2018-5中国药理学通报封面

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张余怡贝
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1 680 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2018May;34(5):680~5 网络出版时间 : :12 网络出版地址 :htp://kns.cnki.net/kcms/detail/ r html 丹酚酸 B 通过调控 SIRT1/NF κb/p53 通路减轻缺氧 / 复氧诱导的大鼠肝细胞损伤万磊, 陈青松, 周壮, 周翔宇, 郑道峰, 吴忠均 ( 重庆医科大学附属第一医院肝胆外科, 重庆 ) doi: /j.isn 文献标志码 :A 文章编号 : (2018) 中国图书分类号 :R 332;R284 1;R322 47;R329 25; R394 2;R845 22;R977 6 摘要 : 目的探究丹酚酸 B(salvianolicacidB,SalB) 减轻缺氧 / 复氧 (H/R) 诱导的大鼠肝细胞损伤及潜在的分子机制方法体外培养 BRL 3A 大鼠肝细胞株, 制备 BRL 3A 的 H/ R 模型, 予以 SalB 干预 CCK 8 检测细胞活力 ; 微板法测转氨酶含量 ;ELISA 测炎性因子的含量 ; 流式细胞术测细胞凋亡水平 ;Westernblot 和实时荧光定量 PCR(qPCR) 检测 SIRT1 NF κbp65 p53 Bax Bcl 2 蛋白及 mrna 表达水平结果 H/R 诱导的大鼠肝细胞活力下降 ; 细胞上清液中 ALT AST TNF α IL 1β 含量明显增多 ; 细胞凋亡率明显升高 ;SIRT1 和 Bcl 2 在蛋白及 mrna 水平的表达下调, 而 NF κbp65 p53 和 Bax 在蛋白及 mrna 水平的表达上调在 Sal B 预处理后, 细胞活力升高 ; 细胞液中 ALT AST TNF α 及 IL β 的含量下降 ; 细胞凋亡率降低 ;SIRT1 和 Bcl 2 在蛋白水平及 mrna 水平的表达升高,NF κbp65 p53 和 Bax 在蛋白水平及 mrna 水平的表达降低结论丹酚酸 B 可有效减轻 H/R 诱导的大鼠肝细胞损伤, 其机制可能与 SIRT1/NF κb/p53 通路有关系收稿日期 : , 修回日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (No ); 重庆市科学技术委员会基金项目 (Nocstc2015shmszx120019) 作者简介 : 万磊 (1990-), 男, 硕士生, 研究方向 : 肝移植及移植免疫耐受,E mail:roxray@163.com; 吴忠均 (1968-), 男, 博士, 教授, 博士生导师, 研究方向 : 肝移植及移植免疫耐受, 通讯作者,E mail:wzjtcy@126. com 关键词 : 丹酚酸 B; 沉默信息调节因子 1; 核因子 κbp65;p53; 缺氧 / 复氧 ;BRL 3A 肝脏缺血 / 再灌注损伤 (ischemia/reperfusionin jury,iri) 是指肝脏在缺血一段时间后恢复血液供应, 该过程不仅不利于肝功能的恢复, 往往造成更严重的肝脏功能障碍在肝脏 IRI 进程中, 氧化应激反应炎症反应肝细胞的凋亡坏死等都是引起肝损伤的重要原因 [1] 沉默信息调节因子 1(silentin formationregulator1,sirt1) 作为一种广泛存在于人类细胞中的 I 组蛋白去乙酰化酶, 通过其去乙酰化作用, 调控抑癌因子 