹突細胞所分泌的 IL-12 p40 IL-12 p70 及 IL-10, 及被塵螨萃取物刺激所分泌的 IL-12 p40 IL-10 及 IP-10 ; 在塵螨過敏的病人, 咖啡酸苯乙酯可以抑制被塵螨萃取物刺激 的樹突細胞所分泌的 IL-10 及 IP-10 接著我們以流式細胞儀分析樹突細胞的 表面分子及其吞噬 dextran-fitc 的量以了解樹突細胞的成熟狀態 ; 實驗發現咖 啡酸苯乙脂並不影響 MHC 分子及 costimulatory 分子在細胞表面的表現以及 樹突細胞的吞噬能力 我們將刺激處理過的樹突細胞與自體 naïve CD4 + T 細胞 共同培養, 結果 T 細胞產生的細胞激素及複製增生並不受影響, 換言之, 咖啡 酸苯乙酯並不影響樹突細胞呈現抗原給 T 細胞的抗原呈現能力 為了近一步了 解咖啡酸苯乙酯抑制細胞激素的機轉, 實驗中使用 LPS 刺激樹突細胞並萃取其 細胞蛋白質以西方墨點法來測定其訊息傳遞路徑的改變 ; 實驗發現咖啡酸苯乙酯 會抑制被 LPS 刺激的樹突細胞所產生的 IκB α 磷酸化及 NF-κB 活化, 但不影 響 MAPK 家族的磷酸化 因此, 咖啡酸苯乙酯可以藉由抑制 NF-κB 的訊息傳 導路徑來抑制樹突細胞分密細胞激素的能力, 且對於 Th2 細胞激素 (IL-10) 的 抑制比率比 Th1 細胞激素 (IL-2) 的抑制比率高 關鍵字 : 咖啡酸苯乙酯 細胞激素 樹突細胞 NF-κB T 細胞 訊息傳導 Abstract Asthma is the leading chornic disease in children. The mortality and morbidity of asthma has been decreased recently due to the advence of management of asthma. The treatment of asthma includes inhaled corticosteroid ( the main drug), theophlline, lone-acting bata 2 -agonoist, lekotriene antagonist and anti-ige, etc. However, some

3 severe difficult to treat patients still not achieve controlled under these treatments. We therefore intend to evaluate other potential treatments and their mechanism. Propolis, an ancient herbal medicine, has been reported the beneficial effect both in asthma patients and murine model of asthma, but the mechanism was not clearly understood. Caffeic acid phenethyl ester (CAPE), a unique active component in propolis, is known to have anti-tumor, anti-inflammatory and antioxident properyies. Since Th2 cells and dendritic cells play important roles in the pathogenesis of asthma, we use CAPE to treat CD4 + T cells and monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) from healthy subjects and allergic patients to evaluate the effects of CAPE on thefunctions of human MoDCs and primary human CD + 4 T cells in vitro. First, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from non-atopic healthy subjects and mite-sensitized allergic patients. The CD14 + monocytes were isolated by automacs and cultured with GM-CSF and IL-4 to become MoDCs. We check the cytokine levels of stimulated MoDCs by ELISA. We found that CAPE significantly inhibited IL-12 p40, IL-12 p70, IL-10 protein expression in mature healthy human MoDCs stimulated by crude mite extract. CAPE significantly inhibited IL-10 and IP-10 but not IL-12 expression in allergic patient MoDCs stimulated by crude mite extract. Further, we evaluated the surface makers and dextran-fitc by flow cytometry. We found that the upregulation of constinulatory molecules and phagocytosis alibity an mature MoDCs was not altered by CAPE. Therefor, the antigen presenting ability of MoDCs was not inhibited by CAPE by evaluating the cytokine levels and lymphoproliferation of the co-cultured autologous naïve CD4 + T cells. To study the mechanisim of the inhibitory effect of CAPE, we extract the protein from LPS-simulated MoDCs and check the signaling transduction by Western blot. CAPE inhibited IκBα phosphorylation and unclear factor (NF)-κB activation but not mitogen-activated protein kinase (MAPK) family phosphorylation in human MoDCs. Together, CAPE inhibited the cytokine production of MoDCs by the inhibition of NF-κB activation and the inhibition rate of Th2 cytokine (IL-10) was higher than that of Th1 cytokine (IL-12). Keyworlds:caffeic acid phenethyl ester, cytokine, dendritic cells, NF-κB, T cells, signal transduction. References * 王麗潔 (2010) 蜂膠主成份咖啡酸苯乙酯對於人類樹突細胞及 T 細胞的免疫 調節功能極其機轉之探討 原淑莉 (2013) B 細胞轉錄激活因子對急性哮小鼠氣道炎症的調整控制 Bardin, P., et al. (2015). Roflumilast for asthma: Efficacy findings in mechanism of action studies. Pulm Pharmacol Ther. Eisenbarth, S. C., et al. (2003). The master regulators of allergic inflammation:

4 dendritic cells in Th2 sensitization. Curr Opin Immunol 15(6): Froidure, A., et al. (2015). Dendritic cells revisited in human allergic rhinitis and asthma. Allergy. Holt, P. G. (2015). The mechanism or mechanisms driving atopic asthma initiation: The infant respiratory microbiome moves to center stage. J Allergy Clin Immunol 136(1): Yong, S. B., et al. (2013). Influence and mechanisms of maternal and infant diets on the development of childhood asthma. Pediatr Neonatol 54(1): 5-11.

5 第一部分 : 簡介氣喘病 第一章 緒論 氣喘是一種慢性的氣道發炎反應, 其中有多種細胞扮演著重要角色, 他會導致氣道的過度敏感, 因而造成病人會有反覆性的喘鳴 陣發性的咳嗽及呼吸困難 主要的臨床徵狀是曾經有陣發性呼吸困難的病史, 尤其是在夜晚及清晨, 且常合併胸悶及咳嗽的癥狀, 這些陣發性的症狀每次的嚴重度可能不同, 且呼吸道的阻塞可能自行改善或是在治療之後完全恢復 在理學檢查時最常見的發現是於肺部聽診時有喘鳴聲 ; 而在生理學上, 這種陣發性的呼吸道阻塞主要是因為吐氣時的氣流受限所致 ; 病理學上則為氣道發炎, 有時還合併有氣道結構的改變 (Bymep,2007) 因為在氣喘的分類上並無明確的定義, 因此有其他多種的可觀定義如病人會有異位性體質 ( 過敏原皮膚測試陽性 ) 及氣道過度敏感 ( 對於一些正常人沒影響的有發因子會產生呼吸道阻塞的症狀 ) 1. 成因 1.1 個體因子氣喘有遺傳的因素, 但並分所有的氣喘皆因遺傳造成的 相關的基因 (Holloway et al., 1999; Wiesch et al., 1999) 包括製造 IgE 抗體的基因 表現氣道過度敏感的基因 產生發炎反應物質的基因 及決定 Th1/Th2 比例的基因 (Strachan, 1989), 如 interleukin (IL)-4, 以及 ADAM-33 等 其他的基因如影響類固醇 (Ito et al., 2006) 及抗白三烯素 (In et al., 1997) 的治療反應基因等 肥胖也是氣喘的一個危險因子, 其中的 leptin 可能會促進發炎反應, 影響氣道功能並增加產生氣喘機率 (Shore and Fredberg, 2005; Beuther et al., 2006) 在孩童中男性是氣喘的危險因子, 在 14 歲之前, 男孩的發生率是女孩的 2 倍 (Horwood et al., 1985), 但是在成人期女人的發生率比男人多, 然而其中原因仍不清楚 1.2 環境因子室內及室外的過敏原會導致氣喘的惡化, 在出生世代的研究顯示在 3 歲前接觸塵螨 貓毛 狗毛 (Sporik et al., 1990; Wahn et al., 1997) 及 Aspergillus 黴菌 (Hogaboam et al., 2005) 會增加產生氣喘的機率, 這與過敏原 劑量 接觸的時間 孩童的年紀及遺傳的因素等有關 除了上述的過敏原外, 蟑螂 (Rosen streich et al., 1997) 及花粉也是常見的過敏原 在嬰兒期的一些感染可能增加氣喘的發生率 (Sigurs et al., 2000; Gern and Busse, 2002), 如呼吸道如何病毒 鼻病毒 流感病毒 副流感病毒及 human metapneumovirus 造成的急性細支氣管炎, 會造成反覆的喘鳴症狀, 因此在此特定病毒感染造成的氣道發炎反應及宿主的免疫系統等會影響氣喘的發展

