引 言 高 效 液 相 色 谱 法 是 70 年 代 初 期 发 展 起 来 的 一 种 以 液 体 做 流 动 相 的 新 色 谱 分 离 技 术 其 应 用 涉 及 医 药 食 品 化 工 环 境 科 研 等 众 多 领 域 其 中, 分 离 的 核 心 是 液 相 色 谱 柱, 其 中 液 相

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1 液 相 色 谱 柱 选 择 与 使 用 报 告 人 : 张 琳 东 曹 ( 上 海 ) 生 物 科 技 有 限 公 司

2 引 言 高 效 液 相 色 谱 法 是 70 年 代 初 期 发 展 起 来 的 一 种 以 液 体 做 流 动 相 的 新 色 谱 分 离 技 术 其 应 用 涉 及 医 药 食 品 化 工 环 境 科 研 等 众 多 领 域 其 中, 分 离 的 核 心 是 液 相 色 谱 柱, 其 中 液 相 色 谱 柱 的 正 确 使 用, 是 液 相 色 谱 工 作 的 关 键 ; 也 是 液 相 色 谱 工 作 者 获 得 正 确 可 靠 的 实 验 数 据 保 证 Tosoh 公 司 生 命 科 学 部 门 在 色 谱 领 域 具 有 近 40 年 的 经 验,TSK-GEL 色 谱 柱 以 其 独 立 性 和 适 用 性 应 于 各 种 色 谱 模 式, 包 括 RPC NPC SEC IEC HIC 等, 这 里 结 合 一 些 TSK-GEL 的 一 些 产 品, 来 讨 论 一 下 液 相 色 谱 柱 选 择 与 使 用 中 的 常 见 问 题 及 解 决 方 法

3 内 容 概 要 一 液 相 色 谱 柱 的 选 择 二 液 相 色 谱 柱 的 使 用 三 常 见 问 题 及 排 除 方 法

4 一 液 相 色 谱 柱 的 选 择 HPLC 方 法 开 发 时 首 先 要 : 了 解 方 法 的 目 的 ( 分 析 制 备 等 ) 了 解 样 品 性 质 ( 极 性 酸 碱 性 等 电 点 分 子 量 溶 解 性 等 ) 选 择 合 适 的 色 谱 柱

5 液 相 色 谱 分 离 模 式 反 相 色 谱 柱 (RPC) 正 相 色 谱 柱 (NPC) 亲 水 作 用 色 谱 柱 (HILIC) 离 子 交 换 色 谱 柱 (IEC) 尺 寸 排 阻 色 谱 柱 (SEC) 凝 胶 渗 透 色 谱 / 过 滤 色 谱 柱 (GPC/GFC) 疏 水 作 用 色 谱 柱 (HIC)

6 东 曹 公 司 TSK-GEL 色 谱 柱 SEC TSKgel G2000SWXL, G3000SWXL, G2500PWXL TSK-GEL SuperMultiporePW & SuperOligoPW HPLC IEC HIC TSKgel DEAE-5PW, SuperQ-5PW, TSKgel CM-5PW, SP-5PW TSKgel DEAE-NPR, SP-NPR, DNA-NPR,STAT Series TSKgel Phenyl-5PW, Ether-5PW, Butyl-NPR HILIC TSKgel Amide-80 TSKgel NH2-100 RPC TSKgel Octadecyl-2PW, -4PW, -NPR, Phenyl-5PW RP TSKgel ODS-140 HTP 2.3 μm TSKgel ODS-100V, ODS-100Z, ODS-100S, ODS-80Ts

7 液 相 色 谱 柱 的 选 择 - 根 据 样 品 性 质 和 目 的 选 择 色 谱 柱 Molecular Weight ,000 5,000 10,000 50, , ,000 1,000,000 5,000,000 <Mode> RPC ODS-100V, ODS-100Z, ODS-100S, ODS-80T s,t M, ODS- 120T,Super-ODS, Octyl-80T s, CN-80T s, Octadecyl-2PW Octadecyl-4PW, TMS-250 Phenyl-5PW RP Octadecyl-NPR 10,000,000 NPC(HILIC) NH 2-100, NH 2-60, Amide-80 GFC IEC G2500PWXL SuperSW2000, G2000SWXL, BioAssist G2SWXL SuperSW3000, G3000SWXL, BioAssist G3SWXL Aminopak DEAE-2SW, SP-2SW, CM-2SW DEAE-3SW, CM-3SW Q-STAT, SP-STAT, CM-STAT, DEAE-NPR, SP-NPR G4000SWXL, BioAssist G4SWXL BioAssist Q, BioAssist S, SuperQ-5PW, DEAE-5PW, CM-5PW, SP-5PW G4000PWXL G5000PWXL,G6000PWXL, G-DNA-PW,LipopropakXL HIC Phenyl-5PW, Ether-5PW, BioAssist Phenyl, Butyl-NPR ,000 5,000 10,000 50, , ,000 1,000,000 5,000,000 10,000,000 Separation of Amino acids, Peptides and Proteins

8 液 相 色 谱 柱 的 选 择 - 根 据 样 品 性 质 和 目 的 选 择 色 谱 柱 DNA Base Oligonucleotide,DNA Probe,tRNA DNA Fragment,PCR Product,mRNA,Plasmid Base Base Pair ,000 5,000 10,000 50,000 <Mode> RPC ODS-100V, ODS-100Z, ODS- 100S, ODS-80T s,t M, ODS-120T, Super-ODS Oligo-DNA RP 150 base GFC SuperSW2000, G2000SWXL, BioAssist G2SWXL 80 Base Pair SuperSW3000, G3000SWXL, BioAssist G3SWXL 200 Base Pair G4000SWXL, BioAssist G4SWXL 500 Base Pair G5000PWXL G6000PWXL,G-DNA-PW 2,000 Base Pair 7,000 Base Pair IEC SP-2SW DEAE-2SW DEAE-3SW 200 Base Pair BioAssist Q, DEAE-5PW 500 Base Pair DEAE-NPR, DNA-NPR HIC BioAssist Phenyl, Phenyl-5PW Base Base Pair ,000 5,000 10,000 50,000 Separation of Nucleotides

9 液 相 色 谱 柱 的 选 择 - 根 据 样 品 性 质 和 目 的 选 择 色 谱 柱 根 据 样 品 性 质 和 目 的 选 择 色 谱 柱 Mono- Di- Oligo- Poly- Moleculer Weight ,000 5,000 <Mode> NPC NH 2-100, Amide-80 10,000 50, , ,000 1,000,000 RPC ODS-100V, ODS-100Z, ODS-100S, ODS-80T S,T M,ODS-120T,Super-ODS IEC Sugar AXI, Sugar AXG DEAE-2SW,SP-2SW BioAssist Q, BioAssist S, DEAE-5PW,SP-5PW ICX OApak-A,SCX,SAX GFC G-Oligo-PW (Nonionic) G2500PWXL (Anionic) G3000PWXL G4000PWXL G5000PWXL G6000PWXL,G-DNA PW GMPWXL Moleculer Weight ,000 5,000 10,000 50, , ,000 1,000,000 Separation of Saccharides