p53 核因子 κb(nuclearfac tor κb,nf κb) 叉头蛋白转录因子 (forkhead box transcriptionfactor,foxo) 等多种因子, 发挥各种生物活性 [2] NF κb 作为体内关键的信号分子, 精确调控炎症反应, 而通过 SIRT1 的效应, 可以降低其亚单位 NF κbp65 的表达, 抑制下游炎症因子的活性 [3] p53 在细胞内主要表现为阻滞细胞周期促进细胞凋亡等作用, 而 SIRT1 可以降低 p53 的结合能力, 减少细胞凋亡 [4] 丹酚酸 B(salvianolicacid B,SalB) 是从丹参中提取的高活性低毒性的水溶性化合物, 具有改善心脑血流量抗氧化抗炎等生物活性, 近年来研究也证明 SalB 对心肌梗死有保护作用, 且能改善心脑 IRI [5] 本研究拟通过建立大鼠肝细胞株 BRL 3A 的缺氧 / 复氧 (hypoxia/reoxy genation,h/r) 模型 [6], 观察 SalB 是否减轻 H/R 诱导的肝细胞损伤, 并初步探讨其潜在机制, 为临床治疗肝 IRI 提供理论依据

2 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2018May;34(5) 材料与方法 1.1 材料细胞株与试剂大鼠 BRL 3A 肝细胞株购自武汉 Procel 公司 ;SalB 购自上海 Winherb 医药科技发展有限公司 ; 胎牛血清 (fetalbovineserum, FBS) 购自 BI 公司 ;DMEM/F12 培养基购自 Hyclone 公司 ; 丙氨酸氨基转移酶 (alanineaminotransferase, ALT) 天冬氨酸氨基转移酶 (aspartateaminotrans ferase,ast) 试剂盒购自南京建成生物公司 ; 肿瘤坏死因子 α(tumornecrosisfactorα,tnf α) 白细胞介素 1β(interleukin1β,IL 1β)ELISA 试剂盒购自 Neobioscience 公司 ; 逆转录 alinone 试剂 SYBR 荧光染料 CCK 8 试剂购自 Biotool 公司 ;TRIzol 试剂购自 TaKaRa 公司 ; 引物购自上海生工有限公司 ;RIPA 裂解液 BCA 蛋白浓度检测试剂盒购自碧云天公司 ;ECL 发光液购自 Advansta 公司 ; 兔抗 NF κbp65 抗体购自北京中杉金桥生物公司 ; 兔抗 SIRT1 p53 Bax Bcl 2 抗体购自沈阳万类公司 ; 兔抗 β actin 抗体及山羊抗兔 IgG 购自武汉博士德公司仪器 3131 型三气培养箱 ( 美国 Thermo Scientific 公司 );MSS 酶标仪 ( 芬兰雷勃公司 );Al legra64r 型超速冷冻离心机 ( 美国 Beckman 公司 ); PowerPac300 型电泳仪 CFX96 型荧光定量 PCR 仪 ( 美国 Bio Rad 公司 ); 流式细胞仪 ( 美国 BD 公司 ) 1.2 方法大鼠 BRL 3A 肝细胞培养及 SalB 药物配制将 BRL 3A 正常培养在含 10% FBS 的 DMEM/ F12 培养基中, 置于普通的培养箱 (37 5% CO 2 95% 空气 ) 中, 观察细胞形态将 SalB 溶解在无菌的 PBS 液中, 配成浓度 10μmol L -1 的基础液, 封口避光保存于 -20 冰箱, 根据实验需要, 再用 DMEM/F12 培养基将基础母液稀释到相应的浓度实验分组及 H/R 模型构建实验分为对照组 : 正常培养的细胞 ; 对照处理组 : 正常培养的细胞中加入实验最适浓度 SalB(0 5μmol L -1 ) 