AdeABC 外排泵系统与鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药的关系豆清娅, 等 427 of adea, adeb, ader, and ades in the strains before and after induction, respectively. Results: The minimal

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中南大学学报 ( 医学版 ) J Cent South Univ (Med Sci) 2017, 42(4) http://www.csumed.org 426 DOI:10.11817/j.issn.1672-7347.2017.04.010 www.csumed.org/xbwk/fileup/pdf/201704426.

1 中南大学学报 ( 医学版 ) J Cent South Univ (Med Sci) 2017, 42(4) DOI: /j.issn AdeABC 外排泵系统与鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药的关系豆清娅, 邹明祥, 李军, 王海晨, 胡咏梅, 刘文恩 ( 中南大学湘雅医院检验科, 长沙 ) [ 摘要 ] 目的 : 探讨外排泵 AdeABC 系统与鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药的关系方法 : 采用美罗培南多步法体外诱导敏感鲍曼不动杆菌获得对碳青霉烯类药物耐药的菌株 ; 采用 E-test 法定量检测诱导前后菌株的敏感性 ; 羰基氰化物间氯苯腙 (carbonylcyanide-m-chlorophenylhydrazone,cccp) 抑制试验筛查外排泵 ;PCR 及测序分析诱导前后 AdeABC 系统的调控基因 ades,ader 及主要碳青霉烯酶基因的变化 ; 荧光定量 PCR 检测诱导前后 adea,adeb, ader 和 ades 基因 mrna 的表达量结果 : 亲代敏感菌株 S25595 和 S7257 的美罗培南最低抑菌浓度 (minimal inhibitory concentration,mic) 分别为 0.38 和 0.25 μg/ml, 诱导后 MIC 均 >32 μg/ml; 与亲代敏感株相比, 诱导耐药株 adea,adeb, ader 和 ades 基因的 mrna 表达量上升 2.45~9.44 倍, 但调控基因 ades 和 ader 没有基因突变或插入序列结论 : 外排泵 AdeABC 系统高表达与鲍曼不动杆菌对美罗培南耐药密切相关, 其表达水平升高不是由调控基因 ades 和 ader 序列中基因突变或插入序列引起, 可能存在其他机制 [ 关键词 ] 鲍曼不动杆菌 ; 外排泵 AdeABC 系统 ; 碳青霉烯类 ; 耐药机制 AdeABC efflux pump and resistance of Acinetobacter baumannii against carbapenem DOU Qingya, ZOU Mingxiang, LI Jun, WANG Haichen, HU Yongmei, LIU Wen en ( Department of Clinical Laboratory, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha , China ) ABSTRACT Objective: To investigate relationship between AdeABC efflux pump and resistance of Acinetobacter baumannii against carbapenem. Methods: Carbapenem-resistant strains were acquired from multistep selection resistance test by meropenem in vitro. The quantitation test for sensitivities of strains before and after induction was determined by the E-test, and carbonylcyanide-m-chlorophenylhydrazone (CCCP) inhibition test was used to screen efflux pump. PCR, sequencing analysis, or real-time PCR was used to analyze the changes of regulatory genes ader and ades of the AdeABC efflux pump system, or expressions 收稿日期 (Date of reception): 第一作者 (First author): 豆清娅, linyingdqy321@163.com 通信作者 (Corresponding author): 邹明祥, zoumingxiang@126.com 基金项目 (Foundation item): 湖南省自然科学基金 (14JJ7003); 湖南省 2012 年科技基本建设投资计划 ( 湘发改高技 [2012]1493 号 ); 中南大学中央高校基本科研业务费专项资金 (2013zzts317) This work was supported by the Natural Science Foundation of Hunan Province (14JJ7003), the Capital Construstion Investment Plan in Scientific and Technologic Field of Hunan Province in 2012 ([2012]1493) and Central South University Central University Special Funding for Basic Scientific Research Business Expenses (2013zzts317), China.