10 液 相 色 谱 柱 的 选 择 - 根 据 分 离 的 规 模 选 择 色 谱 柱 Scale Dimension Application area Target molecule (Particle size) Micro scale Nano 2mmI.D. ( um) Proteomics Glycomics Proteins, Peptides, Glycans Lab scale 2 10 mmi.d. ( um) R&D, QC for biopharmaceuticals Glycomics Proteins, Peptides, Glycans, Oligo nucleotides Semi-prep mmi.d. (10 20 um) Purification of biopharmaceuticals Proteins, Peptides, Oligo nucleotides Prep > 1 inch I.D. (> 20 um) Purification of biopharmaceuticals Proteins, Peptides, Oligo nucleotides

11 液 相 色 谱 柱 的 选 择 - 根 据 药 典 方 法 规 定 选 择 色 谱 柱 根 据 药 典 方 法 规 定 选 择 色 谱 柱 方 法 USP 填 料 官 能 团 填 料 粒 径 推 荐 色 谱 柱 L1 十 八 烷 基 键 合 多 孔 硅 胶 或 无 机 氧 化 物 微 粒 固 定 相 C µm TSKgel ODS-100S, 100V, 100Z, 80TS, 80TM, 120A, 120T, Super-ODS(~2µm) L3 多 孔 硅 胶 微 粒 无 3-10µm TSKgel Silica-60,150 L7 全 多 孔 硅 胶 微 粒 键 合 C8 官 能 团 固 定 相 C8 3-10µm TSKgel Octyl-80TS L8 全 多 孔 硅 胶 微 粒 键 合 非 交 联 NH2 固 定 相 NH2 10µm TSKgel Amide-80, NH2-60 L9 强 酸 性 阳 离 子 交 换 基 团 键 合 全 多 孔 不 规 则 形 硅 胶 固 定 相 阴 离 子 交 换 基 团 10µm TSKgel CM-3SW L10 多 孔 硅 胶 微 粒 键 合 氰 基 固 定 相 CN 3-10µm TSKgel CN-80TS L11 键 合 苯 基 多 孔 硅 胶 微 球 固 定 相 C6H5 5-10µm TSKgel Super-Phenyl(~2µm) L13 三 甲 基 硅 烷 化 学 键 合 全 多 孔 硅 胶 微 粒 固 定 相 三 甲 基 3-10µm TSKgel TMS-250 L14 硅 胶 化 学 键 合 强 碱 性 季 铵 盐 阴 离 子 交 换 固 定 相 阳 离 子 交 换 基 团 10µm TSKgel QAE-2SW (~5µm) L17 氢 形 磺 化 交 联 苯 乙 烯 - 二 乙 烯 基 苯 共 聚 物, 强 阳 离 子 交 换 树 脂 阳 离 子 交 换 基 团 7-11µm TSKgel SCX (~5µm) L18 多 孔 硅 胶 离 子 键 合 氨 基 和 氰 基 官 能 团 NH2/CN 5-10µm TSKgel CN-80TS, NH2-60 L20 二 羟 基 丙 烷 化 学 键 合 多 孔 硅 胶 微 球 固 定 相 二 羟 基 丙 烷 5-10µm TSK-GEL QC-PAK, SW, SW Glass, SWXL, SuperSW 系 列 色 谱 柱 (~4µm) L21 刚 性 苯 乙 烯 - 二 乙 烯 基 苯 共 聚 物 微 粒 球 无 5-10µm TSK-GEL HXL,HHR 系 列 色 谱 柱

12 液 相 色 谱 柱 的 选 择 - 根 据 药 典 方 法 规 定 选 择 色 谱 柱 根 据 药 典 方 法 规 定 选 择 色 谱 柱 方 法 USP 填 料 官 能 团 填 料 粒 径 推 荐 色 谱 柱 L22 带 有 磺 酸 基 团 的 多 孔 苯 乙 烯 阳 离 子 交 换 树 脂 阳 离 子 交 换 基 团 10µm TSKgel SP-5PW, SCX (~5µm) L23 L24 L25 L33 L34 L37 带 有 季 胺 基 团 的 聚 甲 基 丙 烯 酸 甲 酯 或 聚 丙 烯 酸 脂 多 孔 离 子 交 换 树 脂 表 面 含 有 大 量 羟 基 的 半 刚 性 聚 乙 烯 醇, 亲 水 凝 胶 聚 甲 基 丙 烯 酸 酯 树 脂 交 联 羟 基 醚 ( 表 面 含 有 残 余 羧 基 功 能 团 ) 树 脂 能 分 离 分 子 量 MW 范 围 的 水 溶 性 中 性 阳 离 子 型 及 阴 离 子 型 聚 合 物 ( 用 聚 氧 乙 烯 测 定 ) 的 固 定 相 全 多 孔 硅 胶 微 粒, 能 够 分 离 分 子 量 4,000 to 400,000MW 范 围 蛋 白 质 分 子 的 球 形 硅 胶 固 定 相, PH 稳 定 性 好 铅 形 磺 化 交 联 苯 乙 烯 - 二 乙 烯 基 苯 共 聚 物 强 阳 离 子 交 换 树 脂 适 合 分 离 分 子 量 2,000-40,000 的 聚 甲 基 丙 烯 酸 酯 凝 胶 阴 离 子 交 换 基 团 10µm TSKgel SuperQ-5PW, BioAssist Q 无 32-65µm TOYOPEARL HW 系 列 ( 可 提 供 不 同 孔 径 规 格 的 产 品 ) 无 未 指 定 TSKgel G2500PWXL, G2500PW, Alpha-2500 无 未 指 定 TSK-GEL SuperSW, QC-PAK, SWXL, SW 系 列 色 谱 柱 磺 化 基 团 9µm TSKgel SCX (~5µm) 无 未 指 定 TSKgel G3000PW,PWXL, Alpha-3000 L38 适 合 水 溶 性 样 品 的 甲 基 丙 烯 酸 酯 凝 胶 无 未 指 定 TSK-GEL PW, PWXL, Alpha 系 列 色 谱 柱 L39 亲 水 性 聚 羟 基 丙 烯 酸 酯 凝 胶, 全 多 孔 硅 胶 无 未 指 定 TSK-GEL PW, PWXL, Alpha 系 列 色 谱 柱 L47 强 阴 离 子 交 换 微 粒 基 质 阴 离 子 交 换 基 团 8µm TSKgel SP-2SW, QAE-2SW, CM-2SW, DEAE- 2SW L50 强 阳 离 子 交 换 树 脂, 带 有 磺 基 官 能 团 的 多 孔 硅 胶 磺 丙 基 5-10µm TSKgel SP-2SW