干预 ; 模型组 :H/R 诱导培养的细胞 ; 实验处理组 : 在需要 H/R 诱导培养的细胞中分别加入 μmol L -1 SalB 干预 H/R 模型构建 : 正常条件培养肝细胞生长至融合度 70% 左右后, 改用不含血清的饥饿培养液, 置于三气培养箱 (37 94% N 2 1% O 2 5% CO 2 ) 缺氧培养 12h, 再置入普通孵箱培养 4h [6] 在缺氧前 2h 加入相应浓度药物干预 CCK 8 检测细胞活力选取状态良好的细胞计数, 然后按个 / 孔接种到 2 块 96 孔板里, 随机将两板分为对照组和 H/R 组 ; 对照组设置空白对照及调零组,H/R 组设置空白 H/R H/R 加药及调零组 ; 空白对照组正常孵育, 空白 H/R 组缺氧培养 12 h 后再复氧培养 4h,H/R 加药组在不同浓度药物干预 2h 后再 H/R 处理, 调零组没有细胞, 每组设置 3 个复孔接种完毕后, 将孔板放入普通培养箱正常培养 24h, 再按实验要求药物干预, 按需行缺氧 / 复氧处理, 根据说明书, 再混入 10μLCCK 8 反应液, 于正常孵箱中反应 90min, 测 OD 值 ELISA 检测 TNF α 和 IL 1β 水平将细胞接种到 2 块 6 孔板中正常培养, 待细胞贴壁融合到 70% 左右, 开始药物干预, 随机选择 1 块孔板, 设置空白对照组及加入 0 5μmol L -1 药物干预对照组, 另一块孔板设置空白 H/R 组和分别加入 μmol L -1 药物干预的 H/R 组 H/R 后收集各组细胞液, 按说明书要求检测 TNF α 和 IL 1β 水平微板法检测 ALT 和 AST 水平将细胞接种到 2 块 6 孔板中正常培养, 随机选择孔板设置分组, 按上述方法处理, 收集培养液, 按试剂盒要求检测 ALT AST 水平流式细胞术检测细胞凋亡用 T25 培养瓶正常培养细胞, 待贴壁融合 70% 左右开始药物干预处理细胞, 分为对照组加 0 5μmol L -1 药物干预的对照组 H/R 组加 μmol L -1 药物干预的 H/R 组 H/R 完成后收集上清, 与消化的细胞一起离心,PBS 多次冲洗, 重复离心步骤, 最后收集细胞, 按说明操作, 检测凋亡 Westernblot 检测蛋白表达实验分组和处理方法同上,H/R 后提取细胞总蛋白, 并用 BCA 法测定蛋白浓度, 绘制标准曲线后, 按每孔 30μg 计算上样量浓缩胶 80V 电泳, 等蛋白预染标记物完全分开后,120V 继续电泳下层胶 ; 充分分离后,250 ma 电转至 PVDF 膜 ; 膜在环境温度下用 5% 的脱脂牛奶于 70r min -1 的摇床上封闭 90min, 再孵育一抗 (β actin SIRT1 p53 Bax Bcl 2 为 1 500,NF κb p65 为 1 800), 置于 4 过夜 ; 隔天将膜夹入 TBST 中, 于 110r min -1 摇床上洗 3 遍, 各 10min, 再孵育二抗 (1 5000), 置于 37 培养箱反应 1h, 之后再将膜用 TBST 洗 3 次 ; 最后曝光显影, 用软件进行蛋白表达量的定量分析实时荧光定量 PCR 检测 mrna 表达实验分组和处理方法同上,H/R 后用 TRIzol 法提取各组细胞总 RNA, 按说明书逆转录为 cdna, 并取 cdna 行荧光定量 PCR, 检测 SIRT1 NF κbp65 p53 Bax Bcl 2 的 mrna 表达水平, 以 GADPH 作为内参, 独立实验, 重复 3 次 PCR 反应体系 :cdna1μl