6 場所導致氣喘的物質麵包店麵粉乳酪工廠儲存塵螨 (storage mite) 清潔劑工廠 Bacillus subtilis 酵素農夫黃豆塵漁貨工廠寄生蟲食物工廠咖啡豆塵 茶 有殼海鮮 蛋白 木瓜酵素醫療人員乳膠塑膠工廠 Toluene dissocyanate hexamethyl dissocyanate dephenylmethl isocyanae phthalic anhydride triethlene teramines trimellitic anhydride hexamethyl tetramine acrylates 職業性氣喘主要發生在成人期 (Chan-Yeung and Malo, 1994), 預估在成人氣喘中有十分之一的人是職業性氣喘 (Nicholson et al., 2005), 通常是在免疫方面的反應, 且在接觸之後數月至數年後才發病, 在減少接觸後會逐漸改善 (Sastre et al., 2003) 超過 300 個以上的物質可能會導致職業性氣喘 (Newman, 1995; Venables and Chan-Yeung, 1997; Malo et al., 2004), 包跨刺激物質及一些過敏原, 如上表所列 氣喘病人在抽菸後會加速肺功能的惡化, 因而使病人對於類固醇的反應不佳 (Chalmers et al., 2002; Chaudhuri et al., 2003) 在周產期時接觸香菸會大大增加幼兒早產產生氣喘症狀的機率 此外, 接觸二手菸也會增加幼兒下呼吸道疾病的危險機率 (Committee, 1997; Nafstad et al., 1997) 空氣汙染和氣喘成因的相關性仍不確定 (Society, 2000), 但是氣喘的惡化與空氣污的增加有關 (Anto et al., 1999; Marks et al., 2001; Chen et al,. 2004), 除了室外的汙染源外, 室內的香菸 花草 黴菌及蟑螂也是汙染源, 會增加氣道的發炎反應並惡化氣喘症狀 嬰兒時期餵食母乳比配方奶產生氣喘的機率低 (Friedman and Zeiger, 2005) 西化的食物會減少抗氧化物 魚油等的攝取, 也與異位性疾病的發生有關 (Devereux and Seaton, 2005) 2. 流行病學 氣喘是兒科常見的慢性病, 粗估全世界約有 3 億的人有氣喘的問題 (Masoli et al., 2004); 在美國, 兒童因氣喘兒死亡的人次為每年 223 人次, 且近年來氣喘的人口也逐年上升, 由 ISAAC ( 國際兒童氣喘及過敏疾病調查協會 ) 的問卷調查發現在世界各地的氣喘盛行率為 1.6% 至 36.8% 不等 在台灣的 ISSAC 問卷調查中, 曾經有過氣喘的 13~14 歲兒童的盛行率為 17.2% (Yan et al., 2005) 2.1 兒童氣喘的種類

7 兒童的氣喘主要有三大類 : 其一為在嬰兒期有反覆性喘鳴, 與早產及肺部發育較 差有關 ; 其二為在孩童早期反覆性喘鳴, 主因呼吸道病毒感染所致 ; 其三為過敏 性慢性氣喘, 症狀會持續至青春期甚至成人期 3. 臨床症狀及診斷 最常見的症狀是間歇系乾咳 喘鳴 胸悶及胸痛 (Levy et al., 2006); 通常在夜晚時會最嚴重, 日間症狀也可能會影響日常活動及玩耍 ; 之前曾使用擴張劑的治療也可能表示已過氣喘的症狀 ; 如第二部分 3.1 所示, 一些情形會誘發氣喘的症狀 合併有其他的過敏情形如過敏性鼻炎 異位性皮膚炎等也可以支持氣喘的診斷 X 光檢查通常正常, 在深呼吸時有時會有喘鳴聲, 有時也可聽到肺囉因或是 rales, 而在吸入短效型擴張劑時會迅速改善症狀 嚴重發作時會因呼吸道阻塞而有喘鳴聲 吐氣時間加長 肋間凹陷 鼻翼煽動, 甚至無法呼吸 3.1 鑑別診斷 胃食道逆流 鼻竇炎 異物嗆入 cystic fibrosis 聲帶異常 過敏性肺炎 結核菌感染等皆須列入鑑別診斷 3.2 實驗室檢查肺功能檢查是在檢測用力吐氣時的氣流, 其中 spirometry 是種客觀的檢查, 經由此項檢查可以了解是否有阻塞性呼吸道疾病, 然而由於需要配合用氣吹長氣, 一般在 6 歲以上的兒童才可能完成此項檢查 判讀的方式為 FEV1/FVC<0.8 即表示有呼吸道阻塞 由於氣喘病人的症狀為陣發性的, 有時在檢查時為正常, 因此有所謂 bronchoprovocation challenge, 也就是誘發性試驗, 給予 methacholine 的藥物去誘發氣喘的症狀, 再以 spirometry 測定 尖峰呼氣流速的檢測也是一項簡單 便宜且可以在家中施行的檢查, 當病人用力呼氣時, 測速器可以得到數值, 在氣喘發作時此數值會下降, 可以讓病人了解目前的狀況 呼氣 NO 值也是一項輔助的檢查, 數值上升表示氣道的發炎反應增加 3.3 放射線檢查胸部 X 光可能正常或是有過度膨脹, 導致橫膈膜被壓平, 及支氣管周圍增厚 胸部 X 光可以排除吸入性肺炎等其他的診斷, 也可以評估是否有氣喘的併發症 ( 如氣胸 肺塌陷及 pneumomediastinum) 3.4 過敏原檢查 由於兒童氣喘多起因於過敏原, 在 3 歲以上兒童可以考慮檢測過敏原 目前有兩 種檢測方式 : 其阿為皮膚測試, 在皮下注射過敏原萃取液, 若是 wheal 直徑超