13 液 相 色 谱 柱 的 选 择 - 色 谱 柱 参 数 色 谱 柱 参 数 色 谱 柱 的 参 数 远 比 一 般 认 为 的 要 多 : 柱 长, 内 径, 例 如 250*4.6mm. 粒 径, 3um, 5um, 10um 等 孔 径,60A 60A,80A 80A,100A 100A,120A 120A 等 比 表 面 积, 180m 2 /g-350m 2 /g(ods-100v 为 450m2/g) 基 质 : 硅 胶, 聚 合 物 等 表 面 性 质 载 碳 量, 10-20%(ODS-120T 为 22%) 键 合 试 剂, C18,C8, CN 等 封 端 柱 的 物 理 性 质 柱 的 化 学 性 质

14 液 相 色 谱 柱 的 选 择 - 色 谱 柱 参 数 色 谱 柱 参 数 基 质 硅 胶 : 最 通 用 的 基 质, 强 度 大, 化 学 修 饰 容 易, 但 使 用 的 ph 值 范 围 有 限 ( 一 般 为 2-8, 特 殊 修 饰 的 可 以 使 用 到 1-12) 聚 合 物 基 质 : 化 学 稳 定, 应 用 ph 范 围 宽, 但 强 度 不 够 大 球 型 : HPLC 使 用 无 定 型 : 中 压 色 谱 使 用

15 液 相 色 谱 柱 的 选 择 - 色 谱 柱 参 数 色 谱 柱 参 数 粒 径 粒 径 越 小, 分 离 越 快, 柱 效 越 高 但 柱 压 力 越 高, 柱 容 易 被 污 染, 寿 命 低 常 规 分 析 柱 通 常 使 用 5 μm 填 料 高 通 量 分 析 ODS-140 HTP 2.3 μm 内 径 3cm 以 下 的 制 备 色 谱 柱 通 常 使 用 5-10 μm 填 料 更 大 内 径 的 制 备 色 谱 柱 通 常 使 用 更 大 的 粒 径, 如 10 μm, 或 20 μm

16 丹 参 注 射 液 对 比 分 离 色 谱 图 (TSKgel ODS-140HTP 2.3μm & TSKgel ODS-100V) TSKgel ODS-100V (4.6mmID*15cm) 3.0 μm Flow Rate: 0.7mL/min TSKgel ODS-140HTP 2.3μm (2.1mmID*10cm) Flow Rate: 0.4mL/min Gradient: 0min(B 10%) 30 min (B 35%) 55 min(b 45%) 65 min(b 95%) Column temperature 25 C Reference: Liang X M, Chinese Journal of Chromatography, 2008, 26:180 Gradient: 0min(B 5%) 7.33 min (B 30%) 18 min(b 50%) 25 min(b 95%) Column temperature 40 C No. Retention time (RSD %) Peak area (RSD %) % 1.15% % 0.92% % 3.54% % 2.42% % 2.00% % 1.42% % 4.72% % 1.34% 16

17 液 相 色 谱 柱 的 选 择 - 色 谱 柱 参 数 色 谱 柱 参 数 孔 径 孔 径 小, 含 孔 率 高, 则 比 表 面 积 大, 载 碳 量 高 化 合 物 在 孔 内 分 离 孔 径 大 小 必 须 和 分 子 大 小 相 匹 配, 分 子 必 须 能 进 入 孔 内, 一 般 小 分 子 使 用 A, 大 分 子 通 常 使 用 300A 为 了 达 到 最 佳 分 离, 一 般 要 求 孔 径 直 径 是 分 子 直 径 的 3 倍 以 上

18 液 相 色 谱 柱 的 选 择 - 色 谱 柱 参 数 色 谱 柱 参 数 比 表 面 积 每 克 填 料 的 表 面 积 与 粒 度 含 孔 率 有 关 比 表 面 积 大, 会 增 加 样 品 与 键 合 相 之 间 的 相 互 作 用, 增 加 保 留 分 离 度 和 制 备 时 的 上 样 量 比 表 面 积 小 可 以 缩 短 分 析 时 间 和 梯 度 时 的 平 衡 时 间 并 不 是 比 表 面 积 大 或 者 小 就 更 好, 选 择 适 合 目 的 的 比 表 面 积

19 液 相 色 谱 柱 的 选 择 - 色 谱 柱 参 数 色 谱 柱 参 数 含 碳 量 键 合 试 剂 的 类 型 与 比 表 面 积, 键 合 覆 盖 度 等 有 关 对 ODS, 含 碳 量 从 7-18%(ODS-100Z 为 20%) 不 等 ODS 的 含 碳 量 高, 则 保 留 增 加, 适 合 分 析 非 极 性 化 合 物 制 备 色 谱 的 上 样 量 也 可 以 增 加 含 碳 量 通 常 影 响 选 择 性

20 液 相 色 谱 柱 的 选 择 - 色 谱 柱 参 数 色 谱 柱 参 数 键 合 相 超 过 80% 的 样 品 可 以 使 用 反 相 色 谱 分 离, 一 般 方 法 开 发 也 首 先 使 用 反 相 色 谱 C18, C8,C4 等 反 相 色 谱, 从 C18 到 C8,C4, 对 化 合 物 的 保 留 降 低 CN 等 可 用 于 正 相, 也 可 以 用 于 反 相 键 合 试 剂 不 同, 对 化 合 物 的 选 择 性 不 同 方 法 开 发 时, 长 链 的 烷 基 键 合 相 (C18,C8) 比 短 链 的 (C4,C3) 稳 定 ; 非 极 性 的 键 合 相 比 极 性 的 键 合 相 (-NH2) 稳 定

21 配 基 疏 水 性 和 键 合 密 度 Si OH Si OH Si Si OH Si OH Si Si OH Si Si OH Si Si A B C Carbon contents A < B < C Length of alkyl chain A < B = C Hydrophobicity (retention) A < B < C Retention by ligand : C2 < C4, Phenyl < C8 < C18 < C30

22 碳 链 长 度 对 保 留 的 影 响 C C C18 C Retention time (min) Column: RPC (4.6mmI.D. x 15cm) Eluent: CH3CN Flow rate: 1.0mL/min Detector: UV 280nm 1: retinol 2: δ-tocopherol 3: α-tocopherol 4: α-tocopherol acetate Column: RPC (4.6mmI.D. x 15cm) Eluent: CH3CN Flow rate: 1.0mL/min Detector: UV 280nm 1: menadione 2: menaquinone 3: phylloquinone Retention time (min)

23 对 比 同 时 分 离 亲 水 性 疏 水 性 维 生 素 样 品 色 谱 图 ODS-100Z ODS-100V Retention time (min) Higher retention and better selectivity of hydrophilic compounds on ODS-100V Higher retention and better selectivity of hydrophobic compounds on ODS-100Z Compact separation range on ODS-100V attribute to LC/MS application Column: ODS (4.6mmI.D.x15cmL) Eluent: A; 0.1% TFA in H2O B; 0.1% TFA in CH3CN Gradient: 0min(B; 0%) 20min(B; 40%) 22min(B ; 100%) 50min(B ; 100%) Flow rate: 1.0mL/min Detector: UV (280nm) Injection vol.: 5μL Column temp.: 25 1: L-ascorbic acid 2: nicotinic acid 3: thiamine 4: pyridoxal 5: pyridoxine 6: caffeine 7: riboflavin 8: retinol 9: δ-tocopherol 10: α-tocopherol 11: α-tocopherol acetate

