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1 中 國 畜 牧 學 會 會 誌,41(1):47~57, 2012 急 性 熱 緊 迫 對 囓 齒 類 動 物 生 精 細 胞 之 影 響 (1) 王 思 涵 (1) 唐 品 琦 (1)(2) 黃 三 元 摘 要 : 生 精 作 用 是 精 原 細 胞 分 化 形 成 精 子 的 一 連 串 複 雜 過 程, 過 去 的 研 究 指 出 短 暫 高 溫 會 對 成 年 雄 性 動 物 睪 丸 造 成 部 分 或 完 全 不 育, 在 囓 齒 類 動 物 受 急 性 熱 緊 迫 後 觀 察 各 階 段 生 精 細 胞, 可 發 現 精 母 細 胞 受 熱 緊 迫 影 響 最 嚴 重, 對 熱 較 敏 感 之 精 母 細 胞 受 熱 緊 迫 後 會 進 行 內 在 細 胞 凋 亡 (intrinsic apoptosis) 此 外, 熱 緊 迫 使 生 精 細 胞 之 DNA 損 傷 程 度 提 高, 附 睪 內 精 子 DNA 的 完 整 性 也 相 對 降 低, 連 帶 改 變 睪 丸 mrna 和 蛋 白 質 的 表 現, 這 些 基 因 和 蛋 白 質 被 認 為 和 精 子 形 成 分 化 細 胞 週 期 抗 緊 迫 有 關, 顯 示 熱 緊 迫 影 響 基 因 之 轉 錄 和 轉 譯, 進 而 干 擾 生 精 作 用 之 進 行 在 精 子 形 成 階 段 受 到 熱 緊 迫 時, 精 母 細 胞 雖 可 分 化 成 具 受 精 能 力 的 精 子, 但 所 形 成 精 子 之 濃 度 存 活 率 和 直 線 前 進 活 力 皆 有 下 降 的 趨 勢, 且 會 造 成 囊 胚 的 不 正 常 發 育 ; 熱 緊 迫 還 會 引 起 氧 化 緊 迫 以 及 血 睪 障 壁 受 損 為 抵 抗 熱 緊 迫 所 帶 來 的 傷 害, 睪 丸 細 胞 可 藉 由 增 加 熱 緊 迫 蛋 白 質 ( 如 HSP32 HSP40 HSP70) 以 及 抗 氧 化 緊 迫 蛋 白 質 ( 如 榖 胱 甘 肽 過 氧 化 酶 榖 胱 甘 肽 硫 轉 移 酶 和 非 對 偶 蛋 白 2) 作 為 防 禦 機 制 以 保 護 細 胞 綜 而 言 之, 熱 緊 迫 將 影 響 生 精 細 胞 之 DNA 完 整 性 改 變 基 因 轉 錄 和 轉 譯 表 現, 使 凋 亡 細 胞 數 增 加 精 子 濃 度 和 活 力 降 低 以 及 囊 胚 發 育 異 常, 進 而 導 致 繁 殖 力 的 下 降 ; 然 而 生 精 細 胞 在 熱 緊 迫 下 會 提 高 熱 緊 迫 蛋 白 質 及 抗 氧 化 緊 迫 相 關 蛋 白 質 之 表 現, 以 保 護 細 胞 免 於 熱 緊 迫 所 帶 來 的 傷 害 ( 關 鍵 語 : 急 性 熱 緊 迫 囓 齒 類 生 精 細 胞 ) 緒 言 生 精 作 用 (Spermatogenesis) 是 指 精 原 細 胞 (spermatogonium) 經 減 數 分 裂 (meiosis) 和 分 化 最 終 形 成 精 子 (spermatozoon) 之 一 連 串 複 雜 過 程 以 小 鼠 為 例, 精 原 細 胞 有 三 種 類 型, 分 別 是 dark Type A(Ad) pale Type A(Ap) 以 及 Type B(B)(Hess, 1999) Ad 型 精 原 細 胞 有 較 深 色 的 細 胞 核, 會 不 斷 自 我 複 製 ;Ap 型 精 原 細 胞 則 有 較 淺 色 的 細 胞 核, 經 由 一 連 串 的 有 絲 分 裂 形 成 B 型 精 原 細 胞 B 型 精 原 細 胞 隨 後 形 成 初 級 精 母 細 胞 (primary spermatocyte), 初 級 精 母 細 胞 在 第 一 次 減 數 (1) 國 立 中 興 大 學 動 物 科 學 系,402 台 中 市 國 光 路 250 號 (2) 通 訊 作 者,syhuang@dragon.nchu.edu.tw

2 48 中 國 畜 牧 學 會 會 誌 第 41 卷 第 1 期 分 裂 前 期 (prophase) 的 過 程 中, 又 可 依 階 段 略 分 為 細 絲 期 精 母 細 胞 (leptotene spermatocyte) 偶 絲 期 精 母 細 胞 (zygotene spermatocyte) 以 及 粗 絲 期 精 母 細 胞 (pachytene spermatocyte); 粗 絲 期 精 母 細 胞 會 進 行 第 一 次 減 數 分 裂 而 形 成 次 級 精 母 細 胞 (second spermatocyte), 次 級 精 母 細 胞 緊 接 著 進 行 第 二 次 減 數 分 裂 並 形 成 圓 形 精 細 胞 (round spermatid), 圓 形 精 細 胞 於 精 子 形 成 (spermiogenesis) 階 段 會 分 化 成 長 形 精 細 胞 (elongated spermatid) 並 且 趨 向 成 熟 最 終 形 成 精 子 (Hess, 1999) 以 小 鼠 為 例, 精 原 細 胞 形 成 精 子 所 需 時 間 約 為 60 天, 初 級 精 母 細 胞 變 成 精 子 需 費 時 約 28 天, 圓 形 精 細 胞 成 為 精 子 需 要 約 14 天, 長 形 精 細 胞 成 熟 形 成 精 子 約 需 7 天 (Pérez-Crespo et al., 2008) 多 數 哺 乳 動 物 睪 丸 位 於 體 外 之 陰 囊 內, 陰 囊 溫 度 較 體 溫 低 2-8, 可 進 行 正 常 的 生 精 作 用 (Harrison and Weiner, 1949) 目 前 已 知 雄 性 動 物 常 處 於 高 溫 環 境 中, 除 睪 丸 重 量 減 輕 外, 其 繁 殖 能 力 亦 下 降, 甚 至 造 成 不 育 (Wettemann et al., 1976; Hand et al., 1979; Mieusset et al., 1995) 溫 度 過 高 所 引 起 的 熱 緊 迫 又 分 為 短 期 的 急 性 熱 緊 迫 以 及 長 期 的 慢 性 熱 緊 迫, 目 前 有 關 熱 緊 迫 對 雄 性 繁 殖 力 之 影 響 多 以 囓 齒 類 動 物 為 模 式, 於 麻 醉 狀 態 下 將 其 睪 丸 浸 於 C 的 熱 水 浴 中 進 行 min 急 性 熱 緊 迫 本 文 將 闡 述 以 小 鼠 及 大 鼠 作 為 動 物 模 式 研 究 急 性 熱 緊 迫 對 哺 乳 動 物 生 精 細 胞 之 影 響 一 急 性 熱 緊 迫 對 生 精 細 胞 之 影 響 ( 一 ) 急 性 熱 緊 迫 對 生 精 細 胞 形 態 之 影 響 Zhu et al. (2006) 將 小 鼠 進 行 42 C 熱 緊 迫 處 理 後, 在 不 同 恢 復 時 間 點 採 睪 丸 組 織 作 切 片, 觀 察 睪 丸 細 胞 之 整 體 形 態 在 正 常 睪 丸 中, 精 原 細 胞 和 精 母 細 胞 在 生 精 小 管 近 基 底 膜 處, 精 細 胞 和 精 子 則 位 於 接 近 管 腔 處, 小 鼠 睪 丸 經 熱 緊 迫 後 2 h 即 可 發 現 凋 亡 的 細 胞,6 h 後 精 母 細 胞 即 出 現 玻 璃 樣 變 性 或 染 色 質 高 度 濃 縮 現 象, 顯 示 精 母 細 胞 在 急 性 熱 緊 迫 後 易 發 生 病 變 甚 至 凋 亡 ; 熱 緊 迫 後 12 h 睪 丸 中 則 可 發 現 衰 退 的 精 母 細 胞 以 及 凝 固 的 精 細 胞 Rockett et al. (2001) 用 terminal deoxynucleotidyl transferase dutp nick end labeling(tunel) 觀 察 小 鼠 生 精 細 胞 受 熱 緊 迫 後 的 凋 亡 情 形, 發 現 精 母 