3 682 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2018May;34(5) Tab1 Sequencesofprimersforselectedgenes Gene Forwardsequence Reversesequence SIRT1 5 TACCCCATGAAGTGCCTCAA 3 5 CATCGCAGTCTCCAAGAAGC 3 NF κbp65 5 TGTTTCCCCTCATCTTTCCCT 3 5 GCCCTCGCACTTGTAACGG 3 p53 5 TCACCCTTAAGATCCGTGGG 3 5 GTAGACTGGCCCTTCTTGGT 3 Bax 5 CGAGTGTCTCAGGCGAATTG 3 5 CGTCTGCAAACATGTCAGCT 3 Bcl 2 5 GAGTACCTGAACCGGCATCT 3 5 ATCAAACAGAGGTCGCATGC 3 GAPDH 5 ACAGCAACAGGGTGGTGGAC 3 5 TTTGAGGGTGCAGCGAACTT 3 SYBRGreen5μL 上下游引物各 0 2μL 无酶水 3 6μL 引物序列见 Tab 统计学分析实验至少独立重复 3 次, 应用 SPSS20 0 软件进行统计学分析, 数据用 x±s 珋表示, 多样本均数比较采用单因素方差分析, 两样本之间比较用 t 检验 2 结果 2.1 SalB 对 H/R 后细胞活力的影响在不同浓度 SalB( μmol L -1 ) 预处理后, 对细胞行 H/R 诱导, 通过检测分析发现,H/R 组与对照组相比, 细胞活力明显下降 (P <0 01); μmol L -1 药物干预后的 H/R 组与 H/R 组对比, 肝细胞活力升高 (P<0 05,P<0 01),5 10μmol L -1 药物干预后的 H/R 组与 H/R 组对比, 肝细胞活力升高不明显, 差异无统计学意义, 且 0 5μmol L -1 SalB 预处理后肝细胞活力提高最明显, 所以将该浓度作为后续实验的药物最佳预处理浓度 (Fig1) Fig1 EfectofSalBonviabilityofBRL 3A celsinducedbyh/r CON:Controlgroup;H/R:Hypoxia12h/reoxygenation4h. ## P <0 01vsCON; P<0 05, P<0 01vsH/R. 2.2 SalB 降低 H/R 诱导的肝细胞上清液中 ALT 和 AST 水平对照组中 ALT AST 水平较低,0 5 μmol L -1 SalB 干预后的对照组中 ALT AST 水平变化不大, 差异无统计学意义 H/R 诱导后, 细胞培养液中 ALT AST 水平明显上升, 预处理后,H/R 中 ALT AST 水平降低 (P<0 01,Fig2A) 2.3 SalB 降低 H/R 诱导的肝细胞上清液中 TNF α 和 IL 1β 水平药物干预的对照组与空白对照组相比, 细胞培养液中 TNF α IL 1β 的分泌变化不明显,H/R 诱导的细胞培养液中 TNF α IL 1β 水平明显高于对照组, 而药物干预降低了 H/R 组 TNF α IL 1β 的分泌 (P<0 01,Fig2B) 2.4 SalB 降低 H/R 诱导的肝细胞凋亡率与空白对照比较, 药物干预的对照组凋亡率无明显变化, 而 H/R 组细胞凋亡率明显升高 (P<0 01); 与 H/R 组相比, 药物干预的 H/R 组细胞凋亡率降低, 差异有统计学意义 (P<0 01), 见 Fig3 2.5 SalB 影响 H/R 后肝细胞 SIRT1 NF κb p65 p53 Bax Bcl 2 的蛋白表达水平与空白对照相比,H/R 组 NF κbp65 p53 Bax 蛋白表达上调, SIRT1 Bcl 2 蛋白表达降低 (P<0 01); 与 H/R 组相比,SalB 