24 液 相 色 谱 柱 的 选 择 - 色 谱 柱 参 数 色 谱 柱 参 数 Flexible molecule 平 面 分 子 Steric/rigid molecule 非 平 面 分 子 Steric/rigid molecule 非 平 面 分 子 配 基 引 入 类 型 Flexible molecule 平 面 分 子 H 3 C Si CH 3 O Si O O Si O OH H C 3 CH 3 Si CH 3 O Si O H 3 C O O Si Si CH 3 O O OH OHHO OH Si O Si O Si O Si O O O O O O O O Si Si Si O Si O Mono- layer Poly- layer Schematic of carbon chain bonding structure Mono-layer and Poly-layer

25 空 间 位 阻 选 择 性 (mono-layer and poly-layer) 1 2 ODS(polylayer) α= ) o-terphenyl ODS(monolayer) α= Retention time (min) 2) triphenylene Column : ODS (4.6mmI.D. x 25cmL) Flow rate : 1.0ml/min Eluent : water/methanol=20/80 Detector : UV 254nm

26 液 相 色 谱 柱 的 选 择 - 色 谱 柱 参 数 色 谱 柱 参 数 硅 胶 表 面 性 质 - 纯 度 高 纯 硅 胶 表 面 的 重 金 属 含 量, 一 般 为 ppm 级, 液 相 系 统 的 金 属 部 件 也 会 产 生 重 金 属 (ODS-100V\Z 为 高 纯 硅 胶 ) 待 测 组 分 与 重 金 属 发 生 螯 合 反 应 会 导 致 色 谱 峰 形 不 佳, 产 生 前 伸 或 拖 尾 能 与 金 属 形 成 5 或 6 元 环 螯 合 物 的 待 测 组 分 特 别 容 易 受 重 金 属 影 响 可 以 使 用 EDTA 溶 液 或 稀 酸 冲 洗 色 谱 柱 消 除 重 金 属 影 响

27 金 属 螯 合 性 化 合 物 分 离 色 谱 图 对 比 O OH ODS B (Contain metal impurities) ODS A (High purity silica) hinokitiol Retention time (min) Column : ODS (4.6mmI.D. x 15cmL) Eluent : 20mM KH2PO4 + 1mM EDTA2Na / CH3CN=60/40 Flow rate : 1.0ml/min Detector : UV 320nm Column temp. : 40

28 液 相 色 谱 柱 的 选 择 - 色 谱 柱 参 数 色 谱 柱 参 数 硅 胶 表 面 性 质 - 硅 醇 基 硅 醇 基 的 酸 性 较 大, 可 与 碱 性 化 合 物 牢 固 的 结 合, 因 此 含 有 较 多 残 留 硅 醇 基 的 填 料 在 分 离 碱 性 化 合 物 时 容 易 产 生 拖 尾 变 宽 保 留 延 长 等 现 象 (ODS-100V\Z 都 进 行 了 彻 底 封 端 ) 加 入 适 当 的 扫 尾 剂 如 三 乙 胺 可 以 掩 蔽 残 留 的 硅 醇 基, 使 碱 性 化 合 物 峰 形 变 好, 降 低 流 动 相 ph 值 小 于 3, 可 以 减 小 硅 醇 基 的 反 应, 从 而 减 小 拖 尾 现 象

29 液 相 色 谱 柱 的 选 择 - 色 谱 柱 参 数 色 谱 柱 参 数 ODS 柱 的 特 征 结 构

30 液 相 色 谱 柱 的 选 择 - 色 谱 柱 参 数 色 谱 柱 参 数 封 端 未 封 端 的 Si-OH 基 团 是 碱 性 化 合 物 拖 尾 的 主 要 原 因 酸 性 条 件 下, 氢 离 子 通 过 未 封 端 的 Si-OH 的 间 隙 进 攻 -O- Si 键, 导 致 填 料 水 解 封 端 的 基 团 会 影 响 色 谱 柱 的 使 用 ph 值 对 化 合 物 的 选 择 性 等

31 液 相 色 谱 柱 的 选 择 - 色 谱 柱 参 数 色 谱 柱 参 数 封 端 目 的 : 减 小 残 留 硅 醇 基

32 碱 性 化 合 物 对 比 分 离 色 谱 图 ODS- B (non-end-capped) 1 2 As f=4.39 HO N H O ODS- A (end-capped) 1 2 As f=1.10 1) propranolol O CH 3 N CH Retention time (min) Column : ODS (4.6mmI.D. x 15cmL) Eluent : 10mM CH3COONH4(pH7.4)/CH3OH=40/60 Flow rate : 1.0ml/min Detector : UV 220nm Column temp. : 40 2) diphenhydramine

33 液 相 色 谱 柱 的 选 择 - 色 谱 柱 参 数 色 谱 柱 参 数 封 端 - 高 封 端 的 ODS 色 谱 柱 ph 使 用 范 围 宽 极 性 基 团 封 端 的 色 谱 柱 可 以 在 高 水 相 流 动 相 条 件 下 使 用 适 合 分 离 极 性 化 合 物 残 留 的 硅 醇 基 影 响 最 小, 碱 性 化 合 物 不 拖 尾 改 善 选 择 性 一 般 优 先 使 用 高 封 端 的 色 谱 柱

34 反 相 色 谱 柱 采 用 纯 水 相 体 系 下 保 留 减 小 示 意 图 移 動 相 Mobile phase 移 動 相 Mobile phase 細 孔 内 の 溶 媒 Solvent in a pore During 移 flowing 動 相 送 液 mobile 時 ( 水 100%) phase without 有 機 溶 媒 添 organic 加 移 動 相 solvent (100% water) Stop 移 flowing 動 相 送 液 mobile 時 ( 水 100%) phase 送 without 液 停 止 organic solvent (100% water)

35 采 用 TSKgel ODS-100V 色 谱 柱 及 100% 水 相 体 系 下 分 离 亲 水 性 化 合 物 Relative elution 97.6% (Other ODS column; 12.7%) 送 液 停 止 30min 後 (Temp. 40 ) After 30 min from flow-stop mv mv Retenion time(min) Column :TSKgel ODS-100V(4.6mm I.D. 15cm) Inj. Vol. :10μL Eluent :10mmol/L Phosphate Buffer(pH 6.8) Detect :UV(260nm) Flow Rate:1.0mL/min Temp. :40 Sample :1.Cytocine, 2.Uracil, 3.Uridine, 4. Adenine, 5. Guanosine Retenion time(min) TSKgel ODS-100V is durable to dewetting, and applicable to 100 % aqueous mobile phase without decrease of retention.

36 液 相 色 谱 柱 的 选 择 - LC/MS(/MS) LC/MS(/MS) 分 析 用 色 谱 柱 高 理 论 塔 板 数 细 内 径 色 谱 柱 更 小 的 二 次 相 互 作 用 低 ph 条 件 下 固 定 相 流 失 小

37 LC/MS 分 析 低 ph 条 件 下 固 定 相 流 失 比 较 3.0E E E+08 Commercial ODS column Intensity, cps 1.5E E E E+00 TSKgel ODS-100V 3µm Blank min Column : TSKgel ODS-100V 3µm (2.0mmI.D. x 15cm) Eluent : A; 0.1% HCOOH in H 2 O B; 0.1% HCOOH in CH 3 CN Gradient : 0min(B 5%) 10min(B 100%) 13min(B 100%) 15min(B 5%) Flow rate : 0.2mL/min Detector : ESI+, TIC(Range ; )

38 TSKGEL 反 相 色 谱 柱 选 择 一 览 表 硅 胶 填 料 : TSK-GEL 固 定 相 粒 径 ( μm) 炭 含 量 孔 径 ( 埃 ) 理 论 塔 板 数 保 持 力 封 端 处 理 ODS-100V C18 3,5 15% ( 单 层 ) 100 高 好 彻 底 好 ODS-100Z C % ( 单 层 ) 100 高 好 彻 底 好 ODS-100S C % ( 多 层 ) 100 高 好 较 好 好 耐 久 性 ODS-120T C % ( 多 层 ) 120 高 好 一 般 一 般 ODS-120A C % ( 多 层 ) 120 高 好 未 处 理 一 般 主 要 特 征 用 途 ODS 首 选 柱 ; 对 碱 性 化 合 物 分 析 效 果 特 别 好 ; 适 于 极 性 化 合 物 的 分 析 ; 可 适 用 100% 水 相 ;LC/MS 系 统 通 用 型 ODS 柱 ; 对 酸 性 中 性 碱 性 化 合 物 分 析 效 果 好 ; 适 于 中 性 和 疏 水 性 化 合 物 的 分 析 通 用 型 多 层 ODS 柱 的 标 准 ; 良 好 的 化 学 稳 定 性 ( 耐 酸 碱 ) 通 用 型 高 性 能 柱 ; 炭 含 量 最 高 ; 在 有 机 溶 剂 多 的 流 动 相 中 发 挥 威 力 炭 含 量 高 的 高 性 能 柱 ; 可 发 挥 填 料 的 离 子 作 用 ; 表 面 识 别 能 力 强, 适 于 分 析 芳 香 族 化 合 物 等

39 二 液 相 色 谱 柱 的 使 用 色 谱 柱 安 装 注 意 事 项 流 动 相 选 择 配 制 样 品 的 前 处 理 液 相 色 谱 仪 的 选 择

40 二 液 相 色 谱 柱 的 使 用 - 色 谱 柱 安 装 注 意 事 项 色 谱 柱 安 装 注 意 事 项 色 谱 柱 的 确 认 色 谱 柱 的 连 接 色 谱 柱 的 评 价

41 二 液 相 色 谱 柱 的 使 用 - 流 动 相 选 择 配 制 流 动 相 选 择 配 制 流 动 相 的 级 别 流 动 相 的 配 制 与 预 处 理 注 意 流 动 相 的 ph

42 流 动 相 的 选 择 和 配 制 流 动 相 对 样 品 具 有 一 定 的 溶 解 能 力, 保 证 样 品 组 分 不 会 沉 淀 在 柱 中 流 动 相 具 有 一 定 惰 性, 与 样 品 不 产 生 化 学 反 应 ( 特 殊 情 况 除 外 ) 流 动 相 的 粘 度 要 尽 量 小, 以 便 在 使 用 较 长 的 分 析 柱 时 能 得 到 好 的 分 离 效 果 ; 同 时 降 低 柱 压 降, 延 长 液 体 泵 的 使 用 寿 命 ( 可 运 用 提 高 温 度 的 方 法 降 低 流 动 相 的 粘 度 ) 流 动 相 的 物 化 性 质 要 与 使 用 的 检 测 器 相 适 应 如 使 用 UV 检 测 器, 最 好 使 用 对 紫 外 吸 收 较 低 的 溶 剂 配 制 流 动 相 沸 点 不 要 太 低, 否 则 容 易 产 生 气 泡, 导 致 实 验 无 法 进 行 在 流 动 相 配 制 好 后, 一 定 要 进 行 脱 气 除 去 溶 解 在 流 动 相 中 的 微 量 气 体 既 有 利 于 检 测, 还 可 以 防 止 流 动 相 中 的 微 量 氧 与 样 品 发 生 作 用

43 三 常 见 问 题 及 排 除 方 法 : 反 相 色 谱 反 相 色 谱 (RPC) 问 题 原 因 和 解 决 办 法 1 基 线 不 稳 定 1 由 水 中 或 试 剂 中 的 有 机 杂 质 所 引 起 (a) 使 用 超 纯 蒸 馏 水 或 HPLC 级 别 的 蒸 馏 水 (b) 在 使 用 前 先 将 流 动 相 在 ODS 柱 上 流 过 过 滤 2 脱 气 不 充 分 ( 与 设 备 相 关 ) (a) 在 使 用 前 脱 气 或 使 用 脱 气 溶 剂 TFA 在 脱 气 后 加 入 ( 出 现 鬼 峰 ) 3 流 动 相 中 的 TFA 发 生 降 解 (a) 在 分 析 前 现 配 TFA 溶 液 2 即 使 使 用 空 白 梯 度, 在 线 性 梯 度 的 同 一 洗 脱 位 置 1 流 动 相 中 的 疏 水 性 杂 质 富 集 并 被 洗 脱 重 复 出 现 鬼 峰 (a) 使 用 高 纯 度 的 试 剂,( 如 磷 酸 硫 酸 盐 TFA 等 ) 鬼 峰 面 积 随 着 平 衡 时 间 的 增 加, 杂 质 富 集 而 增 加 另 一 方 面, 不 稳 定 的 ( 非 重 复 的 ) 鬼 峰 与 仪 器 的 不 稳 定 有 关 系 3 样 品 在 高 碳 含 量 的 ODS 柱 中 保 留 不 好 1 固 定 相 在 低 有 机 溶 剂 浓 度 (<50%) 的 环 境 中 作 用 并 不 是 很 充 分 ( 流 动 相 含 水 量 高 ) (a) 使 用 单 层 键 合 含 碳 量 较 低 的 (15%) 的 ODS 柱, 如 : ODS-80Ts (b) 使 用 正 相 色 谱 来 代 替 4 离 子 性 样 品 洗 脱 的 重 现 性 不 好 1 流 动 相 的 ph 值 与 离 子 性 样 品 的 pka 值 很 接 近 (a) 使 用 与 样 品 pka 值 相 差 1.5 以 上 的 流 动 相 ph 值 5 样 品 的 保 留 不 好 1 样 品 用 有 机 溶 剂 溶 解 后 加 速 了 洗 脱 ( 样 品 洗 脱 呈 2 个 峰 但 峰 形 很 宽 ) (a) 至 少 使 用 与 洗 脱 液 开 始 浓 度 的 有 机 溶 剂 或 与 其 浓 度 相 仿 的 有 机 溶 剂 来 溶 解 样 品