細 胞 凋 亡 的 數 量 在 8 h 後 增 加, 由 此 可 知 高 溫 會 造 成 精 母 細 胞 的 凋 亡, 而 且 在 分 化 過 程 中 的 精 細 胞 對 高 溫 不 具 有 完 全 的 抵 抗 能 力 Pérez-Crespo et al. (2008) 發 現 當 成 熟 的 精 子 受 熱 緊 迫 時, 其 細 胞 凋 亡 已 有 明 顯 增 加, 而 精 細 胞 和 精 母 細 胞 受 熱 緊 迫 後 所 形 成 的 精 子 其 細 胞 凋 亡 亦 顯 著 提 高, 但 精 原 細 胞 受 熱 緊 迫 後 之 細 胞 凋 亡 比 例 則 與 對 照 組 無 顯 著 差 異 因 此, 精 原 細 胞 似 乎 具 有 較 佳 的 耐 熱 性, 精 子 次 之, 而 精 母 細 胞 則 相 對 最 差 ( 二 ) 由 分 子 層 次 探 討 急 性 熱 緊 迫 對 生 精 細 胞 之 影 響 急 性 熱 緊 迫 已 知 會 改 變 小 鼠 生 精 細 胞 DNA 基 因 轉 錄 和 轉 譯 小 鼠 受 熱 緊 迫 後 其 睪 丸 細 胞 染 色 質 結 構 (chromatin structure) 受 損, 精 母 細 胞 和 精 細 胞 DNA 損 傷 的 程 度 在 熱 緊 迫 後 顯 著 上 升 (Sailer et al., 1997; Banks et al., 2005), 當 DNA 單 股 或 是 雙 股 斷 裂 時, 斷 裂 處 附 近 的 組 蛋 白 羧 端 的 絲 胺 酸 殘 基 會 磷 酸 化, 形 成 γh2ax( 磷 酸 化 的 組 蛋 白 H2AX),DNA 損 傷 的 信 號 會 隨 之 傳 遞 Paul et al. (2008) 將 小 鼠 分 別 以 不 同 溫 度 (38 C 40 C 及 42 C) 處 理 後, 檢 視 γh2ax 的 表 現 量, 結 果 發 現 粗 絲 期 精 母 細 胞 經 40 C 熱 緊 迫 後 DNA 受 損 的 程 度 在 h 有 顯 著 增 加 ; 經 42 處 理 的 小 鼠, 其 精 母 細 胞 在 熱 緊 迫 3 h 後 DNA 損 傷 即 明 顯 增 加,DNA 損 傷 的 情 形 迄 第 7 天 始 有 減 緩 的 趨 勢, 且 遲 至 第 28 天, 其 DNA 損 傷 程 度 才 恢 復 至 與 正 常 組 無 異 因 此, 熱 緊 迫 會 傷 害 生 精 細 胞 DNA 結 構 與 完 整 性, 而 精 母 細 胞 受 到 的 影 響 最 為 劇 烈

3 急 性 熱 緊 迫 對 囓 齒 類 動 物 生 精 細 胞 之 影 響 49 熱 緊 迫 對 於 生 精 細 胞 基 因 及 蛋 白 質 有 何 影 響?Rockett et al. (2001) 觀 察 小 鼠 受 熱 緊 迫 前 後 其 睪 丸 mrna 的 整 體 表 現 量 差 異, 結 果 發 現, 其 中 有 21 個 基 因 之 表 現 量 在 小 鼠 受 熱 緊 迫 後 有 向 上 調 控 的 趨 勢, 包 括 緊 迫 蛋 白 質 細 胞 附 著 及 訊 息 傳 遞 等 基 因 ; 反 之, 小 鼠 睪 丸 中 參 與 DNA 重 組 和 修 復 蛋 白 質 合 成 蛋 白 質 摺 疊 細 胞 週 期 和 榖 胱 甘 肽 (glutathione) 代 謝 等 基 因 之 表 現 量 則 於 熱 緊 迫 後 減 少 ; 且 小 鼠 長 形 精 細 胞 中 使 DNA 纏 繞 更 緊 密 之 protamine 2 之 mrna 表 現 量 亦 在 熱 緊 迫 後 降 低, 此 將 不 利 於 細 胞 核 之 緻 密 度 (Iuchi et al., 2003) Zue et al. (2006) 分 析 小 鼠 受 熱 緊 迫 後 其 睪 丸 蛋 白 質 表 現, 發 現 有 108 個 蛋 白 質 點 有 顯 著 差 異, 並 鑑 定 出 其 中 37 個 蛋 白 質 身 份, 有 些 蛋 白 質 在 熱 緊 迫 30 min 後 其 表 現 量 即 明 顯 下 降, 例 如 :ATP 合 成 酶 (ATP synthase beta chain) 和 異 質 性 細 胞 核 核 糖 核 蛋 白 質 K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K, HnRNP K) 此 外,Venables and Eperon (1999) 也 發 現, 小 鼠 受 熱 緊 迫 12 h 後 其 睪 丸 蛋 白 質 的 表 現 量 亦 顯 著 降 低, 這 些 減 少 表 現 的 蛋 白 質 多 半 與 DNA binding RNA binding unfolded protein binding 和 purine nucleotide binding 相 關, 如 HnRNP 家 族 蛋 白 質 HnRNP 蛋 白 質 會 和 RNA 結 合, 參 與 RNA 剪 接, 在 生 精 作 用 扮 演 重 要 角 色, 熱 緊 迫 造 成 小 鼠 睪 丸 HnRNP 家 族 蛋 白 質 表 現 量 減 少 將 影 響 正 常 生 精 作 用 之 進 行 ( 三 ) 急 性 熱 緊 迫 引 發 生 精 細 胞 凋 亡 之 可 能 機 制 細 胞 凋 亡 路 徑 主 要 分 成 內 在 細 胞 凋 亡 (intrinsic apoptotic pathway) 路 徑 和 外 在 細 胞 凋 亡 路 徑 (extrinsic apoptotic pathway) 兩 種 (Taylor et al., 2008) 內 在 細 胞 凋 亡 路 徑 主 要 是 經 由 粒 線 體 進 行, 藉 由 B 細 胞 淋 巴 癌 因 子 2(B-cell lymphoma-2, BCL-2) 家 族 調 控 粒 線 體 的 通 透 性, 進 而 釋 放 細 胞 色 素 C (cytochrome C),BCL-2 家 族 分 為 抗 細 胞 凋 亡 蛋 白 質 (anti-apoptotic protein) 和 促 細 胞 凋 亡 蛋 白 質 (pro-apoptotic protein), 其 中 抗 凋 亡 蛋 白 質 是 BCL-2 超 家 族, 其 他 的 則 是 促 凋 亡 蛋 白 質 ( 如 : BCL-2-associated X protein, BAX;BCL-2 antagonist of cell death, BAD;BCL-2-antagonist/killer-1, BAK);BAX 和 BCL-2 形 成 二 聚 體, 當 BAX/BCL-2 的 比 值 提 升 時 會 促 進 細 胞 凋 亡 (Oltvai et al., 1993; Perlman et al., 1999) BCL-2 家 族 成 員 調 控 粒 腺 體 釋 放 細 胞 色 素 C, 而 釋 放 之 細 胞 色 素 C 與 凋 亡 蛋 白 質 活 性 因 子 結 合 後 活 化 caspase 9,caspase 9 進 一 步 活 化 caspase 3 促 使 細 胞 邁 向 凋 亡 (Taylor et al., 2008) 此 外, 凋 亡 抑 制 蛋 白 質 (inhibitor of apoptosis protein, IAP) 會 和 caspase 9 及 caspase 3 結 合 並 抑 制 其 活 性, 藉 以 阻 止 細 胞 凋 亡 ; 在 粒 線 體 中 有 第 二 粒 線 體 衍 生 蛋 白 酶 活 化 子 / 低 等 電 點 細 胞 凋 亡 結 合 蛋 白 質 直 接 抑 制 子 (second mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP-binding protein with low pi, Smac/DIABLO) 會 被 釋 放 至 細 胞 質 中, 抑 制 IAP 的 活 性, 使 細 胞 凋 亡 能 順 利 進 行 (Du et al., 2000; Verhagen