8 過 5mm 及為陽性 ; 其二為抽血檢測, 也就是測過敏原特異性的 IgE 抗體 第二部分 : 氣喘病的致病機轉 多種病理犯應導致了呼吸道的阻塞, 包過呼吸道肌肉的收縮導致氣道狹窄, 而發炎細胞的浸潤, 包括嗜伊紅白血球 (eosinophil) 肥胖細胞 (mast cell) 嗜鹼性白血球 (basophil) 嗜中性白血球 (neutrophil) 單核球 (monocyte) 及淋巴球 (lymphocyte), 也會組塞氣道, 使上皮細胞脫屑, 及分泌黏液 1. 氣道的發炎反應 1.1 發炎細胞氣道的發炎反應在氣喘病人中是持續的, 並不向病人的症狀是間歇性的 在不同形式的氣喘, 如過敏性 非過敏性及阿斯匹靈造成的等, 這些發炎反應並無不同 在過敏性氣喘中, 由於過敏原吸入造成了嗜伊紅白血球的發炎反應 ; 而在非過敏性氣喘中, 多種刺激因子會造成氣道的發炎反應 在過敏性氣喘的第一步是產生過敏源特異性的 T 細胞 ; 抗原在吸氣時進入氣道中, 氣道的樹突細胞存在於上皮細胞之下, 在黏膜中形成一個擷取抗原網 (Holt et al., 1990; Huh et al., 2003), 他會因上提細胞的刺激因子如 TSLP (thymicstromal lymphopoietin) 及 GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) 而產生針對過敏原的反應, 及樹突細胞被過敏原活化而誘發 Th2 細胞的發炎反應 (Eisenbarth et al., 2003; Huh et al., 2003; Kuipers and Lambrecht, 2004; Piggott et al., 2005); 一旦樹突細胞成熟後會轉移至附近的淋巴組織, 進一步活化過敏原特異性的 T 細胞, 而這些過敏原特異性 T 細胞部分會形成記憶型 T 細胞, 轉而留在呼吸道中 (Marathias et al., 1991; Upham et al., 1994; Strickland et al., 1996; Medoff et al., 2005) 接下來, 一但被過敏原致敏化之後, 再次接觸時會快速惡化 在氣道中, 過敏原會與多種免疫細胞反映, 並與 IgE 及 IgG 的抗體結合, 促使肥胖細胞釋放一些發炎物質, 產生氣喘的早期發炎反應, 這些物質會導致氣道的水腫 支氣管收縮並啟動發炎細胞的浸潤 同時, 過敏原也會活化樹突細胞, 活化的樹突細胞轉至淋巴組織後 (Holt et al.,1990; Huh et al., 2003), 會將抗原成見給記憶型 T 細胞及促使 naïve T 細胞走向 Th2 的分化, 並活化 T 細胞及其分化 ; 這些 T 細胞會轉至氣道, 分泌細胞激素及其他發炎物質, 造成氣喘的晚期發炎反應 T 細胞會分泌細胞激素如間白質 [ interleukin (IL)-4 ] IL-5 IL-9 及 IL-13 來促進嗜伊紅白血球的發炎反應及 B 細胞製造 IgE (Larche et al., 2003) 在 T 細胞分泌出細胞激素後, 被吸引來的白血球及一些結構細胞如上皮細胞會因細胞激素的刺激而進一步產生其他的發炎物質, 因而殂成了氣喘的典型發炎反應, 如吸引嗜伊紅白血球致發炎處, 在呼吸道上皮細胞中的杯狀細胞產生過量的黏液,

9 平滑肌過度敏感而收縮, 以及慢性發炎之後產生的氣道再塑型 (airway remodeling) 嗜伊紅白血球會進一步產生發炎物質及細胞激素, 是氣喘發炎的重要腳色 (Humbies et al., 2004; Voehringer et al., 2004; Voehringer et al., 2006) 而調節性 T 細胞的減少也會導致 Th2 的細胞增多 在接觸了過敏原之後, 氣道中的 T 細胞數目會大幅增加 (Lommatzsch et al., 2006; Thomas et al., 2007) 在動物的氣喘模式中顯示, 在接觸過敏原後在氣道中的過敏原特異性 T 細胞並不會增生, 氣道中增加的 T 細胞來自於附近的淋巴組織, 因為一些趨化因子而被大量吸引致氣道中 (Harris et al., 2002) 在淋巴組織中的過敏原特異性 T 細胞, 不論是記憶型或是 naïve 型, 皆會因為樹突細胞表現的抗原呈現而被刺激增生 因此, 樹突細胞及 T 細胞在氣喘的發炎反應中扮演著重要的角色 在氣喘的發炎反應中, Th1 及 Th2 細胞的比例不平衡是重要的原因 Naive T 細胞在抗原呈現細胞的幫忙及一些細胞激素的刺激之下, 會分化成 Th1 或 Th2 細胞 ; 其中 IL-2 會促使 Th1 細胞的分化, 而 IL-4 則促使 Th2 細胞的分化 樹突細胞所分泌的 IL-12 會導致 T 細胞中的轉錄因子 T-bat 增加, 並使之產生干擾素 [ interferon (IFN)-γ], 這個細胞激素會促使細胞產生 IL-12 受氣及表現 STAT4 (signal transducer activator of transcription 4) (Glimcher and Murphy, 2000; Mazzarella et al., 2000; Weigmann and Neurath, 2002), 同時, 產生的 IFN-γ 會阻斷 IL-4 的製造, 因而走向 Th1 的極化反應 相反的,Th2 的極化反應則始於 T 細胞受器刺激之後產生活化的 c-maf 及 GATA-3 (Glimcher and Murphy, 2000), 誘發 NFAT (unclear factor of activated T cells) 及 AP-1 (activator protein-1) 轉錄因子的表現 (Glimcher and Murphy, 2000; Komine et al., 2003), 進入細胞核中促進 GATA-3 的表現 (Glimcher and Murphy, 2000; Komine et al., 2003), 進而使細胞產生 Th2 的細胞激素, 如 IL-4 IL-5 IL-9 及 IL-13 這些細胞激素會促進嗜伊紅白血球及肥胖細胞的增援, 因而產生了氣喘的急性及慢性發炎反應 嗜伊紅白血球會分泌變形生長因子 [ transforming growth factor (TGF)-γ] 及 TGF-β (Kay et al., 2004), 造成了氣道的再塑型 其中 TGF-γ 會調節纖維母細胞 (fibroblast) 及肌纖維母細胞 (mydfobroblast), 促使產生多種細胞為介質 (extracellular matrix), 包括膠原蛋白 (collagen) proteoglycan 及 tenascin (Henderson et al., 2002; Tournoy et al., 2002; Kay et al., 2004) 此外, 嗜伊紅白血球的數目增加, 會釋放鹼性蛋白質 (basic protein) 來破壞呼吸道的上皮細胞, 並放大發炎反應, 使黏膜纖維的清除功能下降, 也與氣道再塑型有關 (Kay et al., 2004) 氣道中的嗜伊紅白血球數目越多, 症狀越嚴重, 且對於治療的效果也越差 (Zimmerman et al., 1994) 在氣道中數目增加的肥胖細胞與氣道過敏也有關 (Robinson, 2004) 促使肥胖細胞活化的因子如過敏原與肥胖細胞上的 IgE 受器結合產生的訊息傳導及滲透壓的刺激 ( 導致運動誘發型氣喘 ) 再黏膜處的肥胖細胞接觸了由過敏原結合

10 的 IgE 活化了細胞表面 IgE 的受器後, 會釋放組織胺 (histamine) 白三烯素 (cystmyl leukorienes) 及前列腺素 [ prostaglandm (PG)D 2 ] (Gali et al., 2005) 使支氣管收縮, 與初期的氣喘發作有關 一但 degranulation 開始, 它會使氣道的上皮細胞增加組織滲透性, 因而允許血漿蛋白質和血液內的發炎細胞進入 接著, 組織胺 前列腺素 thromboxane A 2 白三烯素 血小板活化因子 (platelet activating factor) bradykinins 其他衍生物和趨化因子是怎成過敏性立即發炎反應的關鍵因子 (Kay, 1991) 同時導致嗜伊紅白血球及嗜中性白血球的細胞黏附在血管壁, 變形運動, 趨化遷移和活化細胞, 並且也吸收其他細胞至發炎處, 例如單核細胞 巨噬細胞 血小板 及更多的嗜伊紅白屑球及嗜中性白血球, 導致了發炎反應的持續 肥胖細胞產生的 trypatase 也會促使纖維母細胞的增生 嗜鹼性白血球的功用則與肥胖細胞類似 巨噬細胞會因過敏原與細胞表面的 IgE 後器結合而活化, 會釋放發炎物質及細胞激素來放大發炎反應 (Peter-Golden, 2004) 他釋放的物質包跨了白三烯素 LTB 4 及 IL-8 以吸引嗜中性白血球及肥胖細胞, 血小板活化因子 GM-CSF 及 IL-5 以吸引嗜伊紅白血球 (Kay, 1991), 同時也會產生 MCP-1 (monocyte chemotactic protein-1) 來活化肺泡細胞 (Lane et al., 1994), 造成了氣道的發炎反應 再重度氣喘及抽菸的氣喘病人身上其嗜中性白血球的數目增加, 但是嗜中性白血球在氣喘的角色仍不清楚 (Wenzel, 2003) 他可能釋放具細胞毒性的酵素及過氧化物, 在過敏反應的早期及晚期都很活躍 (Smith, 1992) 他會以彈性蛋白酶或過氧化物來破壞毛細胞 (Montefort et al., 1992; Thompson et al., 1995) 1.2 發炎介質超過 100 種以上的發炎介質與氣喘有關 (Barnes et al., 1998), 資列舉重要的物質如下 : 趨化激素是吸引發炎細胞至呼吸道的重要物質, 主要是呼吸道上皮細胞所分泌的 (Miller and Lukacs, 2004) Eotaxin 主要是吸引嗜伊紅白血球, 而 TARC (thymus and activation-regulated chemokines) 及 MDC (macrophage-derived chemokines) 則主要是吸引 Th2 細胞 白三烯素是由肥胖細胞及嗜伊紅白血球所分泌的, 會造成發炎反應及支氣管收縮 (Mayatepek and Hoffmann, 1995), 也會吸引嗜伊紅白血球及嗜中性白血球至氣道餐與發炎反應 (Laitinen et al., 1993), 並增加血管的通透性及黏液分泌 (Lundgren and Shelhamer, 1990); 其拮抗劑可以改善肺功能及氣喘症狀 (Leff, 2001) 細胞激素造成的發炎反應決定了氣喘的嚴重度 (Bames, 2002), 主要的細胞激素釋放大發炎反應的 IL-1β 及癌細胞壞死因子 [ tumor necrosis factor (TNF)-α ], 增加嗜伊紅白血球存活的 GM-CSF;Th2 細胞分泌的 IL-5 可以促進嗜伊紅白血球的分化及存活, IL-4 對於 Th2 細胞的分化很重要, 而 IL-4 和