预处理后的 H/R 组 NF κbp65 p53 Bax 表达下调,SIRT1 Bcl 2 表达增高 (P<0 05,P< 0 01), 见 Fig4 2.6 SalB 影响 H/R 后肝细胞 SIRT1 NF κb p65 p53 Bax Bcl 2 的 mrna 表达水平如 Fig5 所示, 与空白对照相比,H/R 组 NF κbp65 p53 Bax 的 mrna 表达水平明显增高,SIRT1 Bcl 2 的 mrna 表达水平降低 (P<0 01); 与 H/R 组相比, 药物预处理后的 H/R 组 NF κbp65 p53 Bax 的 mrna 表达水平降低,SIRT1 Bcl 2 的 mrna 表达水平增高 (P<0 05,P<0 01) 3 讨论肝 IRI 作为一个复杂的病理生理过程, 在大型的肝脏手术中, 尤其是肝移植术中常常是无法避免的通过了解肝 IRI 发生的机制发现, 炎症反应肝细胞的凋亡坏死等都是引起肝损伤的重要原因, 因此, 控制细胞凋亡和炎症的发生可以减轻 IRI [7] SalB 由于其改善血流量抗炎抗氧化等功能, 已经应用于大量心脑血管疾病的研究 [8] [9] Wang 等发

中国药理学通报ＣｈＰｈｍｇＢｕ２０１８Ｍｙ３４５６８３Ｆｇ２ＥｆｆｆｓｂｖｆａｌｔＡＳＴＴＮＦｄｉＬ１β α ｕｐｆｂｒｌ３ＡｄｕｄｂｙｈＲＡＥｘｐｆａｌｔｄａｓｔｗ

２５μｍＬ１ＳＢ０５ＨＲ０５μｍＬ１ＳＢＰ００１ｖＣＯＮＰ００１ｖＨＲＦｇ３ＥｆｆｆｓｂｐｐＢＲＬ３ＡｄｕｄｂｙｈＲＰ００１ｖＣＯＮＰ００１ｖＨＲ现

Ｒ的肝细胞活等１０发现ＳＢ通过ＳＩＲＴ１作用降低乙酰化ｐ５３Ｒ后的细胞凋亡力最强且该浓度能明显抑制Ｈ表达从而对抗乙醇性的急性肝损伤因此我们推降低转氨酶ＡＳＴＡＬＴ含量降低ＴＮＦＬ１β分

4 中国药理学通报ＣｈＰｈｍｇＢｕ２０１８Ｍｙ３４５６８３Ｆｇ２ＥｆｆｆｓｂｖｆａｌｔＡＳＴＴＮＦｄｉＬ１β α ｕｐｆｂｒｌ３ＡｄｕｄｂｙｈＲＡＥｘｐｆａｌｔｄａｓｔｗｄｄｂｙｍｐｙＢＬｖｆｔｎｆｄｉＬ１βｗｄｍｄｂｙｅｌｉＳＡＣＯＮＣｇｕｐ α ＣＯＮＳＣＯＮ０５μｍＬ１ＳＢＨＲＨｙｐｘ１２ｈｘｙｇ４ｈ０２５ＨＲ０２５μｍＬ１ＳＢ０５ＨＲ０５μｍＬ１ＳＢＰ００１ｖＣＯＮＰ００１ｖＨＲＦｇ３ＥｆｆｆｓｂｐｐＢＲＬ３ＡｄｕｄｂｙｈＲＰ００１ｖＣＯＮＰ００１ｖＨＲ现ＳＢ通过调控ＴＬＲ４ＭｙＤ８８ＴＲＡＦ６信号通路ＲＩ用各种浓度的ＳＢ干预ＨＲ处理的细肝脏Ｉ使ＮＦ６５的表达降低减轻了心脏ＩＲＩＬ κｂｐ胞发现ＳＢ０５μｍＬ１时ＨＲ的肝细胞活等１０发现ＳＢ通过ＳＩＲＴ１作用降低乙酰化ｐ５３Ｒ后的细胞凋亡力最强且该浓度能明显抑制Ｈ表达从而对抗乙醇性的急性肝损伤因此我们推降低转氨酶ＡＳＴＡＬＴ含量降低ＴＮＦＬ１β分 α Ｉ测ＳＢ也能够通过减轻炎症及凋亡缓解肝脏泌表明ＳＢ能够减少炎性反应和凋亡来保护ＨＩＲＩ研究中我们建立了ＢＲＬ３Ａ的ＨＲ模型模拟Ｒ诱导的肝细胞损伤这与Ｌｖ等１１通过建立大鼠

684 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2018May;34(5) Fig4 EfectofSalBonrelativeproteinexpresioninBRL 3AcelsinducedbyH/R A,C:ExpresionofrelativeproteinweredetectedbyWesternbolt;B,D:Semi

Fig5 EfectofSalBonrelativemRNAlevelsinBRL 3AcelsinducedbyH/R A:mRNAexpresionlevelsofSIRT1,NF κbp65;b:mrnaexpresionlevelsofp53,bax,bcl 2.