et al., 2000) 外 在 細 胞 凋 亡 路 徑 是 透 過 死 亡 配 體 (death ligand) 和 細 胞 表 面 死 亡 訊 息 受 體 (death receptor) 結 合 所 引 發 的 細 胞 凋 亡 機 制 在 生 殖 細 胞 中,Fas ligand( 死 亡 配 體 之 一,Fas L) 會 和 Fas( 死 亡 訊 息 受 體 之 一,TNF 受 體 家 族 的 一 員 ) 結 合, 再 聚 合 形 成 同 分 子 三 聚 體, 和 銜 接 蛋 白 Fas-associating death domain containing protein(fadd) 結 合,FADD 一 旦 與 caspasae 8 結 合 便 會 激 活 caspase 8 被 活 化 的 caspase 8 會 水 解 BH3-interacting domain death agonist (BID), 被 水 解 的 BID (tbid) 會 移 動 至 粒 線 體, 促 使 釋 放 細 胞 色 素 C 細 胞 色 素 C 和 凋 亡 蛋 白 活 性 因 子 (apoptotic protease-activating factor-1,apaf1) 結 合 形 成 凋 亡 複 合 體 (apoptosomes) 後 活 化 caspase 9 並 誘 發 細 胞 凋 亡 (Taylor et al., 2008) Hikim et al. (2003) 曾 發 現 熱 緊 迫 大 鼠 睪 丸 中, 其 粗 絲 期 精 母 細 胞 有 caspase 9 和 caspsase 3 的 表 現 ; 若 以 腹 腔 注 射 將 caspase 抑 制 劑 注 入 小 鼠 體 內, 使 caspase 9 和 caspsase 3 的 表 現 量 受 抑 制 的 情 況 下, 則 熱 緊 迫 處 理 後 小 鼠 生 殖 細 胞 之 細 胞 凋 亡 指 數 將 顯 著 低 於 對 照 組 (Vera et al., 2005) 為

4 50 中 國 畜 牧 學 會 會 誌 第 41 卷 第 1 期 了 瞭 解 熱 緊 迫 所 引 發 生 精 細 胞 凋 亡 是 由 何 種 路 徑 所 造 成,Hikim et al. (2003) 和 Vera et al. (2004) 用 Fas L 缺 損 的 gld 小 鼠 (Fas L-defective generalized lymphoproliferative disease 小 鼠, 帶 有 缺 陷 的 Fas L, 無 法 和 Fas 結 合 ) 以 及 Fas 突 變 的 lpr cg 小 鼠 (lymphoproliferation complementing gld 突 變 小 鼠, Fas 受 體 基 因 被 改 變, 突 變 後 的 Fas 失 去 傳 遞 凋 亡 訊 息 的 能 力 ) 進 行 熱 緊 迫, 觀 察 當 阻 斷 外 在 細 胞 凋 亡 路 徑 的 情 況 下, 熱 緊 迫 是 否 會 使 生 精 細 胞 行 細 胞 凋 亡 結 果 發 現 處 於 熱 緊 迫 的 gld 小 鼠 和 lpr cg 小 鼠, 其 生 殖 細 胞 仍 有 細 胞 凋 亡 情 形, 其 粒 線 體 同 樣 會 釋 放 DIABLO 和 細 胞 色 素 C, 且 在 熱 緊 迫 前 後 的 DIABLO 和 細 胞 色 素 C 蛋 白 質 表 現 量 皆 和 正 常 小 鼠 無 差 異, 細 胞 質 中 也 無 水 解 的 tbid 產 生 (Nagata et al., 1995; Hikim et al., 2003; Vera et al., 2004), 由 此 可 知 熱 緊 迫 所 引 起 生 殖 細 胞 之 細 胞 凋 亡 並 非 由 外 在 細 胞 凋 亡 路 徑 調 控 內 在 細 胞 凋 亡 路 徑 方 面,Jia et al. (2009) 等 人 發 現 受 熱 緊 迫 的 大 鼠, 其 睪 丸 中 凋 亡 的 生 殖 細 胞 有 大 量 磷 酸 化 的 BCL2,BCL2 主 要 功 能 是 在 抑 制 內 在 細 胞 凋 亡, 磷 酸 化 的 BCL2 不 具 活 性, 因 此 無 法 抑 制 細 胞 凋 亡 在 此 同 時, 也 發 現 p38α 於 熱 緊 迫 大 鼠 睪 丸 中 的 凋 亡 細 胞 有 大 量 表 現,p38α 是 mitogen-activated protein kinase(mapk) 的 成 員 之 一, 會 因 環 境 緊 迫 發 炎 細 胞 凋 亡 和 生 長 抑 制 等 因 子 而 被 激 活, 其 功 能 在 於 抑 制 生 長 或 是 引 起 細 胞 凋 亡 (Johnson et al., 2002; Cowan et al., 2003; Wada et al., 2004) 經 由 睪 丸 注 射 方 式 將 p38α 抑 制 劑 (SB203580) 注 入 大 鼠 的 睪 丸 後 再 施 予 熱 緊 迫, 發 現 磷 酸 化 的 BCL2 降 低 細 胞 色 素 C 的 釋 放 量 減 少 以 及 細 胞 凋 亡 數 量 下 降, 因 而 確 認 熱 緊 迫 將 激 活 p38α 進 而 促 使 細 胞 色 素 C 釋 放 以 及 BCL2 的 磷 酸 化, 導 致 細 胞 走 向 凋 亡 (Jia et al., 2009) 粒 線 體 內 caspase 2 和 細 胞 色 素 C 的 釋 放 與 生 殖 細 胞 凋 亡 有 關, 在 最 初 的 生 殖 細 胞 凋 亡 中, 若 干 擾 caspase 2 的 活 化, 會 降 低 細 胞 凋 亡 的 數 量 (Robertson et al., 2002; Zheng et al., 2006) 在 熱 緊 迫 的 大 鼠 生 殖 細 胞 中 發 現 凋 亡 之 細 胞 同 時 也 表 現 caspase 2; 而 注 射 caspase 2 抑 制 劑 的 大 鼠, 其 熱 緊 迫 後 睪 丸 中 p38α 的 磷 酸 化 和 細 胞 色 素 C 的 釋 放 量 明 顯 少 於 未 處 理 組, 顯 示 受 熱 緊 迫 睪 丸 內 被 激 活 的 caspase 2 能 活 化 p38α 進 而 使 BCL2 失 去 活 性, 而 促 使 細 胞 走 向 凋 亡 (Johnson et al., 2008) Lizama et al. (2009) 發 現 鈣 蛋 白 酶 (calpain) 同 樣 參 與 熱 緊 迫 引 起 的 細 胞 凋 亡, 鈣 蛋 白 酶 是 依 鈣 蛋 白 質, 同 時 有 促 進 細 胞 凋 亡 和 抑 制 細 胞 凋 亡 的 功 能, 鈣 蛋 白 酶 2 之 mrna 表 現 量 在 熱 緊 迫 大 鼠 睪 丸 中 有 顯 著 上 升 用 合 成 的 鈣 蛋 白 酶 抑 制 劑 注 入 大 鼠 的 睪 丸, 抑 制 鈣 蛋 白 酶 的 活 性, 再 以 熱 緊 迫 處 理 後, 發 現 由 磷 酸 化 p38α 引 起 之 凋 亡 細 胞 率 有 下 降 趨 勢, 由 此 可 知 因 熱 緊 迫 而 凋 亡 的 生 精 細 胞 中, 除 了 caspase 2 能 活 化 p38α 之 外, 其 p38α 的 活 性 也 會 受 鈣 蛋 白 酶 的 調 控 二 急 性 熱 緊 迫 對 生 精 細 胞 之 繁 殖 力 及 胚 發 育 的 影 響 ( 一 ) 受 熱 緊 迫 的 各 階 段 生 精 細 胞 所 分 化 精 子 之 精 子 活 力 及 繁 殖 力 Pérez-Crespo et al. (2008) 在 小 鼠 受 熱 緊 迫 後 於 第 0 天 ( 附 睪 精 子 ) 第 7 天 ( 受 熱 緊 迫 之 長 形 精 細 胞 所 分 化 的 精 子 ) 第 14 天 ( 由 熱 緊 迫 之 精 細 胞 分 化 而 成 的 精 子 ) 第 21 天 ( 精 母 細 胞 形 成 精 細 胞 時 受 到 熱 緊 迫, 隨 後 形 成 的 精 子 ) 第 28 天 ( 受 熱 緊 迫 的 初 級 精 母 細 胞 所 形 成 的 精 子 ) 以 及 第 60 天 ( 由 熱 緊 迫 的 精 原 細 胞 所 形 成 的 精 子 ) 採 集 精 液, 觀 察 其 精 子 濃 度 存 活 率 活 力 和 直 線 前 進 活 力 ; 發 現 受 熱 緊 迫 處 理 之 小 鼠, 其 自 長 形 精 細 胞 階 段 所 分 化 之 成 熟 精 子 濃 度 和 存 活 率 都 顯 著 低 於 正 常 小 鼠, 同 樣 的 情 形 也 發 生 在 受 熱 緊 迫 之 精 母 細 胞 和 精 細 胞 ; 至 於 精 子 活 力 和 直 線 前 進 活 力, 則 以 精 細 胞 和 精 母 細 胞 受 熱 緊 迫 後 所 形 成 的 精 子 會 明 顯 降 低 Rockett et al. (2001) 的 研 究 亦 發 現 精 母 細 胞 受 熱 緊 迫 後 其 與 配 母 鼠 所 產 之 仔 鼠 數 最 少, 由 此 可 知, 熱 緊 迫 雖 然 會 影 響 各 階 段 生 精 細 胞 形