11 IL-3 與 IgE 的產生有關, 這些細胞激素會促使 Th2 的反應 (Broide et al., 1992; Larche et al., 2003) 由肥胖細胞所產生的組織胺會造成支氣管收縮及發炎反影 前列腺素 PGD 2 是由肥胖細胞分泌的支氣管收縮劑, 也會吸引 Th2 細胞至呼吸道 一氧化氮只 要由呼吸道上皮細胞經由一氧化氮合成酶所產稱, 可使血管放鬆 (Ricciardolo et al., 2004), 在氣喘病人中, 呼氣一氧化氮值與氣道發炎的嚴重度有關 (Smith and Taylor, 2005) 1.3 呼吸道的結構改變在氣喘的發炎早期組織就已開始修復, 而修復的作用會早成氣道再塑型 其中由於基底膜下產生的膠原纖維及 proteoglycan 會造成上皮細胞下纖維化, 且其他層的氣道壁也可能會纖維化 (Holgate et al., 2003) 因為平滑肌的增生及肥大導致氣道壁增厚 (Hirst et al., 2003), 其增厚與疾病嚴重度及發炎物質 ( 如生長激素 ) 有關 在氣道壁的血管增生與血管內皮生長激素 (vascular endothelial growth factor) 有關, 也會導致氣管壁增厚 由於氣道上皮細胞的杯狀細胞 (goblet cells) 增加及黏膜下腺體增大導致黏液分泌過多 以下討論數個與氣道再塑型有關的細胞或物質 : 發炎反應中的巨噬細胞 淋巴球 肥胖細胞與嗜伊紅白血球會分泌 TGF-β 及 PDGF (platelet-derived growth factor), 促使纖維母細胞增生並產生膠原纖維 (Roche, 1991) 及 tenascin (Fish and Peters, 1999), 而肌纖維努細胞也會產生 fibronectin laminin 及膠原纖維, 造成氣道再生時的異常 上皮細胞在氣道再生時會逐漸消失其表面的纖毛, 主因肥胖細胞及淋巴球產生的細胞激素及蛋白酶會破壞上皮細胞 (Holgate et al., 1999), 且 IL-13 會導致上皮下的纖維化 (Kuperman et al., 2002), 因此士德氣道對於一些刺激更加敏感 (Perssoon et al., 1997) 細胞外界質及基底膜在氣道再塑型時會逐漸增厚 (Vignola et al., 2000), 主因肌纖維母細胞的活化而造成 而在病人氣道中的彈性纖維則呈現斷裂狀 2. 生理病理學 氣喘的氣道狹窄是發炎反應所造成的最後結果, 其中有多種因素會早成氣道狹窄 最主要的原因是多種造成平滑肌收縮的物質及神經傳導物質造成的呼吸肌收縮, 可因為擴張及而改善 微血管由於發炎物質的影響導致血管間隙增加及呼吸到水腫, 導致急性氣喘發作 由於呼吸道的再塑型而導致呼吸道壁增厚, 會造成疾病的惡化, 對於目前的治療也無法完全恢復 此外由於黏液增加會使管徑變小, 甚至會阻塞呼吸道 3. 特殊機轉

12 3.1 急性發作一些誘發因子會使氣喘急性惡化, 如運動 空氣汙染 (Tillie-Leblond et al., 2005) 及天氣變化 (Newson et al., 1998) 其他如上呼吸道感染及過敏源也會使氣喘惡化, 如下表所列 誘發氣喘的因子病毒性呼吸道感染呼吸道過敏原動物毛皮 塵螨 蟑螂 黴菌孢子 花粉等吸菸空氣汙染香水 頭髮噴霧 清潔劑等職業曝露農場 穀倉 甲醛等乾冷空氣運動過度換氣如大哭 大笑 Co-morbidity 鼻炎 鼻竇炎 胃食道逆流 3.2 內因性氣喘由於一些成因, 如發炎反應會造成神經系統的改變, 使得末梢神經較敏感, 或是副交感神經的活性增強導致平滑肌的收縮 (Ricci and Romagnani, 1991), 以及一些神經胜肽如 e-nanc (excitatory nonadrenergic/noncholinerhic system) 及 i-nanc (inhibitory onadrenergic/noncholinerhic system) 的不平衡 tachykinin 及神經傳導物質等會促使神經性發炎反應, 使得病人有內因性氣喘 3.3 夜間氣喘由於週期性的變化會使一些荷爾蒙如腎上腺素 (epinephrine) 皮脂醇 (cortisol) 褪黑激素 (melatonin) 有改變, 而副交感神經系統的活性也有日夜的變化, 因此呼吸道的發炎會在夜間比較嚴重 (Calhoun, 2003) 3.4 吸菸及氣喘 吸菸會使氣喘更難控制, 因為它會使氣道中的嗜中性白血球發炎更嚴重, 而 在嗜中性白血球發炎的氣道對於類固醇的反應會較差 (Gauvreau et al., 2006) 第三部分 : 氣喘病的治療 1. 藥物治療 氣喘的藥物治療可以分兩大類 : 控制藥物及緩解藥物 1.1 控制藥物吸入性類固醇是目前在持續性氣喘最有效的抑制發炎反應藥物, 他可減少氣

13 喘的症狀 (Juniper et al., 1990) 改善生活品質 (Juniper et al., 1990) 改善肺功能 (Juniper et al., 1990) 減少氣道過度敏感 (Group, 2000) 控制器道發炎反應 (Jeffery et al., 1992) 減少急性發作 (Pauwels et al., 1997) 及減少氣喘的死亡率 (Suissa et al., 2000), 然而它並無法治癒氣喘 (Waalkens et al., 1993) 吸入性類固醇的副作用包括口腔的念珠菌感染 聲音沙啞及刺激性咳嗽 若是長期使用大量的吸入性類固醇會減少骨質密度及抑制腎上腺功能 白三烯素拮抗劑 (Ieukotriene antagonist) 是白三烯素 1 受器的拮抗劑, 有輕微支氣管擴張的效果 減少咳嗽症狀 (Dicpinigaitis et al., 2002) 改善肺功能及減緩氣道發炎的反應 (Drazen et al., 1999; Lipworth, 1999; Barnes and Miller, 2000) 白三烯素拮抗劑的副作用很少, 但是很可能會惡化 Churg-Strauss 症候群 長效型吸入性 beta 2 -adrenergic agonist 不可單獨用來治療氣喘, 因為他們並不會改善氣道的發炎反應 他們最有效的使用是與吸入性類固醇合併使用 (Lazarus et al., 2001; Lemanske et al., 2001), 可以減少類固醇的使用量 (Bateman et al., 2004), 並改善症狀 減少夜間咳嗽及改善肺功能 此外他們可以預防運動誘發型氣喘 長效吸入性 beta 2 -adrenergic agonist 的副作用是心悸 肌肉顫抖及低血鉀症 茶鹼是一種支氣管擴張劑, 並有少量的抗發炎反應 (Sullivan et al., 1994; Kidney et al., 1995; Barnes, 2003) 它可用於控制不佳的病人最為增加的治療 (add-on therapy), 但是她的效果比長效型 beta 2 -adrenergic agonist 略差 (Dacies et al., 1998; Wilson et al., 2000) 茶鹼的副作用很大, 包括腸胃道不適 稀便 心律不整 抽筋甚至死亡, 因此限制了其應用 Anti-IgE 單株抗體用於治療 IgE 高的病人, 目前建議用於 12 歲以上重度氣喘的病人 (Humbert et al., 2005), 它可以改善氣喘症狀及控制 目前對於副作用的報告並不多, 似乎還算安全 口服類固醇對於重度的氣喘病人可以改善氣喘的症狀, 然而它的副作用太大, 會成骨質酥疏鬆 高血壓 糖尿病 肥胖 青光眼等, 因此口服類固醇的適用需要非常小心 1.2 緩解藥物快速作用行型吸入性 beta 2 -adrenergic agonist 可以快速改善支氣管收縮的症狀及預防運動誘發型氣喘, 目前只建議用於有症狀的時候, 並且在有症狀時要同時使用控制藥物 快速作用型吸入性 beta 2 -adrenergic agonist 的副作用包括嚴重的心悸及顫抖 Anticholinergics 比快速型吸入性 beta 2 -adrenergic agonist 的效果略差, 但是兩者並用可以增加症狀的改善, 副作用是口乾及有苦味 短效的茶鹼可以改善氣喘症狀, 但是副作用也相對較高 在有症狀時須要有抗發炎的藥物去改善發炎反應, 因此在大發作時須使用口服或全身注射的類固醇, 以減少死亡率 短期的全身性類固醇並不會有炎種的副

14 作用, 但是較常時期的使用會造成胃潰瘍 高血壓 月亮臉及股骨壞死 2. 其他治療 2.1 減敏療法過敏原, 例如塵螨, 動物皮毛和季節性花粉, 經常會誘發兒童氣喘的發作 其中, 以塵螨是最常見的室內過敏原 (Nelson, 2000), 在台灣尤其是 在 Custovic 黨人的研究顯示塵螨的接觸與支氣管過度敏感有正相關, 且與 FEV1 有負相關 (Custovic et al., 1996); 此外, 在減少塵螨的接觸後, 氣喘症狀和支氣管過度敏感會逐漸改善 (Nelson, 2000); 因此, 塵螨與氣喘的產生是否有關聯是大家努力的課題 塵螨的主要過敏成分是 Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) 和 Dermatophagoides farinae (Der f) Der p 1 導致 Th2 細胞的免疫反應和下游的過敏發炎反應 (Sharma et al., 2003) 此外, Der p 1 的 cysteinyl proteases 會分解 B 細胞的 CD23, 因而通過抑制回饋機制的抑制而促進了 B 細胞產生 IgE (Hewitt et al., 1995) Der p 1 也會分解 T 細胞上的 CD-25 (IL-2 受器 ), 因而抑制 INF-γ 的分泌和促進 IL-4 的分泌, 促使 IgE 的產生 (Ghaemmaghami et al., 2001) 數十年來, 減免治療是給予病人少量過敏原 ( 過敏原萃取物 ), 逐漸增量後達到減敏化, 因而在接觸了自然界的過敏原時, 症狀減輕的非藥物療方式之一 (Canonica and Passalacqua, 2003) 皮下注射的減敏治療法是將過敏原萃取物打物皮下以產生療效, 他從 1910 年代開始已源遠流長, 是臨床上對於過敏疾病如過敏性鼻炎或過敏性結膜有效的治療方法 (Canonica and Passalacqua, 2003), 須維持數年, 至少三年以上較有效 它的副作用包括了局部疼痛 搔癢, 然而在 1986 年英國的醫學安全委員會報告提下注射減敏治療已造成了數起因過敏性休克而死亡的案例 (Stewart and Lockey, 1992) 因為這種治療可能產生局部或全身性反應甚至是死亡的副作用, 因此其他非注射的方式例如經口, 局部鼻噴劑, 局部支氣管噴劑和舌下給予的途徑皆被選擇為可能的減敏治療方式 (Canonica and Passalacqua, 2003) 舌下減敏治療已在歐洲實行近二十年, 它是將過敏原萃取物分為舌下含後吐出, 全部舌下含著, 舌下含後吞下, 或聯合舌下及經口的形式給予 當過敏萃取物稅容易被吞下前, 過敏原萃取物會被保留在舌下一些時間, 不論是被吐之前或吞下去之前 (Frew and Smith, 2001) 在健康志願者, 過敏原在吞下之前含在舌下黏膜 30 分鐘時, 在舌下黏膜可以持續被發現達 20 個小時 (Bagnasco et al., 1997), 因此建議過敏原應由舌下的途徑來給予 一些安慰劑控制雙盲研究的結果顯示, 舌下減敏治療可以改善塵螨過敏病人的過敏疾病症狀並且 / 或著減少其治療藥物 (Frew et al., 1999; Pajno et al., 2000; Bahceciler et al., 2001) 在 24 個年齡 8 至 15 歲小孩的塵螨減敏治療顯示在治療 1 年後, 藥物組逾期喘發作時 夜間氣喘症狀及藥物使用量比安慰一組有顯著改

15 善 (Frew et al., 1999) Bahcecilerr 等人在一項安慰劑控制雙盲研究的塵螨 (Der p 及 Der f) 舌下減敏治療 6 個月後, 日間氣喘症狀及藥物使用量比安慰劑組有明 顯的減少 (Bahceciler et al., 2001) 而且, 舌下減敏治療的長期追蹤報告已有 10 年 (Di Rienzo et al., 2003); 在舌下減免治療停止 5 年後, 氣喘症狀比治療前有明 顯改善, 而藥物治療也明顯減少, 顯示其預防作用和持久效力 (Di Rienzo et al., 2003) 舌下減敏治療的安全性尤其特別令人鼓舞 ; 除了局部腸胃道症狀之外, 僅有極少數的全身性副作用或過敏性休克的案例被報告 由此來看, 舌下減免治療是有部分效過果和安全性佳的 然而, 在他被推薦 為常規的臨床治療之前, 需要進一步研究其適應症的定義 治療的期間和標準化 過敏原萃取物治療的劑量和副作用, 同時確認其免疫機轉 而舌下減敏治療的機轉為何, 至今仍未明朗 目前認為過敏原在舌下途徑是 被口腔黏膜的樹突細胞所擷取, 樹突細胞處裡過敏原並且移居到局部淋巴結, 成 為抗原呈現細胞 ; 有人假設樹突細胞產生的 IL-12 和被處理的過敏原促使免疫 反應傾斜往 Th1 方向而非 Th2 方向, 因而導致 IgE 的產生減少 (Macatonia et al., 1995) 然而在皮下注射減敏治療中減少的過敏原特異性 IgE 和增加的過敏 原特異性 IgG 4 的現象並未在舌下減敏治療的病人中發現 (Nouri-Aria et al., 2004) 另一個目標是調節性 T 細胞, 它分成自然發生的, 由胸線所分化的 CD + 4CD25 + 細胞, 含有轉錄因子 Foxp3, 及 adaptive 調節細胞, 其中 Tr1 會 分泌 IL-10 而 Th3 會分泌 TGF-β(Robinson et al., 2004) 調節性 T 細胞會控 制或壓制其他細胞的作用, 因此有抑制免疫反應的功能 (Kallinich et al., 2007) 皮下注射減敏治療已被繩可以數近周邊血 T 細胞產生 IL-10 並抑制過敏原導 致的 T 細胞增生, 可能是因為 CD + 4CD25 + T 細胞產生的 IL-10 或 TGF-β 而 被抑制 (Jutel et al., 2003) 在舌下減免治療中, 血清中的 IL-10 會上升, 北刺 激的周邊血單核細胞也會大量產生 IL-10 且對於裂質素的刺激反應較差 (Ciprandi et al., 2005) 由於調節 T 細胞是產生 IL-10 的一個重要來源, 因此 多數人推測, 舌下減敏治療也是經由調節性 T 細胞的免疫抑制功能來抑制體內 的過敏反應, 進而達到療效 ; 目前已有一篇臨床試驗報告表示調節性 T 細胞可 能與舌下減敏治療的機轉有關 (O Hehir et al., 2009) 2.2 非主流治療 包括針灸 順勢療法 整脊及中草藥等, 目前未有良好的報告證實其效果, 反而可能會有一些副作用, 須小心使用 3. 環境控制 由於多數的兒童氣喘是由過敏原引起, 引此環境的控制很重要, 包括塵螨 花粉 動物皮毛及蟑螂等皆須避免, 可減少症狀的惡化 下表為簡單的控制方法 : 過敏原控制方法