5 684 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2018May;34(5) Fig4 EfectofSalBonrelativeproteinexpresioninBRL 3AcelsinducedbyH/R A,C:ExpresionofrelativeproteinweredetectedbyWesternbolt;B,D:Semi quantitativeanalysisofexpresionofrelativeprotein. ## P<0 01vs CON; P<0 05, P<0 01vsH/R. vsh/r. Fig5 EfectofSalBonrelativemRNAlevelsinBRL 3AcelsinducedbyH/R A:mRNAexpresionlevelsofSIRT1,NF κbp65;b:mrnaexpresionlevelsofp53,bax,bcl 2. ## P<0 01vsCON; P<0 05, P<0 01 大脑中动脉闭塞手术模型, 验证 SalB 作用时所得结果是一致的 SIRT1 作为一种依靠 NAD + 的 Sirtuin 蛋白家族中的重要一员, 因为其去乙酰化作用, 调控 p53 NF κbp65 等常见的转录因子, 发挥抗炎症反应和抗凋亡的作用 [12] 本实验研究证实, 不管在蛋白还是 mrna 层面, 与空白对照相比,H/R 诱导后,NF κb p65 p53 Bax 表达明显上调,SIRT1 Bcl 2 表达下调 ; 而 SalB 干预后, 与 H/R 组相比,NF κbp65 p53 Bax 表达下调,SIRT1 Bcl 2 表达增高这与 [13] Hernández Jiménez 等通过对 SIRT1 沉默的转基因小鼠脑缺血 / 再灌注处理后得到的结果一致 Liu [14] 等也证实了在 H/R 条件下, 激活 SIRT1 能降低 Bax p53 等的表达但本实验只在体外进行了验证, 未能对相关通路进行更充分的研究, 后续实验中我们会加入动物实验, 明确 SalB 对 IRI 更加确切的机制综上,SalB 能保护 H/R 诱导的肝细胞损伤, 其机制可能与 SIRT1/NF κb/p53 通路有关系 ( 致谢 : 本实验在重庆医科大学附属第一医院实验研究中心完成, 在此感谢在实验中给予指导和帮助的各位老师和同学 )

6 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2018May;34(5) 685 参考文献 : [1] HuJ,ZhuX,ZhangX,etal.TargetingTRAF3signalingprotects againsthepaticischemia/reperfusionsinjury[j]. JHepatol, 2016,64(1): [2] LinY,ShengM,WengY,etal.Berberineprotectsagainstische mia/reperfusioninjuryafterorthotopiclivertransplantationviaac tivatingsirt1/foxo3αinducedautophagy[j].biochem Biophys ResCommun,2017,483(2): [3] HuangW,ShangW,WangH,etal.Sirt1overexpresionprotects murineosteoblastsagainsttnf α inducedinjuryinvitrobysup presingthenf κbsignalingpathway[j].actapharmacolsin, 2012,33(5): [4] DataG,FulerB,DavidsonB.Molecularmechanismsofliveris chemiareperfusioninjury:insightsfromtransgenicknockoutmod els[j].worldjgastroenterol,2013,19(11): [5] 林超, 刘兆国, 钱星, 等. 丹酚酸 B 在心血管疾病中药理作用研究进展 [J]. 中国药理学通报,2015,31(4): [5] LinC,LiuZG,QianX,etal.Researchprogresofsalvianolic acidb incardiovasculardiseases[j].chinpharmacolbul, 2015,31(4): [6] WangR,HuangF,ChenZ,etal.Downregulationofconnexin32 atenuateshypoxia/reoxygenationinjuryinlivercels[j].jbio chemmoltoxicol,2015,29(4): [7] HeD,GuoZ,PuJ,etal.Resveratrolpreconditioningprotects hepatocytesagainsthepaticischemiareperfusioninjuryviatol like receptor4/nuclearfactor κbsignalingpathwayinvitroandinvivo [J].IntImmunopharmacol,2016,35: [8] 王新宇, 王曼, 孙帅军, 等. 丹酚酸 B 保护大鼠缺血心肌与炎症小体 NLRP3 表达的相关性研究 [J]. 