44 三 常 见 问 题 及 排 除 方 法 : 反 相 色 谱 反 相 色 谱 (RPC) 问 题 原 因 和 解 决 办 法 6 多 肽 样 品 保 留 不 好 1 填 料 的 疏 水 性 太 弱 (a) 使 用 硅 胶 基 质 的 ODS 柱 代 替 树 脂 基 质 的 反 相 柱 (b) 添 加 离 子 对 试 剂, 如 : TFA (0.2 %) ( 出 峰 太 快 ) 2 流 动 相 的 重 新 平 衡 不 充 分 (a) 使 用 不 含 有 机 溶 剂 的 流 动 相 来 平 衡 至 少 需 要 1 个 小 时 来 得 到 重 复 性 好 的 谱 图 即 使 使 用 分 析 柱 时 也 一 样 7 蛋 白 质 样 品 的 吸 附 很 弱 1 样 品 溶 液 中 的 蛋 白 质 变 性 不 充 分 (a) 用 最 初 的 流 动 相 ( 如 : 0.05 % TFA) 来 溶 解 或 稀 释 蛋 白 样 品 并 促 成 蛋 白 变 性 (b) 增 加 离 子 对 试 剂 的 浓 度, 如 : 大 于 0.05 % 的 TFA 8 蛋 白 或 多 肽 样 品 不 能 充 分 洗 脱 ( 吸 附 太 强 ) 1 填 料 与 样 品 的 作 用 太 强 了 (a) 降 低 离 子 对 试 剂 的 浓 度, 如 : 低 于 0.02 % 的 TFA (b) 提 高 流 动 相 的 ph 值 ( 根 据 ph 的 变 化, 选 择 性 也 会 发 生 变 化 ) 对 于 ODS 柱, 用 50 mm 的 磷 酸 缓 冲 液 将 ph 提 高 到 7.0 对 于 树 脂 基 质 的 柱 子, 用 50 mm 的 Na2HPO4 将 ph 提 高 到 9.5 ( 蛋 白 或 多 肽 的 回 收 率 很 低 ) 2 色 谱 柱 填 料 的 孔 径 太 小 了 ( 或 疏 水 性 太 强 ) (a) 使 用 更 大 孔 径 的 柱 子, 如 : TSKgel Phenyl-5PW RP

45 峰 形 变 宽 (1) RPC 下 样 品 溶 液 中 不 同 浓 度 有 机 溶 剂 的 影 响 比 较 methanol 10% methanol 30% methanol 70% methanol 100% Slight peak broadening Serious peak broadening Bad peak shape Column: TSKgel ODS-100V (4.6mmI.D. x 15cm) Eluent: A; 10mM NaH2PO4/CH3CN=85/15 B; 10mM NaH2PO4/CH3CN=30/70 Gradient: 0min(B ; 0%) 15min(B ; 75%) Flow rate: 1.0mL/min Detector: UV (265nm) Injection vol.: 20μL Concentration: 10μg/L Column temp.: 40 1: sulfisomidine 2: sulfamerazine 3: sulfamethoxazole 4: sulfaquinoxaline Retention time (min) 样 品 溶 液 中 的 有 机 溶 剂 浓 度 应 当 不 高 于 初 始 流 动 相 中 有 机 溶 剂 的 浓 度

46 峰 形 变 宽 (2) RPC 下 重 现 性 良 好 的 多 肽 消 化 物 的 分 离 除 非 经 过 充 分 并 且 正 确 的 平 衡 (10-20 个 柱 体 积 的 平 衡 ), 否 则 这 些 峰 的 洗 脱 是 没 有 重 复 性 的 Gradient elution; Initial; 0% Final; 70 % acetonitrile Column; TSKgel ODS-80Ts (2 mmi.d. x 15 cm) Elution; A 30 min linear gradient of acetonitrile from 0 to 70 % in 0.1 % TFA at a flow rate of 0.2 ml/min, detected by UV absorbance at 215 nm.

47 RPC 保 留 太 强, 回 收 率 很 低 大 孔 径 填 料 和 离 子 对 试 剂 的 影 响 Caster Bean Lectin (RCA) 对 于 保 留 很 强 的 蛋 白 质 : 大 孔 径 的 填 料 : 100 nm 低 离 子 对 试 剂 浓 度 : 0.02 % ( 流 动 相 的 ph: 酸 性 到 中 性 ) Column; TSKgel Phenyl-5PW RP 4.6 mmi.d. x 7.5 cm Elution: A 44 min linear gradient of acetonitrile from 5% to 60 % in 0.02 % TFA at a flow rate of 1.0 ml/min, detected by UV absorbance at 220 nm

48 三 常 见 问 题 及 排 除 方 法 : 正 相 色 谱 正 相 色 谱 (NPC, HILIC) 问 题 原 因 和 解 决 办 法 1 样 品 的 吸 附 不 充 分 1 有 机 溶 剂 浓 度 太 低 ( 流 速 太 快 ) (a) 用 含 有 高 浓 度 有 机 溶 剂 的 溶 液 来 溶 解 样 品 但 是, 要 注 意 防 止 样 品 在 溶 液 中 发 生 沉 淀 (b) 减 少 样 品 的 进 样 量 2 进 样 量 太 大 (a) 进 样 量 小 于 50 微 升 ( 小 于 200 微 克 ) 在 Amide-80 柱 上, 同 一 样 品 洗 脱 出 2 个 峰 2 1 在 Amide 型 色 谱 柱 上 分 离 出 了 样 品 的 异 构 体 (Amide-80) (a) 在 80 下 进 行 分 析 以 消 除 异 构 体 的 影 响 (b) 添 加 100 mm 的 三 乙 胺 ( 不 需 要 升 高 分 析 温 度 ) (c) 使 用 NH2 型 色 谱 柱 3 使 用 NH2 型 色 谱 柱 时, 还 原 性 多 糖 的 回 收 率 很 低 1 样 品 与 填 料 基 质 上 的 Shiff's 碱 发 生 作 用 (a) 使 用 Amide 型 色 谱 柱 (Amide-80)

49 三 常 见 问 题 及 排 除 方 法 : 尺 寸 排 阻 色 谱 柱 尺 寸 排 阻 色 谱 柱 (SW) 问 题 原 因 和 解 决 办 法 1 样 品 吸 附 太 强 难 以 被 洗 脱 1 样 品 与 色 谱 柱 填 料 上 的 硅 羟 基 发 生 离 子 性 相 互 作 用 (a) 将 缓 冲 液 中 的 离 子 强 度 增 加 至 0.3 ( 如 ; 含 有 0.3 M NaCl 的 50 mm 磷 酸 钠 缓 冲 液,pH 6.8) (b) 将 ph 值 减 少 到 5.5 左 右 ( 如 ; 含 有 0.1 M Na2SO4 的 50 mm 磷 酸 钠 缓 冲 液,pH 5.5) 2 分 子 量 大 于 300K 的 蛋 白 质 ( 或 多 聚 体 及 二 聚 体 ) 有 可 能 发 生 非 特 异 性 吸 附 ( 疏 水 ) (a) 在 实 际 分 析 之 前 先 进 样 数 次 ( 总 共 上 样 约 1mg 左 右, 如 : 质 粒 样 品 ) 这 种 现 象 会 发 生 在 第 一 次 使 用 新 柱 子 时 3 疏 水 分 子 ( 如 多 肽 ) 间 发 生 疏 水 相 互 作 用 (a) 在 流 动 相 中 添 加 一 些 有 机 溶 剂, 如 : 乙 腈 ( 低 于 50 %) ( 如 ; 含 有 40% 乙 腈 的 50 mm 磷 酸 钠 缓 冲 液,pH 6.8) 2 样 品 的 洗 脱 越 来 越 迟 缓 1 在 劣 化 的 色 谱 柱 填 料 上 发 生 了 离 子 相 互 作 用 (a) 将 缓 冲 液 中 的 离 子 强 度 增 加 至 0.5 (0.5 M NaCl), 或 降 低 缓 冲 液 的 ph 值 完 全 恢 复 色 谱 柱 的 功 能 是 不 可 能 的 使 用 ph 值 小 于 7 的 缓 冲 液 2 发 生 疏 水 性 吸 附 的 杂 质 造 成 色 谱 柱 堵 塞 (a) 参 照 操 作 手 册 添 加 有 机 溶 剂 清 洗 色 谱 柱 (b) 安 装 保 护 柱 并 适 时 更 换 注 ; PW 系 列 的 色 谱 柱 有 时 也 会 和 SW 系 列 一 样 发 生 疏 水 性 吸 附 的 问 题

50 SEC 分 离 中 的 改 进 的 分 辨 率 流 动 相 的 影 响 (ph) Conditions Column: TSKgel G3000SWXL (7.8 mm I.D. x 30 cm) Eluent: A; 0.3 mol/l NaCl in 50 mmol/l sodium phosphate buffer, ph 6.7 B; 0.1 mol/l Na2SO4 in 50 mmol/l sodium phosphate buffer, ph 5.0 Flow rate: 1.0 ml/min Temperature: 25 C Detection: UV (280nm) * Allows indicate albumin peaks

51 故 障 排 除 : 离 子 交 换 色 谱 (IEC) 问 题 1 样 品 吸 附 不 够 充 分 2 进 样 若 干 次 后 对 样 品 的 吸 附 能 力 逐 渐 下 降 3 当 上 样 量 放 大 后, 回 收 率 变 低 了 4 ph 在 入 口 和 出 口 处 不 同, 即 很 难 平 衡 ( 重 现 性 非 常 不 好 ) 5 在 线 性 梯 度 的 同 一 洗 脱 位 置 重 复 出 现 鬼 峰 原 因 和 解 决 方 法 1 样 品 溶 液 中 的 离 子 强 度 太 高 (a) 通 过 透 析 或 用 缓 冲 液 ( 非 盐 缓 冲 液 ) 来 对 样 品 溶 液 脱 盐 处 理 特 别 是 在 下 一 步 中 将 会 使 用 疏 水 模 式 的 样 品 应 该 按 照 以 上 方 法 处 理 2 样 品 溶 液 的 ph 值 与 缓 冲 液 的 不 同 (a) 通 过 透 析 来 对 样 品 溶 液 脱 盐 处 理 1 样 品 中 的 疏 水 性 杂 质 吸 附 在 填 料 上 干 扰 了 正 常 的 结 合 (a) 使 用 酸 性 溶 液 或 碱 性 溶 液 进 行 清 洗 (b) 使 用 有 机 溶 剂 清 洗 1 长 时 间 的 上 样 过 程 中, 样 品 发 生 变 性 或 疏 水 性 吸 附 这 种 情 况 发 生 在 使 用 低 盐 缓 冲 液 上 样 过 程 超 过 1 个 小 时 的 时 候 (a) 浓 缩 样 品 缩 短 上 样 时 间 (b) 添 加 不 会 干 扰 结 合 的 盐 ( M NaCl) 1 缓 冲 液 中 的 离 子 与 填 料 基 质 结 合 形 成 了 离 子 对 (a) 按 照 离 子 交 换 填 料 的 官 能 团 选 择 合 适 的 缓 冲 液 ( 匹 配 的 ; DEAE-5PW/amine-buffer, 不 匹 配 的 ; DEAE-5PW/phosphate or acetate) (b) ph 梯 度 应 该 在 由 不 同 ph 缓 冲 范 围 的 缓 冲 液 组 成 的 混 合 液 中 进 行 1 流 动 相 中 的 离 子 性 杂 质 聚 集 并 被 洗 出 (a) 使 用 高 纯 度 的 溶 剂 ( phosphate, Tris, Guanidine/HCl 等 ) 鬼 峰 甚 至 重 复 出 现 在 空 白 梯 度 的 同 一 洗 脱 位 置 峰 高 取 决 于 平 衡 时 间 ( 杂 质 含 量 ) 另 一 方 面, 不 稳 定 的 ( 非 重 复 的 ) 鬼 峰 与 仪 器 的 不 稳 定 有 关 系

52 选 择 合 适 的 缓 冲 体 系 阴 离 子 交 换 填 料 (DEAE-, Q-Type) Buffer ( 阳 离 子 性 ) ph range Buffer ( 阴 离 子 性 ) N-methylpiperadine Formate Histidine Citorate bis-tris Acetate Imidazol MES Tris - ethanolamine Phosphate Tris HEPES ,3-diaminopropane BICINE * 避 免 使 用 会 与 离 子 交 换 填 料 上 的 功 能 基 团 结 合 的 缓 冲 液 ( 如 : DEAE-5PW /phosphate or acetate) 阳 离 子 交 换 填 料 (CM-, SP-Type) ph range

53 在 离 子 交 换 填 料 的 洗 脱 出 口 处 不 稳 定 的 ph 值 不 匹 配 的 离 子 交 换 填 料 与 缓 冲 液 Tris-buffer (easy to recover to initial ph) DEAE-5PW: positive charges Tris : positive charges Phosphate : negative charges ph Phosphate buffer (difficult to recover to initial ph) Reequilibration time after gradient (min) Column ;TSKgel DEAE-5PW (7.5mmI.D. 7.5cm) Eluent; A:20mmol/l Tris-HCl buffer B:20mmol/l Phosphate buffer A A+0.5mol/l NaCl(60minlinear gradient) B B+0.5mol/l NaCl Flow rate;1.0ml/min Temperature;Ambient Detection;pH monitor

54 使 用 大 孔 径 的 IEC 色 谱 柱 纯 化 蛋 白 质 单 抗 的 分 离 度 大 大 改 进 mau 280nm mau 280nm BioAssist Q 10x10 Methacrylate type Retention time (min) Commercial Q type 6mL Styrene type Retention time (min) ms/cm ms/cm BioAssist Q 10x10 Fraction Commercial Q 6mL Fraction Stock solution Peak area of IgG 80% Peak area of IgG 65% Peak area of IgG 19% Retention time (min) Purity check of Mab Samples on TSKgel G3000SWXL

55 AIEC 模 式 下 样 品 上 样 量 的 经 验 值 一 览 避 免 过 载 AIEC Column volume (ml) Binding capacity* (mg/ml gel) Column size( mm I.D. x mm Height) 2 x x 35 5 x x 50 8 x x x x DEAE-NPR BioAssist Q DEAE-5PW SuperQ-5PW ,674 - DEAE-Toyopearl SuperQ-Toyopearl ,340 3,293 QAE-Toyopearl 550C ,260 1,773 结 合 载 量 是 通 过 溶 菌 酶 来 计 算 的 BioAssist S ; 4.6 mmid x 50 mm 降 低 上 样 量 可 以 提 高 分 离 度 样 品 载 量 会 因 为 杂 质 含 量 的 不 同 而 有 所 区 别 蓝 色 标 注 的 是 商 品 化 的 色 谱 柱 规 格

56 CIEC 模 式 下 样 品 上 样 量 的 经 验 值 一 览 避 免 过 载 CIEC Binding Column size ( mm I.D. x mm Height) capacity * 2 x x 35 5 x x 50 8 x x x x 200 Column volume (ml) (mg/ml gel) SP-NPR BioAssist S SP-5PW CM-5PW SP-Toyopearl ,267 SP-Toyopearl 550C ,800 2,533 MegaCap SP-550EC ,944 2,736 CM-Toyopearl ,013 结 合 载 量 是 通 过 溶 菌 酶 来 计 算 的 BioAssist S ; 4.6 mmid x 50 mm 降 低 上 样 量 可 以 提 高 分 离 度 样 品 载 量 会 因 为 杂 质 含 量 的 不 同 而 有 所 区 别 蓝 色 标 注 的 是 商 品 化 的 色 谱 柱 规 格

57 故 障 排 除 : 疏 水 反 应 色 谱 (HIC) 问 题 原 因 和 解 决 办 法 1 样 品 未 被 洗 脱 ( 吸 附 太 强 ) 1 样 品 与 填 料 间 的 反 应 太 过 强 烈 (a) 使 用 疏 水 性 相 对 较 弱 的 柱 子 ( 如 : Ether-5PW 替 代 Phenyl-5PW) (b) 添 加 5 % 的 有 机 溶 剂 ( 异 丙 醇 乙 醇 等 ) 或 2 M 尿 素 于 流 动 相 中 2 样 品 在 进 样 前 发 生 沉 淀 (a) 将 硫 铵 的 浓 度 降 低 到 0.5M 来 确 认 样 品 的 溶 解 性 2 样 品 较 早 溶 出 并 且 峰 形 很 宽 1 样 品 溶 液 中 的 硫 铵 浓 度 太 低 (a) 将 样 品 中 的 硫 铵 浓 度 增 加 到 至 少 1M ( 将 等 体 积 的 样 品 溶 液 与 硫 铵 溶 液 混 合 ) 3 基 线 不 稳 1 缓 冲 液 试 剂 中 的 杂 质 被 梯 度 洗 脱 ( 出 现 鬼 峰 ) (a) 使 用 高 纯 度 的 试 剂 ( 酶 纯 化 级 别 的 试 剂 ). 鬼 峰 甚 至 重 复 出 现 在 空 白 梯 度 的 同 一 洗 脱 位 置 峰 高 取 决 于 平 衡 时 间 ( 杂 质 含 量 ) 另 一 方 面, 不 稳 定 的 ( 非 重 复 的 ) 鬼 峰 与 仪 器 的 不 稳 定 有 关 系 注 ; 第 一 次 尝 试 时 推 荐 首 选 Phenyl-5PW 色 谱 柱 ( 可 在 较 宽 范 围 内 吸 附 蛋 白 样 品 ) 有 些 蛋 白 因 为 填 料 的 疏 水 性 太 弱 而 不 能 被 Ether-5PW 吸 附 对 于 HIC,, 在 使 用 前 可 以 先 将 流 动 相 过 滤, 因 为 有 时 试 剂 中 会 含 有 一 些 沉 淀 物

58 峰 形 展 宽 HIC 对 样 品 的 分 离 效 果 Dissolve sample with buffer containing min. 0.5 M ammonium sulfate (Dilute sample equally with buffer containig 1.5 M salt) Weak retention peak may be eluted earlier and broader unless sample contains min. 0.5 M ammonium sulfate. Column; TSKgel Phenyl-5PW 7.5 mmi.d. x 7.5 cm Elution; A 60 min linear gradient of ammonium sulfate from 1.5 M to 0 in 0.1 M phosphate buffer (ph 7.0) at a flow rate of 1.0 ml/min, detected by UV absorbance at 280 nm

59 HIC 模 式 下 样 品 上 样 量 的 经 验 值 一 览 避 免 过 载 HIC Binding Column size ( mm I.D. x mm Height) capacity* 2 x x 35 5 x x 50 8 x x x x 200 Column volume (ml) (mg/ml gel) Butyl-NPR Ether-5PW BioAssist Phenyl-5PW Ether-Toyopearl PPG-Toyopearl Phenyl-Toyopearl Butyl-Toyopearl ,013 SuperButyl-Toyopearl 550C ,317 Hexyl-Toyopearl ,013 BioAssist Phenyl ; 4.6 mmid x 50 mm 降 低 上 样 量 可 以 提 高 分 离 度 样 品 载 量 会 因 为 杂 质 含 量 的 不 同 而 有 所 区 别 蓝 色 标 注 的 是 商 品 化 的 色 谱 柱 规 格

60 保 护 柱 更 换 保 护 柱 1 使 用 保 护 柱 或 保 护 胶 来 保 护 分 析 柱 2 发 生 问 题 时, 检 查 一 下 是 否 可 以 通 过 更 换 保 护 柱 来 解 决 问 题 3 用 高 纯 度 ( 过 滤 后 的 ) 标 准 品 来 验 证 柱 效, 检 查 有 无 保 护 柱 时 谱 图 是 否 发 生 变 化 4 如 果 问 题 的 发 生 仅 是 因 为 保 护 柱, 那 么 更 换 保 护 柱 后, 柱 效 问 题 就 能 得 到 修 复 更 换 保 护 柱 外 的 故 障 排 除 症 状 原 因 故 障 排 除 正 常 峰 形, 不 溶 物 堵 住 了 柱 子 入 口 处 更 换 或 清 洗 接 口 但 柱 压 升 高 很 多 峰 形 变 宽, 柱 压 升 高 柱 头 处 的 填 料 柱 床 发 生 塌 陷 柱 子 已 经 劣 化 了, 更 换 柱 子 柱 压 正 常, 但 峰 形 发 生 变 化 柱 头 处 由 于 发 生 吸 附 作 用 填 料 被 污 染 根 据 操 作 说 明 清 洗 柱 子 ( 有 时 是 接 口 处 吸 附 并 累 计 不 溶 物 所 造 成 的 ) 峰 开 叉 柱 中 填 料 间 出 现 缝 隙 ( 形 成 多 流 路 ) 柱 子 已 经 劣 化 了, 更 换 柱 子

61 Thank you for your attention!