16 花粉 家裡避免擺放鮮花, 花粉劑時避免外出, 或戴口罩 蟑螂 加強環境衛生 動物皮毛 家裡不養貓狗等寵物, 並加強環境衛生以免滋生老鼠 塵螨 避免厚重的棉質物品, 如布沙發 布窗簾 地毯及絨毛玩具, 寢具每兩周以溫水清洗, 以除濕機保持室內乾燥 空氣汙染 避免家中的空氣汙染, 如甲醛 於空氣汙染嚴重時避免外出 第四部份 : 研究目的及假說 1. 背景 氣喘是兒童主要的慢性病, 近年的治療已大幅減少了氣喘的死亡率和併發症 其中包括吸入性類固醇 ( 目前的主要治療 ) 茶鹼 長效型 beta 2 -adrenergic agonist 白三烯素拮抗劑和 IgE 抗體, 單獨或與吸入性類固醇合併使用, 增加了氣喘的控制 然而這些藥物有某些副作用, 如類固醇造成的鵝口瘡, 抑制生長 (Carlsen, 2005) 或是長效型 beta 2 -adrenergic agonist 增加的嚴重氣喘惡化的風險 ( Nelson et al., 2006); 且即使是以目前最佳的療法也無法完全控制困難治療的氣喘病患 (Paul O'Byme, 2007) 所以對於氣喘治療的機種其他方法也已被廣泛的研究 : 皮下注是減敏治療有一些幫助, 但過敏性休克反應的副作用及頻繁注射限制了它的應用 (Canonica and Passlacqua, 2003); 舌下減敏治療對於兒童是安全的, 但只對於輕度集中度起喘有部分的效果 (Sopo et al., 2004; Rienzo et al., 2005) ; 其他新穎的治療在氣喘小鼠模式中有效, 例如 central deoxycytidyl-deoxyguanosine (CpG) dinucleotide 的吸入 DAN 疫苗和 antisense oligonucleotide, 但是在人類的效果並沒有被證實 (Wang et al., 2007), 因此我們想探討其他的治療方式及其機轉 2. 蜂膠的作用與氣喘 蜂膠自古以來即是草藥醫學中用來治療多種疾病的良藥, 包括外傷 燙傷 喉嚨痛 腹痛及呼吸道疾病 (Cohen et al., 2004) 蜂膠主要是蜜蜂築巢時的黏著劑, 由蜜蜂於當地的植物中萃取而成, 因此各地的蜂膠與當地的植物組成有很大的關係, 目前已知其組成部分包含約 50% 的樹脂及植物花苞,30% 的臘,10% 的香芬油脂,5% 的花粉及 5% 的礦物質 (Cohen et al., 2004) 蜂膠中還有大量有作用的化學物質, 如 terpenes cinnamic acid caffeic acid 及其酯化物, 胺基酸及 flavonoids (Volpert and Elstner, 1993); 此外蜂膠也含有一些抗菌成份, 被報告有抗細菌 抗病毒 抗發炎 抗癌等作用 在臨床研究中,Khayyal 等人給予輕度與中度氣喘病人蜂膠萃取物 2 個月,

17 合併口服茶鹼治療 (Khayyal et al., 2003), 發現夜間氣喘發作的次數在蜂膠治療組中比安慰劑組少了許多 另外肺功能在蜂膠治療組有大幅改善, 但是安慰劑駔並沒有改變 而在 2 個月的治療後, 蜂膠治療組的血清有明顯下降的為 TNF-α 細胞間的黏附力因子 [ intercellular adnesion molecule (ICAM)-1 ] IL-6 IL-8 白三烯素及前列腺素 PGE 2, 而這些變化在安慰劑組並沒有被發現 在氣喘小鼠模式中, 蜂膠萃取物能抑制 OVA (ovalbumin) 致敏小鼠血清中的 OVA- 特異性 IgE 和 IgG 1, 及氣道過度敏感的反應 ; 此外蜂膠萃取物也能抑制 OVA 刺激的脾臟細胞去分泌 IFN-γ IL-6 和 IL-10 (Sy et al., 2006) 3. 蜂膠主成分咖啡酸苯乙酯 (caffeic acid phenethyl ester) 在蜂膠中眾多的化學成分中, 最常被拿來研究的誤植為咖啡酸苯乙酯 [caffeic acid phenethyl ester (CAPE) ], 其結構式如上圖, 目前被報告具有多種已知機轉的作用 : ( 甲 ) 抗癌及抗細胞複製作用 (Chiao et al., 1995; Huang et al., 1996), 主要是因為它會促進癌細胞株的細胞凋亡及早期凋亡因子 (caspase) 的活化, 此外也會抑制 Akt 的訊息傳遞, 所以可以以致細胞的複製因而有抗癌的功效 ( 乙 ) 抗發炎作用 (Mirzoeva and Calder, 1996; Michaluart et al.,1999), 咖啡酸苯乙酯已在多種細胞中被證實可以經由抑制 NF-κB 的訊息傳導路徑而達到抗發炎的作用, 其中包過可以抑制 IKK 的磷酸化, IκBα 的磷酸化及分解, 最後導致 NF-κB 進入細胞核與 DNA 結合的能力下降使得促進 DNA 轉錄的能力下降 ( 丙 ) 抗氧化作用 (Ahn et al., 2004), 目前已知咖啡酸苯乙酯可以減少在灌流後的氧化傷害, 主因咖啡酸苯乙酯可以抑制 NO 合成酶以減少過氧化物的產生 ( 丁 ) 壓制 eicosanoid 的合成 (Mizoeva and Calder, 1996) 在免疫學研究, 咖啡酸苯乙酯可以抑制裂質素導致的 T 細胞增生及 lymphokine 的製造 (Ansorge et al., 2003), 也可以抑制 NF-κB 的活化 (Natarajan et al., 1996; Orban et al., 2000; Marquez et al., 2004); 咖啡酸苯乙酯可以抑制 NF-κB 之 p65/rela 與 DNA 的結合 減少細胞中 IκBα 的量 (Orban et al., 2000) ; 咖啡酸苯乙酯也會抑制 T 細胞 NFAT 的去磷酸化及轉錄活性 (Marquez et al., 2004) 4. 樹突細胞在氣喘的角色 樹突細胞 [ dendritic cells (DCs) ], 是最強的職業抗原呈現細胞 [ antigen pressenting cells (APCs) ] 之一, 在氣喘和過敏性鼻炎的病理機轉中扮演一個重要

18 的角色 (van Rijt and Lambrecht, 2005) 樹突細胞平時以一個未成熟的狀態存在於氣道黏膜和間質中 (Lambrecht and van Rijt, 2006), 並且是專門用於擷取和處理抗原以形成主要組織相容性 [ major histicimpatilibity complex (MHC) ] 胜肽複合體 ; 在抗原或其他的刺激下, 樹突細胞逐漸成熟並減少 endocytic/phagocytic 的受器 增加 MHC 分子和 costimulatory 分子 改變黏著分子和細胞激素受器的表驗 產生細胞激素及改變外形 (Banchereau et al., 2000; Turley et al., 2000; Klenijmeer et al., 2001; Reis e Sousa, 2006; Schuurhuis et al., 2006) 同時, 樹突細胞移居到淋巴結並表現被擷取的抗原給 naïve T 細胞 (Schuurhuis et al., 2006), 以一種穩定及持久免疫突觸與 T 細胞接觸 MHC 胜肽複合體與 T 細胞受器互動, costimulatory 分子與 T 細胞表達的 corceptors 互動, 並且分泌細胞激素以極化 T 細胞 (Hammad and Lambrecht, 2006), 因而導致過敏的氣道發炎反應 樹突細胞在接下去的免疫反應中的重要性可以由氣喘小鼠模式中去除樹突細胞而證實, 包括氣道發炎反應 杯狀細胞增生和支氣管過度敏感皆會消失 (van Rijt et al., 2005) 因此, 樹突細胞在過敏性氣喘的致病機轉中扮演著重要的角色 5. T 細胞在氣喘的角色 Th2 細胞是造成氣喘後期發炎反應的主要細胞 (Bochner and Busse, 2005), 它會釋放一些細胞激素, 如 IL-4 IL-5 IL-9 及 IL-13, 以促進嗜伊紅白血球的發炎反應, 促進 B 細胞產生 IgE (Larche et al., 2003), 活化肥胖細胞及嗜鹼性白血球, 使黏液分泌過多 (Larche, 2006) 及氣道過度敏感 (Cohn et al., 2004) IL-4 及 IL-13 是造成氣道再塑型的重要因子, 慢性接觸過敏原後 (Leigh et al., 2004) 他們會使支氣管壁增厚 平滑肌增生及基底層增厚 (Roche et al., 1989), 而氣道再塑型會使肺功能逐漸下降 (Haahtela et al., 1994) 在人類的試驗中, 在氣喘病人給予合成的 IL-4 會使氣道敏感度增加 (Shi et al., 1998), 而針對 Th2 細胞的治療可以改善氣喘病成的惡化 (Epstein, 2006), 因此 Th2 細胞在氣喘後期的發炎反應扮演重要的角色 6. 假說 既 Khayyal 等人在氣喘病人中展示了蜂膠的作用 (Khayyal et al., 2003), 且 Sy 等人在氣喘小鼠模式報告了相似的作用 (Sy et al., 2006), 我們對於咖啡酸苯乙酯影響樹突細胞及 T 細胞在氣喘致病機轉的角色感興趣 之前只有在人的樹突細胞檢測咖啡酸苯乙酯抑制的效果, CAPE 抑制了 L. major 導致樹突細胞表現的 IRF-1 IRF-8 IL-12 p35 和 IL-12 p40 RNA 以及 IRF-8 的核轉移 (Jayakumar et al., 2008); 然而塵螨和花粉才是主要過敏疾病的過敏原 而自人類周邊血分離的 T 細胞尤其是自氣喘病人周邊血分離的 T 細胞的研究也是沒有人去發表的 在此研究中, 作者想要了解哪分酸苯乙酯對於樹突細胞及 T 細

19 胞的調節作用 ( 如圖 A) 作者假設咖啡酸苯乙酯會抑制樹突細胞及 T 細胞分泌細胞激素及趨化激素, 進而抑制了過敏反應 同時, 希望可以了解咖啡酸苯乙酯對於 Th1 及 Th2 細胞的作用是否不同 ; 並且藉由訊息傳導的研究來了解其機轉 作者希望藉由這項研究建立咖啡酸苯乙酯在治療氣喘及其他過敏疾病的角色, 使得能了解其抑制的機轉, 進而提供蜂膠在治療過敏疾病的學理基礎 圖 A 利用人類樹突細胞及 T 細胞做為測試咖啡酸苯乙酯對於免疫系統的最用之平台 樹突細胞在遇到抗原的刺激後, 會成熟及活化, 分泌細胞激素及增加表面分子的表現 ; 同時利用樹突細胞及 T 細胞的共同培養, 使得 T 細胞被活化而產生細胞激素 探討咖啡酸苯乙酯對於以上免疫反應是此研究的主要目的

20 第二章 結果 1. 測試實驗 1.1 咖啡酸苯乙酯的劑量由於 CAPE 對於細胞有促進細胞凋亡的結果 ( Chiao et al., 1995), 因此在營實驗前先以不同濃度的 CAPE 治療樹突細胞 ( 圖一 ), 可見在 0~10μM 的濃度下, 並不會造成樹突細胞明顯的細胞凋亡, 其中 及 100μM 下陽性的 annexin-v 的細胞比率平均分別為 17.98% 19.36% 21.7% 及 47%, 因此在之後的實驗以 10Μm 為工作濃度 1.2 刺激樹突細胞的時間點的決定以 LPS 及塵螨萃取物刺激樹突細胞, 分別測定不同時間點的細胞激素濃度 ( 圖二 B), 可見於 48 小時的細胞激素濃度最高, 因此選取 48 小時為刺激樹突細胞成熟的時間點 1.3 NF-κB 的訊息傳導路徑時間點決定以 LPS 刺激樹突細胞, 分別測定不同時間點的 IκBα 磷酸化 ( 圖三 ), 可見於 30 及 45 分鐘時的磷酸化最為明顯, 因此選取 45 分鐘為作用時間點 2. CAPE 抑制樹突細胞產生細胞激素 (IL-12, IL-10) 及趨化激素 ( IP-10) 2.1 未加入 CAPE 的結果 由圖四可見在健康成人控制組中, LPS 可以促進樹突細胞分泌, 與為刺激 的樹突細胞相比, LPS 可以促進樹突細胞分泌大量的 IL-12 p40 IL-10 及 IP-10 (p<0.001) 在塵螨萃取物與未刺激的樹突細胞相比, 則可促進樹突細胞分 泌大量的 IL-12 p40 及 IP-10 (p<0.001) 在塵螨過敏的病人實驗組中可見, LPS 可促進樹突細胞分泌, 與未刺激的樹突細胞相比, LPS 促進樹突細胞分泌大量 的 IL-12 p40 IL-10 及 IP-10, 而塵螨萃取物可促進樹突細胞分泌大量的 IL-10 及 IP-10 然而, LPS 刺激產生的 IL-12 p40 及 IL-10 在實驗組明顯比控制組 低, 但是 IL-10 在實驗組明顯比控制組高 2.2 加入 CAPE 後的比較由圖四可見加入 CAPE 後的在康成人控制組中 LPS 可以促進樹突細胞的分泌, 而 CAPE 可以明顯抑制 LPS 刺激產生的 IL-12 p40 IL-12 p70 及 IL-10, 此外 CAPE 可以明顯抑制塵螨萃取物刺激產生的 IL-12 p40 IL-10 及 IP-10, 其中,IL-12 p70 也被抑制, 只是未達統計上顯著意義 在塵螨過敏的病人實驗組中,CAPE 可以明顯抑制塵螨萃取物刺激產生的 IL-10 及 IP-10

21 3. CAPE 不影響樹突細胞的吞噬功能 未成熟樹突細胞會將抗原吞入細胞內以呈現給 T 細胞, 而隨著樹突細胞逐漸成熟之後, 此吞噬能力會逐漸消失, 因此使用 FITC-dextran 這種在未成熟的樹突細胞中會大量吞噬的抗原以流式細胞儀來測定樹突細胞的吞噬功能 如圖五, 在健康成人中, LPS 及塵螨萃取物刺激過的樹突細胞會比為刺激過的樹突細胞吞噬較少的 FITC-dextran, 其平均螢光值分別為 43.8 及 , 然而 CPAE 並未影響此一吞噬功能 4. CAPE 不影響樹突細胞的細胞表面分子之表現 未檢測 CAPE 使否會影響樹突細胞在體外培養的成熟過程, 實驗利用流式細胞儀檢測樹突細胞上的表面分子, 由圖六可見與未刺激樹突細胞相比, LPS 可以刺激樹突細胞產生高量的 HLA-DR CD86 CD80 及 CD83, 而塵螨萃取物可以刺激樹突細胞產生高量的 HLA-DR CD86 及 CD80 然而這些 costimulatory 分子及 MHC class 分子, 並未被 CAPE 所抑制 ( 圖六 ) 5. CAPE 不影響樹突細胞活化 T 細胞的能力 5.1 未加入 CAPE 的樹突細胞活化能力 成熟的樹突細胞舉有活化 T 細胞產生細胞激素及複製增生的能力, 因此實驗利用自體的 naïve CD4 + T 細胞與刺激過的樹突細胞共同培養來檢測 CAPE 治療過的樹突細胞是否會影響其活化能力 T 細胞與樹突細胞以 1 比 10 的比 例培養 3 天 由圖七可見在健康成人控制組中, 與未刺激過的樹突細胞相比, LPS 刺激過的樹突細胞會使 T 細胞產生大量的 IFN-γ, 塵螨萃取物刺激過的樹突細 胞會使 T 細胞產生大量的 IFN-γ 及 IL-5, 並使 T 細胞分裂增加 在塵螨過 敏病人實驗組中, LPS 及塵螨萃取物皆會使 T 細胞的分裂增加 在控制組中, 不論是 LPS 或是塵螨萃取物刺激的樹突細胞皆會使 T 細胞產生比實驗組高的 IFN-γ 5.2 加入 CAPE 的樹突細胞的活化能力 然而與預期不同的是,CAPE 並不會影響樹突細胞的活化能力, 不論是在產 生細胞激素或是在複製增生的能力上, 有 CAPE 處理的樹突細胞與無 CAPE 處理的樹突細胞皆無明顯差異 6. CAPE 抑制樹突細胞之 IκBα 磷酸化 總量減少及 NF-κB 的活 化

22 6.1 CAPE 抑制樹突細胞之 IκBα 磷酸化 總量減少由於 LPS 可以經 NF-κB 的訊息傳導路徑來活化樹突細胞, 實驗先將樹突細胞以 CAPE 處理 2 小時後再以 LPS 刺激 45 分鐘, 以西方墨點法來檢測 NF-κB 的訊息傳導路徑 由圖八 A 可見, CAPE 可以抑制細胞內的 IκBα 磷酸化, 並有 dose-dependent 的效果 ; CAPE 也可以抑制 IκBα 的總量減少 ( 圖八 B) 6.2 CAPE 抑制樹突細胞之 NF-κB 的活化為確認 CAPE 可以抑制樹突細胞中 NF-κB 進入細胞核中活化的能力, 實驗先以 LPS 刺激樹突細胞 2 小時再以 EMSA 來測定 NF-κB 與 DNA 結合的能力 如圖九可見 CAPE 可以抑制樹突細胞之 NF-κB 的活化, 並有 dose-dependent 的效果, 此結合能力是特定的, 克貝沒有標定的競爭的 NF-κB oligonucleotide 所結抗 7. CAPE 不影響樹突細胞的 MAPK 家族傳導路徑 MAPK 的 3 種不同路徑, 包括 p38 MAPK p42/44 extracellular signal-regulated kinases (ERK) 及 P46/54 c-jun N-terminal kinases (JNK) 的磷酸化皆以西方墨點法測定 如同上述以 LPS 刺激 45 分鐘後, CAPE 並不會影響 p38 MAPK p42/44 ERK 及 P46 / 54 JNK 的磷酸化 ( 圖十 )

23 第三章 圖表

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27 圖四總整

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33 第四章 文獻 * 王麗潔 (2010) 蜂膠主成份咖啡酸苯乙酯對於人類樹突細胞及 T 細胞的免疫調節功能極其機轉之探討 原淑莉 (2013) B 細胞轉錄激活因子對急性哮小鼠氣道炎症的調整控制 張琦 (2005) 轉錄因子 T-bet Gata-3 的比率評價哮喘患者 Th1 Th2 失衡及 CpGODM 干預機制的研究 詹仁隆 徐世達 (2002) 嚴重型氣喘的分類及其致病機轉 台灣兒童過敏氣喘及免疫學會學會通訊 3(4):23-24 蔡光超 (2005) 氣喘急性發作時表現型態與預後因子之研究 *Bardin, P., et al. (2015). Roflumilast for asthma: Efficacy findings in mechanism of action studies. Pulm Pharmacol Ther. Eisenbarth, S. C., et al. (2003). The master regulators of allergic inflammation: dendritic cells in Th2 sensitization. Curr Opin Immunol 15(6): Froidure, A., et al. (2015). Dendritic cells revisited in human allergic rhinitis and asthma. Allergy. Harris, N. L., et al. (2002). Differential T cell function and fate in lymph node and nonlymphoid tissues. J Exp Med 195(3): *Holt, P. G. (2015). The mechanism or mechanisms driving atopic asthma initiation: The infant respiratory microbiome moves to center stage. J Allergy Clin Immunol 136(1): Kay, A. B., et al. (2004). A role for eosinophils in airway remodelling in asthma. Trends Immunol 25(9): *Kerley, C. P., et al. (2015). Vitamin D as an adjunctive therapy in asthma. Part 1: A review of potential mechanisms. Pulm Pharmacol Ther 32: Kerley, C. P., et al. (2015). Vitamin D as an adjunctive therapy in asthma. Part 2: A review of human studies. Pulm Pharmacol Ther 32: Kim, B. Y., et al. (2004). Feature genes of hepatitis B virus-positive hepatocellular carcinoma, established by its molecular discrimination approach using prediction analysis of microarray. Biochim Biophys Acta 1739(1): Komine, O., et al. (2003). The Runx1 transcription factor inhibits the differentiation of naive CD4+ T cells into the Th2 lineage by repressing GATA3 expression. J Exp Med 198(1): Kuipers, H. and B. N. Lambrecht (2004). The interplay of dendritic cells, Th2 cells and regulatory T cells in asthma. Curr Opin Immunol 16(6): Larche, M., et al. (2003). The role of T lymphocytes in the pathogenesis of asthma. J Allergy Clin Immunol 111(3): ; quiz 464.

34 Lommatzsch, M., et al. (2006). The course of allergen-induced leukocyte infiltration in human and experimental asthma. J Allergy Clin Immunol 118(1): Mazzarella, G., et al. (2000). Th1/Th2 lymphocyte polarization in asthma. Allergy 55 Suppl 61: 6-9. Piggott, A. M. and P. Karuso (2005). 9-Hydroxyfurodysinin-O-ethyl lactone: a new sesquiterpene isolated from the tropical marine sponge Dysidea arenaria. Molecules 10(10): Rodrigues, A. M., et al. (2015). Clinical characteristics of children and adolescents with severe therapy-resistant asthma in Brazil. J Bras Pneumol 41(4): Rosenberg, S. L., et al. (2014). Stress and asthma: novel insights on genetic, epigenetic, and immunologic mechanisms. J Allergy Clin Immunol 134(5): Voehringer, D., et al. (2004). "Type 2 immunity reflects orchestrated recruitment of cells committed to IL-4 production. Immunity 20(3): Weigmann, B. and M. F. Neurath (2002). T-bet and mucosal Th1 responses in the gastrointestinal tract. Gut 51(3): Yang, D. H., et al. (2003). [A case of enteropathy-associated T-cell lymphoma presenting with recurrent hematochezia]. Korean J Gastroenterol 42(6): Yang, I. V. and D. A. Schwartz (2012). Epigenetic mechanisms and the development of asthma. J Allergy Clin Immunol 130(6): *Yong, S. B., et al. (2013). Influence and mechanisms of maternal and infant diets on the development of childhood asthma. Pediatr Neonatol 54(1): *Zuo, L., et al. (2013). Molecular mechanisms of reactive oxygen species-related pulmonary inflammation and asthma. Mol Immunol 56(1-2):