中国药理学通报, 2016,32(10): [8] WangXY,WangM,SunSJ,etal.Protectiveefectsofsalvian olicacidbonisoproterenolinducedmyocardialischemicratsand itsrelationwithnlrp3expresion[j].chinpharmacolbul, 2016,32(10): [9] WangY,ChenG,YuX,etal.SalvianolicacidBameliorates cerebralischemia/reperfusion injury through inhibiting TLR4/ MyD88signalingpathway[J].Inflammation,2016,39(4): [10]LiM,LuY,HuY,etal.SalvianolicacidBprotectsagainstacute ethanol inducedliverinjurythroughsirt1 mediateddeacetylationof p53inrats[j].toxicollet,2014,228(2): [11]LvH,WangL,ShenJ,etal.SalvianolicacidBatenuatesapop tosisandinflammationviasirt1activationinexperimentalstroke rats[j].brainresbul,2015,115:30-6. [12]NakazawaH,ChangK,ShinozakiS,etal.Inosasadriverofin flammationandapoptosisinmouseskeletalmuscleafterburninju ry:posibleinvolvementofsirt1s nitrosylation mediatedacety lationofp65nf κbandp53[j].plosone,2017,12(1): e [13]Hernández JiménezM,HurtadoO,CuarteroM,etal.Silentin formationregulator1protectsthebrainagainstcerebralischemic damage[j].stroke,2013,44(8): [14]LiuL,WangP,LiuX,etal.ExogenousNAD + supplementation protectsh9c2cardiacmyoblastsagainsthypoxia/reoxygenationin juryviasirt1 p53 pathway[j]. Fundam Clin Pharmacol, 2014,28(2): SalBatenuatesrathepatocytesinjuryinducedbyhypoxia/reoxygenation viamodulationofsirt1/nf κb/p53pathway WANLei,CHENQing song,zhouzhuang,zhouxiang yu,zhengdao feng,wuzhong jun (DeptofHepatobiliarySurgery,theFirstAfiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing ,China) Abstract:Aim Toinvestigatetheefectofsalvianolic acidb(salb)ontheatenuationofrathepatocytein juryinducedbyhypoxia/reoxygenation(h/r)andits posiblemolecularmechanism.methods Rathepato cytesbrl 3Awereculturedinvitro.H/Rinjurymod elwasestablishedandthenbrl 3Acelswerepretrea tedwithsalb.theviabilityofcelswasmeasuredby CCK 8asay;theexpresionofALTandASTwasde tectedbymicroplateasay;thelevelsoftnf αand IL 1βweredeterminedbyELISA;theapoptosiswas detectedbyflowcytometry;theproteinandmrnalev elsofsirt1,nf κbp65,p53,baxandbcl 2were measuredbywesternblotandqpcr.results H/R interventiondecreasedtheviabilityandincreasedthe apoptosisofcels;theproductionofalt,ast,tnf αandil 1βwaselevated;theproteinandmRNAlev elsofsirt1,bcl 2werereduced,butthelevelsof NF κbp65,p53andbaxincreased.afterpretreated withsalb,theviabilityofcelsincreasedwhilethe apoptosisdecreased; theexpresion ofalt, AST, TNF αandil 1βwasinhibited;moreover,theprotein andmrnalevelsofsirt1,bcl 2wereenhanced,and thelevelsofnf κbp65,p53andbaxdecreasedsig nificantly.conclusion SalBmayatenuaterathepa tocyteinjuryinducedbyh/rviathesirt1/nf κb/ p53pathway. Keywords:salvianolicacidB;SIRT1;NF κbp65; p53;hypoxia/reoxygenation;brl 3A

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot