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1 生 命 科 学 导 论 -- 生 物 技 术 与 生 命 科 学 Introduction of Life Science-Biotechnology in Life Science 蛋 白 质 工 程 Dr. Xiaodong Zheng Institute of Immunology 1

2 需 求 促 进 科 技 的 进 步 糖 尿 病 ILETIN (1923) Humulin (1982) 胰 岛 素 的 发 现 及 发 明 2

3 血 糖 与 胰 岛 素 3

4 天 然 胰 岛 素 的 代 谢 曲 线 4

5 蛋 白 工 程 胰 岛 素 的 代 谢 曲 线 5

6 蛋 白 质 工 程 的 产 生 --- 医 药 需 求 蛋 白 质 药 物 的 稳 定 性 改 变 半 衰 期 不 良 反 应 medication 6

7 蛋 白 质 工 程 的 产 生 --- 工 业 需 求 热 稳 定 性 化 学 稳 定 性 压 力 稳 定 性 催 化 效 率 Catalyst for industries 7

8 蛋 白 质 工 程 一 蛋 白 质 工 程 的 定 义 及 概 况 二 蛋 白 质 工 程 研 究 内 容 三 蛋 白 质 工 程 的 应 用 8

9 蛋 白 质 工 程 一 蛋 白 质 工 程 的 定 义 及 概 况 二 蛋 白 质 工 程 研 究 内 容 三 蛋 白 质 工 程 的 应 用 9

10 蛋 白 质 工 程 以 蛋 白 质 分 子 的 结 构 规 律 及 其 生 物 功 能 的 关 系 作 为 基 础, 通 过 化 学 物 理 和 分 子 生 物 学 的 手 段 进 行 基 因 修 饰 或 基 因 合 成, 对 现 有 蛋 白 质 进 行 改 造, 或 制 造 一 种 新 的 蛋 白 质, 以 满 足 人 类 对 生 产 和 生 活 的 需 求 也 称 为 第 二 代 基 因 工 程 工 程 化 : 理 念 - 设 计 - 制 造 - 功 能 实 现 10

11 蛋 白 质 工 程 的 历 史 工 欲 善 其 事, 必 先 利 其 器! 论 语 11

12 Thomas Morgan 1933 Francis Crick, James Watson, 1962 Robert Holley, Gobind Khorana, Marshall Nirenberg,

13 Severo Ochoa, 1959, Synthesis of DNA Werner Arber,1978, restriction enzymes 13 Frederick Sanger,1980, DNA Sequencing

14 Paul Berg, 1980, recombinant-dna Kary B. Mullis, 1993, PCR Michael Smith,1993, Point mutation 14

15 Frederick Sanger, 1958, Structure of insulin Gerald M. Edelman,1972, Antibody structure Bruce Merrifield, 1984, Peptide Synthesis 15

16 M. F. Perutz, J. C. Kendrew, 1962, structure of hemoglobin and myoglobin D. C. Hodgkin, 1964, structure of penicillin and insulin Herbert A. Hauptman, Jerome Karle, 1985, X- Ray Crystal J. Deisenhofer, R. Huber and H. Michel, 1988, protein structures crucial to photosynthesis John B. Fenn, Koichi Tanaka, Kurt Wüthrich, 2002, Mass and NMR 16

17 蛋 白 质 工 程 产 生 的 标 志 1982 年,Winter 等 首 次 报 道 了 通 过 基 因 定 点 突 变 获 得 改 性 的 酪 氨 酸 trna 合 成 酶 (Nature,299,1982) 1983 年, 美 国 的 Ulmer 在 Science 上 首 先 提 出 了 Protein Engineering 蛋 白 质 工 程 诞 生 (Science, 219: ) 17

18 The prospects for protein engineering, including the roles of x-ray crystallography, chemical synthesis of DNA, and computer modelling of protein structure and folding, are discussed. ---Deliberate design and production of proteins with novel or altered structure and properties, that are not found in natural proteins. Ulmer, K. M. (1983) Protein Engineering, Science, 219:

19 蛋 白 质 工 程 一 蛋 白 质 工 程 的 定 义 及 概 况 二 蛋 白 质 工 程 研 究 内 容 三 蛋 白 质 工 程 的 应 用 19

20 蛋 白 质 工 程 的 研 究 内 容 蛋 白 质 结 构 分 析 基 础 结 构 和 功 能 的 设 计 和 预 测 应 用 与 验 证 创 造 或 改 造 蛋 白 质 目 标 20

21 一 蛋 白 质 结 构 分 析 蛋 白 质 是 由 许 多 不 同 L- - 氨 基 酸 (20 种 ) 按 一 定 序 列 通 过 酰 胺 键 ( 肽 键 ) 缩 合 而 成 的 具 有 稳 定 构 象 并 具 有 一 定 生 物 功 能 的 生 物 大 分 子 蛋 白 质 是 一 切 生 命 活 动 的 具 体 执 行 者 DNA 携 带 蛋 白 质 的 信 息, 蛋 白 质 使 生 命 得 以 实 现 21

22 蛋 白 质 是 生 命 活 动 的 载 体 和 执 行 者 免 疫 防 御 运 动 药 物 细 胞 生 长 信 号 转 导 酶 22

23 蛋 白 质 的 组 成 --- 氨 基 酸 1. 均 为 氨 基 酸, 各 种 氨 基 酸 的 侧 链 R 各 不 相 同 2. -C 原 子 上 均 连 有 一 个 氨 基 ( 脯 氨 酸 除 外 ) 3. -C 原 子 为 不 对 称 (L 手 性 ) 碳 原 子 ( 甘 氨 酸 除 外 ) 23

24 蛋 白 质 的 组 成 --- 氨 基 酸 24

25 氨 基 酸 的 编 码 25

26 蛋 白 质 的 组 成 --- 肽 26

27 蛋 白 质 的 一 级 结 构 每 一 种 蛋 白 质 分 子 都 有 自 己 特 有 的 氨 基 酸 的 组 成 和 排 列 顺 序 即 一 级 结 构, 蛋 白 质 的 一 级 结 构 决 定 了 蛋 白 质 的 特 定 的 空 间 结 构? 27

28 镰 刀 形 红 细 胞 贫 血 谷 氨 酸 缬 (xie) 氨 酸 28

29 蛋 白 质 的 二 级 结 构 蛋 白 质 多 肽 链 本 身 的 折 叠 和 盘 绕 的 方 式 主 要 有 α- 螺 旋 β- 折 叠 β- 转 角 螺 旋 折 叠 α- 螺 旋 : 肽 链 主 链 绕 假 想 的 中 心 轴 盘 绕 成 螺 旋 状, 一 般 都 是 右 手 螺 旋 结 构, 螺 旋 是 靠 链 内 氢 键 维 持 每 圈 螺 旋 由 3.6 个 氨 基 酸 构 成 β- 折 叠 : 两 段 以 上 的 β- 折 叠 结 构 平 行 排 布 并 以 氢 键 相 连 所 形 成 的 结 构 称 为 β- 片 层 或 β- 折 叠 层 β- 片 层 可 分 顺 向 平 行 ( 肽 链 的 走 向 相 同, 即 N C 端 的 方 向 一 致 ) 和 逆 向 平 行 ( 两 肽 段 走 向 相 反 ) 结 构 29

30 蛋 白 质 的 二 级 结 构 蛋 白 质 分 子 中, 肽 链 经 常 会 出 现 180 的 回 折, 在 这 种 回 折 角 处 的 构 象 就 是 - 转 角 没 有 确 定 规 律 性 的 部 分 肽 链 构 象, 肽 链 中 肽 键 平 面 不 规 则 排 列, 属 于 松 散 的 无 规 卷 曲 30

31 蛋 白 质 的 三 / 四 级 结 构 蛋 白 质 的 多 肽 链 在 各 种 二 级 结 构 的 基 础 上 再 进 一 步 盘 曲 或 折 迭 形 成 具 有 一 定 规 律 的 三 维 空 间 结 构, 称 为 三 级 结 构 具 有 二 条 或 二 条 以 上 独 立 三 级 结 构 的 多 肽 链 组 成 的 蛋 白 质, 其 多 肽 链 间 通 过 非 共 价 键 相 互 组 合 而 形 成 的 空 间 结 构 称 为 四 级 结 构 胰 岛 素 的 三 级 结 构 31

32 32

33 33

34 蛋 白 质 结 构 解 析 技 术 -- 测 序 DNA 自 动 测 序 仪 氨 基 酸 自 动 测 序 仪 34

35 DNA 测 序

36 氨 基 酸 测 序 Edman 降 解 法 是 异 硫 氰 酸 苯 酯 (PITC) 在 弱 碱 条 件 下 与 蛋 白 质 N 端 α- 氨 基 偶 联 生 成 苯 氨 基 硫 甲 酰 肽 (PTC- 蛋 白 质 ), 然 后 在 无 水 强 酸 (TFA) 条 件 下,N 端 的 第 一 个 残 基 从 完 整 的 蛋 白 链 上 以 2- 苯 氨 基 噻 唑 啉 酮 (ATZ-AA) 的 形 式 裂 解 下 来, 进 而 转 化 为 更 加 稳 定 的 苯 基 乙 内 酰 硫 脲 衍 生 物 (PTH-AA), 生 成 的 PTH-AA 输 送 至 高 效 液 相 色 谱 中 进 行 在 线 分 析, 剩 下 的 多 肽 蛋 白 样 品 可 反 复 进 行 上 述 处 理, 依 次 生 成 各 种 PTH-AA, 经 液 相 系 统 色 谱 柱 分 离 可 以 确 定 被 测 多 肽 蛋 白 36质 供 试 品 N 端 的 氨 基 酸 排 列 顺 序

37 蛋 白 质 结 构 解 析 技 术 -- 质 谱

38 蛋 白 质 结 构 解 析 技 术 蛋 白 晶 体 与 X-ray 衍 射 38

39 蛋 白 质 结 构 解 析 技 术 核 磁 共 振 技 术 39

40 生 物 信 息 学 分 析 ExPASy Prosite SWISS-PROT PIR SWISS-MODEL Uniprot 40

41 二 结 构 和 功 能 的 设 计 和 预 测 实 验 验 证 41

42 三 创 造 或 改 造 蛋 白 质 蛋 白 质 工 程 基 因 DNA 合 成 转 录 翻 译 氨 基 酸 多 肽 链 分 子 设 计 合 成 蛋 白 质 三 维 结 构 预 期 功 能 生 物 学 功 能 生 物 学 中 心 法 则 反 向 生 物 学 对 天 然 蛋 白 质 进 行 改 造 完 全 重 建 新 的 蛋 白 质 42

43 改 造 蛋 白 质 个 别 氨 基 酸 的 替 换 : 定 点 突 变 功 能 域 的 改 变 : 区 域 拼 接 43

44 定 点 突 变 --PCR 法 44

45 The Nobel Prize in Chemistry 1993 Michael Smith "for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry " 45

46 区 域 拼 接 人 源 化 抗 体 改 造 46

47 改 造 蛋 白 质 结 构 的 流 程 分 离 纯 化 目 标 蛋 白 质 蛋 白 质 的 一 级 结 构 蛋 白 质 的 三 维 结 构 及 结 构 与 功 能 的 关 系 分 离 纯 化 表 达 的 蛋 白 质 分 析 功 能 和 评 价 是 否 达 到 设 计 目 的 根 据 三 维 结 构 结 构 与 功 能 的 关 系 及 蛋 白 质 改 造 的 目 的 设 计 改 造 方 案 改 造 后 的 基 因 在 宿 主 细 胞 中 表 达 对 目 的 基 因 定 点 突 变 根 据 蛋 一 级 结 构 设 计 引 物 克 隆 目 的 基 因 47

48 蛋 白 质 全 新 设 计 是 在 人 们 认 识 蛋 白 质 掌 握 其 结 构 规 律 并 了 解 其 结 构 功 能 关 系 的 基 础 上 进 行 的 它 的 目 的 是 人 工 创 造 出 自 然 界 中 不 存 在 的 蛋 白 质 分 子, 使 之 具 有 人 们 所 需 要 的 特 殊 结 构 和 功 能, 为 人 类 所 利 用 常 用 的 方 法 : 模 块 设 计 合 成 单 一 二 级 结 构 单 元 ( 螺 旋 或 折 叠 ) 作 为 多 肽 链 的 片 段 的 模 块 途 径, 然 后 复 制 这 些 二 级 结 构 片 段 并 把 它 们 连 接 为 整 个 蛋 白 质 的 结 构 48

49 蛋 白 质 工 程 一 蛋 白 质 工 程 的 定 义 及 概 况 二 蛋 白 质 工 程 研 究 内 容 三 蛋 白 质 工 程 的 应 用 49

50 蛋 白 质 工 程 的 应 用 -- 胰 岛 素 天 然 胰 岛 素 的 缺 点 : 在 高 于 生 理 浓 度 (10-8 ~10-10 mol/l) 自 身 聚 合 [ 药 用 浓 度 > 10-4 mol/l] 发 挥 生 理 功 能 需 要 单 体 形 式 与 专 一 受 体 结 合 半 衰 期 短 : 皮 下 注 射 2-4 个 小 时 起 效 时 间 长 : 皮 下 注 射 后 小 时 开 始 生 效,2-3 小 时 作 用 达 高 峰, 维 持 时 间 5-7 小 时 目 标 : 研 制 以 单 体 存 在 的 胰 岛 素, 起 效 时 间 短, 或 半 衰 期 长 50

51 胰 岛 素 的 改 造 Ala 丙 氨 酸 Pro 脯 氨 酸 Lys 赖 氨 酸 Asp 天 冬 氨 酸 Arg 精 氨 酸 51

52 胰 岛 素 的 使 用 52

53 蛋 白 质 工 程 的 应 用 --EPO TIW: thrice weekly QW: either weekly Q2W :every other week 53

54 蛋 白 质 工 程 的 应 用 -- 人 源 化 抗 体 抗 体 由 2 条 重 链 (H 链 ) 和 2 条 轻 链 (L 链 ) 组 成 链 间 由 二 硫 键 和 非 共 价 键 联 结 54

55 抗 体 的 功 能 55

56 人 源 化 抗 体 56

57 57

58 工 程 抗 体 是 疾 病 治 疗 的 重 磅 炸 弹 Name Lead company Molecule type Approved indication(s) 2014 worldwide sales ($ millions) Humira AbbVie mab RA, juvenile RA, Crohn's disease, PA, psoriasis, ankylosing spondylitis, UC, Behçet syndrome 12, Sovaldi Gilead Sciences Small molecule Hepatitis C (antiviral) 10, Enbrel Amgen Protein RA, psoriasis, ankylosing spondylitis, PA, juvenile RA 8, Lantus (insulin Sanofi glargine injection) Peptide Diabetes mellitus, type I; diabetes mellitus, type II 8, Rituxan (rituximab) Roche mab RA, chronic lymphocytic leukemia/small cell lymphocytic lymphoma, NHL, antineutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis, indolent NHL, diffuse large B-cell lymphoma 7, Remicade (infliximab) Avastin (bevacizumab) Herceptin (trastuzumab) Johnson & Johnson Roche mab mab RA, Crohn's disease, psoriasis, UC, ankylosing spondylitis, Behçet syndrome, PA 7, Colorectal cancer, breast cancer, non-small cell lung cancer, renal cell cancer, ovarian cancer, brain cancer (malignant glioma; AA 7, and GBM), cervical cancer Roche mab Breast cancer, gastric cancer 6, Revlimid Celgene Small molecule Multiple myeloma, myelodysplastic syndrome, mantle cell lymphoma (NHL) 4, Gleevec (imatinib mesylate) Novartis Small molecule Chronic myelogenous leukemia, gastrointestinal stromal tumor, acute lymphocytic leukemia, hypereosinophilic syndrome, 4, mastocytosis, dermatofibrosarcoma protuberans, myelodysplastic 58 syndrome, myeloproliferative disorders

59 蛋 白 质 工 程 的 应 用 --T4 溶 菌 酶 采 用 点 突 变 的 方 法, 将 T4 溶 菌 酶 的 N 端 的 第 三 个 氨 基 酸 Ile( 异 亮 氨 酸 ) 变 为 Cys( 半 胱 氨 酸 ), 并 进 一 步 氧 化 生 成 59 Cys(3)-Cys(97) 二 硫 键, 使 酶 热 稳 定 性 提 高

60 60

61 蛋 白 质 工 程 的 应 用 --GFP 61

62 GFP 的 应 用 GFP 转 染 的 血 管 GFP 蛋 白 GFP 转 基 因 鼠 62

63 GFP 的 改 造 荧 光 强 度 提 高 50 倍 63

64 GFP 的 改 造 64

65 The Nobel Prize in Chemistry 2008 Osamu Shimomura Martin Chalfie Roger Y. Tsien "for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP". 65

66 自 然 界 的 蛋 白 质 工 程 朊 病 毒 朊 (ruan) 66

67 Kuru 病 Carleton Gajdusek 葛 吉 谢 克 - 加 德 赛 克 Unconventional Viruses and the Origin and Disappearance of Kuru 67

68 狂 牛 的 复 仇 疯 牛 病 羊 瘙 痒 症 Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science.1982, Apr 9; 216(4542): Stanley B. Prusiner 68

69 朊 病 毒 朊 病 毒 是 一 类 能 侵 染 动 物 并 在 宿 主 细 胞 内 复 制 的 无 / 弱 免 疫 原 性 疏 水 蛋 白 质 大 小 只 有 30-50nm, 电 镜 下 见 不 到 病 毒 粒 子 的 结 构 ; 对 物 理 因 素, 化 学 试 剂 生 化 试 剂 和 蛋 白 酶 K, 表 现 出 抗 性 对 尿 素 苯 酚 氯 仿 等 不 具 抗 性 朊 病 毒 本 质 上 是 具 有 感 染 性 的 蛋 白 质 PrP 69

70 朊 病 毒 的 结 构 PrPc(c 代 表 细 胞 cellular) 为 表 达 于 细 胞 膜 上 的 蛋 白 PrPc 正 常 结 构 为 4 个 螺 旋 结 构, 由 于 不 明 原 因 使 其 中 两 个 螺 旋 结 构 异 构 为 折 叠 结 构, 变 成 具 有 感 染 性 的 因 子 PrPsc(sc 代 表 Scrapie) PrPsc 无 法 被 正 常 的 蛋 白 酶 分 解, 堆 积 在 脑 组 织 中, 引 起 神 经 细 胞 凋 亡 PrPc PrPsc 70

71 朊 病 毒 的 复 制 71

72 朊 病 毒 病 由 朊 病 毒 引 起 的 病 统 称 朊 病 毒 病, 它 们 都 为 致 死 性 中 枢 神 经 系 统 的 慢 性 退 化 性 脑 病, 其 病 理 学 的 特 点 是 淀 粉 样 斑 沉 积, 大 脑 皮 层 的 神 经 元 细 胞 退 化 丢 失, 空 泡 变 性 死 亡 消 失, 最 终 被 空 泡 和 星 状 细 胞 取 代, 因 而 造 成 海 绵 状 态 -- 大 脑 皮 层 ( 灰 质 ) 变 薄 而 白 质 相 对 明 显, 即 海 绵 脑 病 目 前 发 现 的 人 和 动 物 因 感 染 朊 病 毒 所 致 的 疾 病 包 括 : 震 颤 病 或 库 鲁 (Kuru) 病 克 雅 氏 病 (CJD) 或 称 为 早 老 性 痴 呆 吉 斯 综 合 症 致 死 性 家 族 失 眠 症 羊 瘙 痒 症 牛 海 绵 脑 病 (BSE) 即 疯 牛 病 等 72

73 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1976 D. Carleton Gajdusek for their discoveries concerning new mechanisms for the origin and dissemination of infectious diseases" 73

74 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1997 Stanley B. Prusiner "for his discovery of Prions - a new biological principle of infection 74

75 朊 病 毒 病 的 预 防 朊 病 毒 病 的 预 防 的 关 键 是 切 断 传 播 途 径!! 75

76 朊 病 毒 -- 中 心 法 则 的 例 外 中 心 法 则 是 遗 传 信 息 在 细 胞 内 的 生 物 大 分 子 间 转 移 的 基 本 法 则 遗 传 信 息 的 转 移 包 括 核 酸 分 子 间 的 转 移 核 酸 和 蛋 白 质 分 子 间 的 76 转 移

77 问 题 解 答 查 阅 wikipedia, 我 发 现 有 许 关 于 衰 老 发 生 的 假 说, 如 : 基 因 内 建 的 机 制 或 者 生 物 过 程 (Biological processes) 所 累 积 的 损 伤, 我 认 为 是 生 物 体 内 的 自 由 基 所 决 定 的, 哪 一 种 理 论 在 目 前 看 来 是 比 较 准 确 的 呢? 77

78 衰 老 的 原 因 端 粒 的 长 短 自 由 基 的 积 累 线 粒 体 代 谢 异 常 基 因 78

79 端 粒 端 粒 (Telomere) 是 真 核 细 胞 染 色 体 末 端 的 特 殊 结 构 端 粒 有 重 要 的 生 物 学 功 能, 可 稳 定 染 色 体 的 功 能, 防 止 染 色 体 DNA 降 解 末 端 融 合, 保 护 染 色 体 结 构 基 因 DNA, 调 节 正 常 细 胞 生 长 正 常 细 胞 由 于 线 性 DNA 复 制 5' 末 端 消 失, 随 体 细 胞 不 断 增 殖, 端 粒 逐 渐 缩 短, 当 细 胞 端 粒 缩 至 一 定 程 度, 细 胞 停 止 分 裂, 处 于 静 止 状 态 故 有 人 称 端 粒 为 正 常 细 胞 的 分 裂 钟, 端 粒 长 短 和 稳 定 性 决 定 了 细 胞 寿 命, 并 与 细 胞 衰 老 和 癌 变 密 切 相 关 端 粒 酶 是 使 端 粒 延 伸 的 反 转 录 DNA 合 成 酶 79

80 端 粒 长 度 与 衰 老 80

81 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2009 Elizabeth H. Blackburn Carol W. Greider Jack W. Szostak "for the discovery of how chromosomes are protected by telomeres and the enzyme telomerase". 81

82 82

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untitled 01 1-1 1-2 1-3 21 21 1-1 (biotechnology) Karl Ereky 1917 2 CHAPTER 1 1-2 19 1. 2. 3. DNA 1-1 3 1-1 1844 Herr Carl Nageli 1866 Gregor Mendel 1870 Theodor Schwann 1889 Altman 1905 Nettie Stevens 1913 Alfred

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