5 急 性 熱 緊 迫 對 囓 齒 類 動 物 生 精 細 胞 之 影 響 51 成 精 子 的 活 力 濃 度 及 存 活 率, 但 就 繁 殖 力 而 言 熱 緊 迫 對 精 母 細 胞 的 影 響 最 大 ( 二 ) 各 階 段 生 精 細 胞 受 熱 緊 迫 後 所 分 化 精 子 對 胚 發 育 的 影 響 受 急 性 熱 緊 迫 的 生 精 細 胞 會 帶 有 損 傷 的 DNA, 除 了 一 部 分 受 損 的 生 精 細 胞 會 進 行 細 胞 凋 亡 外, 其 它 受 損 的 生 精 細 胞 依 然 會 形 成 精 子, 但 是 其 精 子 濃 度 存 活 率 活 力 甚 至 是 仔 鼠 數 皆 會 因 熱 緊 迫 而 受 到 影 響 為 釐 清 熱 緊 迫 使 公 鼠 繁 殖 力 下 降 之 因 素,Paul et al. (2008) 分 別 在 小 鼠 受 急 性 熱 緊 迫 後 第 16 h( 熱 緊 迫 時 是 位 於 附 睪 的 成 熟 精 子 ) 與 第 23 天 ( 熱 緊 迫 時 是 精 母 細 胞 的 階 段 ) 取 其 精 子 進 行 體 外 受 精, 觀 察 其 各 胚 期 發 育 率, 發 現 源 自 熱 緊 迫 附 睪 精 子 之 受 精 卵, 其 發 育 至 二 細 胞 期 和 四 細 胞 期 之 百 分 比 與 正 常 組 間 無 異, 但 囊 胚 發 育 率 則 顯 著 下 降 ; 同 樣 的 情 形 也 發 生 在 受 熱 緊 迫 之 精 母 細 胞 試 驗 組, 但 此 處 理 組 之 受 精 卵 並 無 囊 胚 發 育 之 事 實, 由 此 推 知 受 急 性 熱 緊 迫 之 小 鼠, 其 精 子 雖 可 正 常 受 精, 並 與 正 常 小 鼠 具 相 近 之 早 期 胚 發 育 能 力, 但 囊 胚 發 育 能 力 則 嚴 重 受 阻 POU5F1 主 要 分 布 於 內 細 胞 群, 於 胚 胎 幹 細 胞 扮 演 多 功 能 (pluripotency) 的 轉 錄 因 子 ;TJP1 是 緊 密 連 結 蛋 白, 使 細 胞 之 間 得 以 緊 密 接 合, 於 囊 胚 時 存 在 於 滋 養 葉 細 胞 (Paul et al., 2008) 在 熱 緊 迫 小 鼠 體 內 的 精 母 細 胞 所 形 成 的 精 子 雖 可 使 胚 發 育, 但 胚 之 發 育 時 程 則 有 延 遲 現 象, 亦 即 由 之 所 發 育 之 桑 椹 胚 雖 均 可 表 現 POU5F1 和 TJP1, 但 卻 未 能 正 常 形 成 囊 胚, 甚 至 可 觀 察 到 POU5F1 和 TJP1 成 團 塊 狀 因 此, 熱 緊 迫 小 鼠 繁 殖 力 之 下 降 可 能 因 受 熱 緊 迫 之 生 精 細 胞 使 胚 發 育 遲 滯 或 發 育 不 正 常 所 致 三 熱 緊 迫 對 生 精 細 胞 之 間 接 影 響 ( 一 ) 熱 緊 迫 所 引 起 之 氧 化 緊 迫 活 性 氧 化 物 質 (reactive oxygen species,ros) 是 高 反 應 性 之 含 氧 物 質 及 其 衍 生 物 質, 例 如 超 氧 陰 離 子 過 氧 化 氫 及 氫 氧 自 由 基 等, 此 等 活 性 氧 化 物 質 會 由 環 境 因 子 或 生 物 系 統 產 生, 具 有 高 氧 化 能 力, 能 引 起 脂 質 和 蛋 白 質 的 過 氧 化, 或 是 造 成 DNA 的 傷 害, 由 這 些 活 性 氧 化 物 質 所 造 成 的 生 物 傷 害 稱 作 氧 化 緊 迫 (oxidative stress) 對 於 這 些 活 性 氧 化 物 質 造 成 的 氧 化 緊 迫, 體 內 有 抗 氧 化 緊 迫 的 機 制 可 以 抵 禦, 即 可 經 由 超 氧 化 物 歧 化 酶 (superoxidase dismutase) 過 氧 化 物 酶 (peroxiredoxin) 及 榖 胱 甘 肽 過 氧 化 酶 (glutathione peroxidase) 將 活 性 氧 化 物 質 分 解 成 水 (Gutteridge, 1994) 活 性 氧 化 物 質 會 因 熱 緊 迫 而 大 量 增 加, 導 致 生 精 細 胞 因 氧 化 緊 迫 而 死 亡 (Ikeda et al., 1999; Paul et al., 2009; Shiraishi et al., 2010) Iuchi et al. (2009) 將 過 氧 化 物 酶 4(Prx 4) 基 因 剔 除 (knock out) 之 小 鼠 進 行 熱 緊 迫, 發 現 基 因 剔 除 小 鼠 在 一 般 情 況 下, 其 生 精 細 胞 行 細 胞 凋 亡 高 於 非 基 因 剔 除 小 鼠, 且 經 熱 緊 迫 後 其 生 精 細 胞 的 氧 化 物 質 4-hydroxynonenal(HNE, 脂 質 過 氧 化 後 的 產 物 ) 8OHdG( 鳥 糞 嘌 呤 氧 化, 多 接 一 個 氫 氧 基 ) 有 增 加 的 趨 勢, 部 分 蛋 白 質 被 氧 化 修 飾, 細 胞 凋 亡 比 例 更 是 顯 著 高 於 正 常 小 鼠 此 外,Prx4 基 因 剔 除 小 鼠 受 熱 緊 迫 後, 其 睪 丸 精 母 細 胞 的 數 量 減 少, 附 睪 精 子 的 數 量 亦 減 少 並 出 現 圓 形 生 精 細 胞 ( 二 ) 熱 緊 迫 對 血 睪 障 壁 (blood-testis barrier) 之 影 響 血 睪 障 壁 是 由 生 精 細 管 中 的 Sertoli cell 構 成, 相 鄰 的 Sertoli cell 之 穿 膜 蛋 白 質 (integral membrane proteins) 會 形 成 緊 密 連 接 (tight junction) 之 結 構, 用 以 隔 絕 全 身 性 循 環 系 統 並 供 給 生 精 細 胞 所 需 營 養 (Dym and Fawcett, 1970; Mruk and Cheng, 2004) 熱 緊 迫 小 鼠 的 睪 丸 中 可 發 現 其 緊 密 連 接 蛋 白 質 之 mrna 和 蛋 白 質 的 表 現 量 下 降, 故 其 血 睪 障 壁 之 完 整 性 也 可 能 因 此 受 到 影 響 (Cai et al., 2011)

6 52 中 國 畜 牧 學 會 會 誌 第 41 卷 第 1 期 四 生 精 細 胞 對 熱 緊 迫 之 防 禦 機 制 ( 一 ) 熱 緊 迫 蛋 白 質 熱 緊 迫 蛋 白 質 最 初 是 從 受 到 熱 緊 迫 的 果 蠅 所 發 現, 高 度 保 留 於 原 核 以 及 真 核 生 物 中, 家 族 成 員 依 其 分 子 量 可 分 類 為 HSP110 HSP90 HSP70 HSP60 及 低 分 子 量 HSP 家 族 等, 可 保 護 及 防 止 細 胞 因 緊 迫 ( 如 熱 緊 迫 氧 化 緊 迫 及 化 學 毒 素 等 ) 所 帶 來 的 傷 害 (Ritossa, 1962; Lanks, 1986; Burdon, 1987; Johnston et al., 1998; Wigley et al., 1999; Kregel, 2002) 熱 緊 迫 蛋 白 質 基 因 在 受 熱 緊 迫 小 鼠 睪 丸 之 表 現 量 會 增 加, 如 hsp70 hspb1 hsp32 hsp40 和 hsp60; 在 C 熱 緊 迫 12 h 後,HSP60 和 heat shock 70 kda protein 4L(HSPA4L) 蛋 白 質 表 現 均 顯 著 降 低, 但 HSP70 與 伴 護 子 DnaJ homologue subfamily B member 3(DNAJB3) 表 現 量 則 增 加 ; 大 鼠 hsp32 的 mrna 和 蛋 白 質 高 量 表 現 於 熱 緊 迫 後 睪 丸 的 Sertoli cell 和 Leydig cell(maines and Ewing, 1996; Rockett et al., 2001; Zhu et al., 2006) 小 鼠 在 39 C 急 性 熱 緊 迫 下, 其 睪 丸 與 附 睪 的 HSP70 蛋 白 質 會 隨 處 理 時 間 而 增 加 其 表 現 量 (Cao et al., 2009) 熱 緊 迫 蛋 白 質 70 在 正 常 情 況 下 和 熱 緊 迫 因 子 (heat shock factor,hsf) 結 合 成 不 活 化 之 複 合 體, 一 旦 細 胞 遇 到 緊 迫 時, 細 胞 質 中 的 複 合 體 會 分 開,HSF 會 被 磷 酸 化 並 且 形 成 三 聚 體 構 形, 進 入 細 胞 核 與 DNA 上 游 啟 動 位 heat shock element(hse) 結 合, 促 使 熱 緊 迫 蛋 白 質 之 基 因 轉 錄 及 轉 譯, 新 合 成 的 熱 緊 迫 蛋 白 質 會 將 因 熱 緊 迫 而 錯 誤 折 疊 的 蛋 白 重 新 折 疊 (Kregel, 2002) 在 小 鼠 精 母 細 胞 中, 睪 丸 特 異 表 現 之 HSP70(HSP70T) 在 第 一 次 減 數 分 裂 扮 演 重 要 角 色, HSP70T 可 以 保 護 CDC2 在 G2 期 不 被 降 解, 當 CDC2 和 cyclin B1 結 合 的 同 時 HSP70T 也 會 與 CDC2 分 開,CDC2 和 cyclin B1 複 合 蛋 白 被 磷 酸 化 後 則 會 進 入 M 期, 使 減 數 分 裂 可 以 進 行,HSP70T 表 現 量 減 少 會 阻 礙 減 數 分 裂 的 進 行, 使 精 母 細 胞 的 細 胞 凋 亡 增 加 (Dix et al., 1996; Zhu et al., 1997) 在 小 鼠 行 熱 緊 迫 後, 雖 然 細 胞 凋 亡 的 數 量 增 加, 但 是 精 母 細 胞 和 精 細 胞 中 HSP70 的 表 現 量 增 加 (Rockett et al., 2001), 顯 示 在 熱 緊 迫 之 生 精 細 胞 中, 熱 緊 迫 蛋 白 質 會 提 高 表 現 以 防 禦 因 熱 緊 迫 所 帶 來 的 傷 害, 而 HSP70 更 是 抗 細 胞 凋 亡 不 可 或 缺 的 因 子 ( 二 ) 抗 氧 化 緊 迫 之 酵 素 如 前 所 述, 生 物 體 內 有 抗 氧 化 緊 迫 蛋 白 質 以 降 低 活 性 氧 化 物 質 所 造 成 的 細 胞 傷 害, 在 小 鼠 睪 丸 因 熱 緊 迫 所 引 發 的 氧 化 緊 迫, 同 樣 會 使 抗 氧 化 緊 迫 酵 素 增 加 Paul et al. (2009) 發 現 受 熱 緊 迫 小 鼠 之 榖 胱 甘 肽 過 氧 化 酶 和 榖 胱 甘 肽 硫 轉 移 酶 (glutathione S-transferase) 之 mrna 和 蛋 白 質 表 現 量 會 因 熱 緊 迫 而 增 加 榖 胱 甘 肽 過 氧 化 酶 可 將 過 氧 化 氫 分 解 成 水, 榖 胱 甘 肽 硫 轉 移 酶 則 是 藉 由 催 化 榖 胱 甘 肽 使 活 性 親 電 子 化 合 物 失 去 毒 性 因 此, 熱 緊 迫 會 額 外 引 發 氧 化 緊 迫, 為 抵 禦 活 性 氧 化 物 質, 抗 氧 化 緊 迫 酵 素 之 表 現 量 也 會 隨 之 增 加 粒 線 體 是 主 要 產 生 能 量 之 胞 器, 藉 由 電 子 傳 遞 鏈 形 成 質 子 梯 度 使 ATP 得 以 順 利 產 生, 然 而, 在 此 同 時 也 有 可 能 丟 失 電 子 而 產 生 活 性 氧 化 物 質, 在 粒 線 體 內 膜 的 非 對 偶 蛋 白 (uncoupling protein, UCP) 可 以 打 散 質 子 梯 度 以 降 低 ATP 和 活 性 氧 化 物 質 的 生 成 (Krauss et al., 2002) 睪 丸 粒 線 體 內 的 UCP 為 第 二 型 (UCP2), 在 正 常 情 況 下, 長 形 精 細 胞 有 UCP2 的 表 現, 而 在 熱 緊 迫 後 之 所 有 生 精 細 胞 皆 會 表 現 (Zhang et al., 2007) GC-2 生 殖 細 胞 株 ( 由 小 鼠 睪 丸 中 分 離 培 養 出 的 精 母 細 胞 株 ) 中 過 度 表 現 (overexpression)ucp2 可 保 護 細 胞 不 因 氧 化 緊 迫 而 造 成 細 胞 凋 亡, 因 而 可 推 斷 熱 緊 迫 時 UCP2 的 增 加 可 減 緩 額 外 產 生 之 氧 化 緊 迫 傷 害 (Zhang et al., 2007)

7 急 性 熱 緊 迫 對 囓 齒 類 動 物 生 精 細 胞 之 影 響 53 結 論 急 性 熱 緊 迫 會 造 成 哺 乳 動 物 生 精 細 胞 的 細 胞 凋 亡 增 加 DNA 結 構 受 損 mrna 和 蛋 白 質 表 現 量 改 變, 進 而 影 響 生 精 作 用 精 子 的 濃 度 和 活 力 以 及 繁 殖 力 ; 其 中, 精 母 細 胞 最 易 受 熱 緊 迫 影 響 使 得 由 之 所 產 製 胚 之 囊 胚 發 育 遲 滯 或 異 常 此 外, 熱 緊 迫 也 會 引 起 額 外 氧 化 緊 迫 以 及 降 低 血 睪 障 壁 之 完 整 性 然 而 在 生 精 細 胞 中 仍 然 有 熱 緊 迫 蛋 白 質 以 及 抗 氧 化 緊 迫 蛋 白 質 可 以 抵 禦 熱 緊 迫 所 造 成 的 傷 害 參 考 文 獻 Banks, S., S. A. King, D. S. Irvine, and P. T. Saunders Impact of a mild scrotal heat stress on DNA integrity in murine spermatozoa. Reproduction 129: Burdon, R. H Thermotolerance and the heat shock proteins. Symp. Soc. Exp. Biol. 41: Cai, H., Y. Ren, X. X. Li, J. L. Yang, C. P. Zhang, M. Chen, C. H. Fan, X. Q. Hu, Z. Y. Hu, F. Gao, and Y. X. Liu Scrotal heat stress causes a transient alteration in tight junctions and induction of TGF-β expression. Int. J. Androl. 34: Cao, W., P. Huang, L. Zhang, H. Z. Wu, J. Zhang, and F. X. Shi Acute heat stress increases HSP70 expression in the testis, epididymis and vas deferens of adult male mice. Zhonghua Nan Ke Xue 15: Cowan, K. J., and K. B. Storey Mitogen-activated protein kinases: new signaling pathways functioning in cellular responses to environmental stress. J. Exp. Biol. 206: Dix, D. J., J. W. Allen, B. W. Collins, C. Mori, N. Nakamura, P. Poorman-Allen, E. H. Goulding, and E. M. Eddy Targeted gene disruption of Hsp70-2 results in failed meiosis, germ cell apoptosis, and male infertility. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 193: Du, C., M. Fang, Y. Li, L. Li, and X. Wang Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition. Cell 102: Dym, M., and D. W. Fawcett The blood testis barrier in the rat and the physiological compartmentation of the seminiferous epithelium. Biol. Reprod. 3: Gutteridge, J. M Biological origin of free radicals, and mechanisms of antioxidant protection. Chem. Biol. Interact. 91: Hand, J. W., H. Walker, S. Hornsey, and S. B. Field Effects of hyperthermia on the mouse testis and its response to X-rays, as assayed by weight loss. Int. J. Radiat. Biol. 35: Harrison, R. G., and J. S. Weiner Vascular patterns of the mammalian testis and their functional significance. Exp. Biol. 26: Hess, R. A Spermatogenesis, overview. Page 539 in Encyclopedia of Reproduction vol. 4. Academic Press. New York. Hikim, A. P., Y. Lue, C. M. Yamamoto, Y. Vera, S. Rodriguez, P. H. Yen, K. Soeng, C. Wang, and R. S. Swerdloff Key apoptotic pathways for heat-induced programmed germ cell death in the testis.

8 54 中 國 畜 牧 學 會 會 誌 第 41 卷 第 1 期 Endocrinology 144: Ikeda, M., H. Kodama, J. Fukuda, Y. Shimizu, M. Murata, J. Kumagai, and T. Tanaka Role of radical oxygen species in rat testicular germ cell apoptosis induced by heat stress. Biol. Reprod. 61: Iuchi, Y., T. Kaneko, S. Matsuki, I. Sasagawa, and J. Fujii Concerted changes in the YB2/RYB-a protein and protamine 2 messenger RNA in the mouse testis under heat stress. Biol. Reprod. 68: Iuchi, Y., F. Okada, S. Tsunoda, N. Kibe, N. Shirasawa, M. Ikawa, M. Okabe, Y. Ikeda, and J. Fujii Peroxiredoxin 4 knockout results in elevated spermatogenic cell death via oxidative stress. Biochem. J. 419: Jia, Y., J. Castellanos, C. Wang, I. Sinha-Hikim, Y. Lue, R. S. Swerdloff, and A. P. Sinha-Hikim Mitogen-activated protein kinase signaling in male germ cell apoptosis in the rat. Biol. Reprod. 80: Johnson, C., Y. Jia, C. Wang, Y. H. Lue, R. S. Swerdloff, X. S. Zhang, Z. Y. Hu, Y. C. Li, Y. X. Liu, and A. P. Sinha-Hikim Role of caspase 2 in apoptotic signaling in primate and murine germ cells. Biol. Reprod. 79: Johnson, G. L., and R. Lapadat Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK, JNK, and p38 protein kinases. Science 298: Johnston, J. A., C. L. Ward, and R. R. Kopito Aggresomes: a cellular response to misfolded proteins. J. Cell Biol. 143: Krauss, S., C. Y. Zhang, and B. B. Lowell A significant portion of mitochondrial proton leak in intact thymocytes depends on expression of UCP2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99: Kregel, K. C Heat shock proteins: modifying factors in physiological stress responses and acquired thermotolerance. J. Appl. Physiol. 92: Lanks, K. W Modulators of the eukaryotic heat shock response. Exp. Cell Res. 165:1-10. Lizama, C., C. F. Lagos, R. Lagos-Cabré, L. Cantuarias, F. Rivera, P. Huenchuñir, T. Pérez-Acle, F. Carrión, and R. D. Moreno Calpain inhibitors prevent p38 MAPK activation and germ cell apoptosis after heat stress in pubertal rat testes. J. Cell Physiol. 221: Maines, M. D., and J. F. Ewing Stress response of the rat testis: in situ hydridization and immunohistochemical analysis of heme oxygenase-1 (HSP32) induction by hyperthermia. Biol. Reprod. 54: Mieusset, R., and L. Bujan Testicular heating and its possible contributions to male infertility: a review. Int. J. Androl. 18: Mruk, D. D. and C. Y. Cheng Sertoli sertoli and sertoli germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Endocr. Rev. 25: Nagata, S., and P. Golstein The Fas death factor. Science 267: Oltvai, Z. N., C. L. Milliman, and S. J. Korsmeyer Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved

9 急 性 熱 緊 迫 對 囓 齒 類 動 物 生 精 細 胞 之 影 響 55 homolog, Bax, that accelerates programmed cell death. Cell 74: Paul, C., A. A. Murray, N. Spears, and P. T. Saunders A single, mild, transient scrotal heat stress causes DNA damage, subfertility and impairs formation of blastocysts in mice. Reproduction 136: Paul, C., S. Teng, and P. T. Saunders A single, mild, transient scrotal heat stress causes hypoxia and oxidative stress in mouse testes, which induces germ cell death. Biol. Reprod. 80: Pérez-Crespo, M., B. Pintado, and A. Gutiérrez-Adán Scrotal heat stress effects on sperm viability, sperm DNA integrity, and the offspring sex ratio in mice. Mol. Reprod. Dev. 75: Perlman, H., X. Zhang, M. W. Chen, K. Walsh, and R. Buttyan An elevated bax/bcl-2 ratio corresponds with the onset of prostate epithelial cell apoptosis. Cell Death Differ. 6: Ritossa F A new puffing pattern induced by temperature shock and DNP in Drosophila. Experientia 18: Robertson, J. D., M. Enoksson, M. Suomela, B. Zhivotovsky, and S. Orrenius Caspase-2 acts upstream of mitochondria to promote cytochrome c release during etoposide-induced apoptosis. J. Biol. Chem. 277: Rockett, J. C., F. L. Mapp, J. B. Garges, J. C. Luft, C. Mori, and D. J. Dix Effects of hyperthermia on spermatogenesis, apoptosis, gene expression, and fertility in adult male mice. Biol. Reprod. 5: Sailer, B. L., L. J. Sarkar, J. A. Bjordahl, L. K. Jost, and D. P. Evenson Effects of heat stress on mouse testicular cells and sperm chromatin structure. J. Androl. 8: Shiraishi, K., H. Takihara, and H. Matsuyama Elevated scrotal temperature, but not varicocele grade, reflects testicular oxidative stress-mediated apoptosis. World J. Urol. 28: Taylor, R. C., S. P. Cullen, and S. J. Martin Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9: Venables, J. P., and I. Eperon The roles of RNA-binding proteins in spermatogenesis and male infertility. Curr. Opin. Genet. Dev. 9: Vera, Y., M. Diaz-Romero, S. Rodriguez, Y. Lue, C. Wang, R. S. Swerdloff, and A. P. Sinha-Hikim Mitochondria-dependent pathway is involved in heat-induced male germ cell death: lessons from mutant mice. Biol. Reprod. 70: Vera, Y., S. Rodriguez, M. Castanares, Y. Lue, V. Atienza, C. Wang, R. S. Swerdloff, and A. P. Sinha Hikim Functional role of caspases in heat-induced testicular germ cell apoptosis. Biol. Reprod. 72: Verhagen, A. M., P.G. Ekert, M. Pakusch, J. Silke, L. M. Connolly, G. E. Reid, R. L. Moritz, R. J. Simpson, and D. L. Vax Identification of DIABLO, a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing IAP proteins. Cell 102: Wada, T., and J. M. Penninger Mitogen-activated protein kinases in apoptosis regulation. Oncogene 23: Wettemann, R. P., M. E. Wells, I. T. Omtvedt, C. E. Pope, and E. J. Turman Influence of elevated

10 56 中 國 畜 牧 學 會 會 誌 第 41 卷 第 1 期 ambient temperature on reproductive performance of boars. J. Anim. Sci. 42: Wigley, W. C., R. P. Fabunmi, M. G. Lee, C. R. Marino, S. Muallem, G. N. DeMartino, and P. J. Thomas Dynamic association of proteasomal machinery with the centrosome. J. Cell Biol. 145: Zhang, K., Y. Shang, S. Liao, W. Zhang, H. Nian, Y. Liu, Q. Chen., and C. Han Uncoupling protein 2 protects testicular germ cells from hyperthermia-induced apoptosis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 360: Zheng, S., T. T. Turner, and J. J. Lysiak Caspase 2 activity contributes to the initial wave of germ cell apoptosis during the first round of spermatogenesis. Biol. Reprod. 74: Zhu, D., D. J. Dix, and E. M. Eddy HSP70-2 is required for CDC2 kinase activity in meiosis I of mouse spermatocytes. Development 124: Zhu, Y. F., Y. G. Cui, X. J. Guo, L. Wang, Y. Bi, Y. Q. Hu, X. Zhao, Q. Liu, R. Huo, M. Lin, Z. M. Zhou, and J. H. Sha Proteomic analysis of effect of hyperthermia on spermatogenesis in adult male mice. J. Proteome Res. 5:

11 J. Chin. Soc. Anim. Sic. 41(1):47~57, 2012 Effects of acute heat stress on spermatogenic cells in rodents Shih-Han Wang (1), Pin-Chi Tang (1) and San-Yuan Huang (1)(2) ABSTRACT Spermatogenesis is a complex process in which spermatogonia differentiate into spermatozoa. Previous studies showed that temporary high temperature causes partial or total infertility in males. In rodents, spermatocytes are the cells that are most severely affected by acute heat stress among the spermatogenic cells. Heat stress induces intrinsic apoptosis in the heat-sensitive spermatocytes. In addition, heat stress also results in the increase of DNA damage in spermatogenic cells. DNA integrity of spermatozoa in epididymis is also influenced by heat stress. The expression of mrna and protein of genes related to spermatogenesis, differentiation, cell cycle, and anti-apoptosis are altered in the testis of heat-stressed rodents. The observations imply that acute heat stress affects gene transcription and translation and, thus, interferes with spermatogenesis. Although heat-stressed spermatocytes are able to differentiate into sperm with fertilizing ability, the concentration of sperm, viability, and progressive motility decline and the blastocyst development becomes abnormal. Heat stress does not only induce oxidative stress but also impairs blood-testis barrier in heat-stressed rodents. To protect the testis from the damage caused by heat stress, the expression of heat-shock proteins (HSP32, HSP40, and HSP70) and anti-oxidative stress proteins (glutathione peroxidase, glutathione S-transferase, and uncoupling protein 2) are augmented in the testis after heat stress. In summary, acute heat stress affects DNA integrity, transcription and translation of genes in spermatogenic cells and results in increase of apoptosis, decrease of sperm concentration and motility, and the abnormal development of blastocysts. Furthermore, heat stress also induces oxidative stress and destruction of blood-testis barrier. To protect spermatogenic cells from heat stress, heat shock proteins and anti-oxidative proteins are increased after acute heat stress. (Key Words: Acute heat stress, Rodent, Spermatogenic cells) (1) Department of Animal Science, National Chung Hsing University, 250, Kuo Kuang Road, Taichung 40227, Taiwan, R.O.C. (2) Corresponding author, syhuang@dragon.nchu.edu.tw