2 AdeABC 外排泵系统与鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药的关系豆清娅, 等 427 of adea, adeb, ader, and ades in the strains before and after induction, respectively. Results: The minimal inhibitory concentrations (MICs) of meropenem were at 0.38 μg/ml and 0.25 μg/ml in parental sensitive strain S25595 and S7257, respectively, and the MICs of meropenem for both S25595 and S7257 after induction were more than 32 μg/ml. Compared with parental sensitive strains, the expression level of adea, adeb, ader, and ades mrna were elevated from 2.45 to 9.44 times, but there were no gene mutations or insertion sequences in the regulatory gene ades and ader. Conclusion: High expression of the AdeABC efflux pump system in Acinetobacter baumannii is closely associated with meropenem resistance. The upregulation of adea and adeb expression is not due to gene mutations in the regulatory gene ades and ader and other mechanisms might account for it. KEY WORDS Acinetobacter baumannii; AdeABC efflux pump system; carbapenem; resistant mechanism 不动杆菌属细菌是医院分离的常见革兰阴性菌, 仅次于大肠杆菌和克雷伯菌属, 其分离率已超过铜绿假单胞菌, 在非发酵菌中居首位其中, 鲍曼不动杆菌占所有不动杆菌属的 93.0%, 是引起医院感染的重要病原菌 [1] 碳青霉烯类抗菌药物( 包括美罗培南和亚胺培南 ) 曾是治疗鲍曼不动杆菌严重感染的重要抗菌药物, 然而, 近年来, 该菌对其耐药率不断上升据卫生部全国细菌耐药监测网数据显示 : 我国临床分离鲍曼不动杆菌对亚胺培南和美罗培南耐药率分别为 62.3% 和 64.0%, 多重耐药和广泛耐药分别达 80.3% 和 72.5% [2] [3] 晏群等的研究显示鲍曼不动杆菌对亚胺培南的耐药率达 87.5% 鲍曼不动杆菌如对碳青霉烯类药物耐药, 则对其他多种抗菌药物如氨基糖苷类喹诺酮类头孢菌素含 β- 内酰胺酶抑制药耐药, 导致临床治疗失败 [4-5] 主动外排系统普遍存在于各种细菌中, 它不但可以排出细菌自身的代谢产物, 而且可以排出有害的外来物质 ( 如各种抗菌药物 ), 是细菌多重耐药的重要机制 2001 年 [6] 法国学者 Magnet 等首次证实 AdeABC 外排泵系统与鲍曼不动杆菌多重耐药密切相关目前国内外对替加环素 [7-8] 环丙沙星的敏感性下降与鲍曼不动杆菌主动外排系统过度表达的机制研究较多, 但 AdeABC 外排泵及其调控基因 ades,ader 与鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药关系研究较少本研究通过对外排泵表型检测和基因分析, 探讨外排泵 AdeABC 系统与鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药的关系 1 材料与方法 1.1 材料菌株来源鲍曼不动杆菌 S25595 和 S7257 来源于临床分离菌株, 经法国梅里埃公司 Vitek2 全自动微生物鉴定系统鉴定, 对碳青酶烯类头孢菌素类喹诺酮类四环素类氨基糖苷类药物均敏感主要仪器与试剂 ABI2720 基因扩增仪 7500 型实时荧光定量 PCR 仪为美国 ABI 公司产品 ;Hoefer PS2A200 水平电泳仪为美国 Hoefer 公司产品 ;InGenius 凝胶成像分析系统为英国 Syngene 公司产品 ; 高速冷冻离心机为德国 Eppendorf 公司产品 ; 抗菌药物的 E-test 试纸条为法国梅里埃生物公司产品 ; 美罗培南干粉购自湖南省食品药品检验研究院 ; 亚胺培南干粉为美国默沙东制药有限公司产品 ; 细菌总 RNA 的提取试剂盒为天根生化科技有限公司产品 ;MH 培养基为杭州天和微生物试剂有限公司产品 ;DNA 标志物 DL2000, PrimeSTARHS DNA 聚合酶试剂盒,cDNA 合成试剂盒及 SYBRGreen 荧光定量 PCR 试剂盒购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 ;2 TaqPCR Master Mix 试剂购自北京百泰克生物技术有限公司, 溶菌酶引物购自生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司 ; 琼脂糖为西班牙 Biowest 公司产品 1.2 方法多步诱导法获得耐药菌株 1) 将敏感菌接种在血平板上, 以 35 孵育 18~24 h, 连续传代两次然后用无菌生理盐水配制浊度为 0.5 麦氏的菌悬液, 取 10 μl 接种于 2 ml 含 1/2 最低抑菌浓度 (minimal inhibitory concentration,mic) 的美罗培南的 LB(Luria-Bertani) 肉汤中, 以 180 r/min 35 恒温振荡培养 18~20 h, 连续培养 5 代在每次传代培养时接种相同菌量于不含抗菌药物的 LB 液体培养基中同时培养 2) 将菌液用 LB 肉汤稀释为 0.5 麦氏浊度, 取 10 μl 接种于 2 ml 含 MIC 美罗培南的 LB 肉汤中, 如上步骤, 连续传代培养, 直至无菌生长当菌株生长不良时

3 428 中南大学学报 ( 医学版 ), 2017, 42(4) 可用相同浓度或降低浓度重复传代, 在每次转种至另一药物浓度 LB 肉汤时, 接种含相同浓度 LB 固体培养基上, 观察细菌是否生长, 同时检测细菌的 MIC 3) 检测诱导耐药菌株的稳定性将最后一次的耐药突变菌株接种到无美罗培南的 LB 液体培养基中, 连续传代培养 10 d, 选择 MIC 值无明显变化的菌株在 80 冰箱中保存用重复序列引物聚合酶链反应 (repetitive extragenic palindromic PCR,REP- PCR) 检测耐药突变株与亲代敏感菌株的同源性, 引物 REP1,5'-IIIGCGCCGICATCAGGC-3',REP2, 5'-ACGTCTTATCAGGCCTAC-3'(I 代表次黄嘌呤 ) PCR 反应体系为 50 μl, 包括 DNA 模板 10.2 μl, 上下游引物 (10 μmol/l) 各 3.4 μl,2 TaqPCR Master Mix 25.0 μl, 灭菌双蒸馏水补足体积 PCR 扩增条件 :95 预变性 5 min;95 变性 1 min,42 退火 1 min,65 延伸 8 min,40 个循环 ;65 延伸 16 min 双蒸水为阴性对照, 取 8 μlpcr 扩增产物加入 2% 琼脂糖凝胶的加样孔中, 以 100 V 电泳 70 min 后, 在凝胶成像系统中拍照有条带的记 1, 无条带的记 0, 利用 NTsys-2.10 软件进行聚类分析, 聚类图相似系数大于 0.84,PCR 扩增条带的位置相同为同一基因型, 主条带的位置相同, 副条带相差 1~2 条的为亚型, 否则为不同基因型菌株的 MIC 用 E-test 法和琼脂稀释法检测菌株的 MIC, 根据美国临床实验室标准化研究所 2014 版标准判读 MIC 值外排泵抑制试验筛查外排泵用琼脂稀释法测定外排泵抑制剂羰基氰化物间氯苯腙 (carbonylcyanide-m-chlorophenylhydrazone,cccp) 的 MIC; 用相同方法测定加入 CCCP( 已确定的浓度 ) 前后菌株对美罗培南的 MIC, 若使用前 MIC 是使用后 MIC 的 4 倍或 4 倍以上, 则判定为外排泵阳性 [9] 荧光定量 PCR 检测外排泵基因的表达水平菌株总 RNA 的提取按试剂盒操作说明书进行菌株总 RNA 的提取, 检测 RNA 的浓度, 并取 RNA 进行电泳反转录反应 1) 反转录前需去除残留 DNA, 防止提取的总 RNA 中残留的 gdna 污染反应为 10 μl 体系, 包括去 gdna 酶 1 μl,5 gdna 酶缓冲液 2 μl, 总 RNA 1 μg, 以 RNase-free H 2 O 补足体积, 混匀, 于 42 反应 2 min, 立即放于冰上 2) 反转录体系为 20 μl, 包括步骤 1) 的反应液 10 μl,rt Primer Mix 1 μl,primescript RT 酶混合物 I 1 μl,5 Prime Script 缓冲液 2(for Real Time)4 μl, 用 RNase-free H 2 O 补足体积, 瞬时离心, 在 35 时反应 15 min, 然后 85 反应 5 s, 产物于 20 保存为防止 RNA 降解, 以上操作均在冰上进行荧光定量 PCR 扩增外排泵系统相关基因荧光定量 PCR 为 20 μl 反应体系, 包括上下游引物各 0.4 μl,cdna 模板 2 μl,2 SYBR Premix Ex Taq 10 μl,50 ROX Reference DyeII 0.4 μl, 用 RNase-free H 2 O 补足体积扩增条件为三步法第 1 步,95 30 s,1 个循环 ; 第 2 步,95 5 s,60 34 s,40 个循环 ; 第 3 步, s,60 1 min,95 15 s,1 个循环利用电泳法检测荧光定量 PCR 的引物特异性根据 2 Ct 的方法对数据进行处理,ΔCt=Ct 目的基因 Ct 内参基因, ΔΔCt=ΔCt 耐药菌株 ΔCt 敏感菌株引物序列见表 1 表 1 荧光定量 PCR 的基因引物序列 Table 1 Primer sequences of real-time PCR genes 引物序列 (5'-3') 产物长度 / bp adea F: GAGGTGGCAAGACTCAAAGTTC 113 R: GCTAGAGCCTGACGATACTGAGC adeb F: AACGGACGACCATCTTTGAGTATT 84 R: CAGTTGTTCCATTTCACGCATT ader F: CGCTCTAGTGCATCGCTATC 313 R: GCATTACGCATAGGTGCAGA ades F: TCGCAAAGCGTTTTATTGTG 176 R: GCATTTTTGACGGAAACCTC 16sRNA F: CAGCTCGTGTCGTGAGATGT 150 R: CGTAAGGGCCATGATGACTT 调控基因 ader,ades 及碳青霉烯酶基因扩增及测序分析调控基因 ader 和 ades 的检测 :PCR 为 50 μl 反应体系, 包括上下游引物各 1 μl,dna 模板 4 μl,dntp 混合物 4 μl,5 PrimeSTAR 缓冲液 10 μl,primestar HS DNA 聚合酶 0.5 μl, 用灭菌蒸馏水补足体积反应条件 : 引物 aderq,adesq,rsq 条件分别为 s,45 /50 /56 15 s,72 1 min/kb, 35 个循环 PCR 产物在 1% 琼脂糖凝胶中以 100 V 电泳 40 min 后, 在凝胶成像系统中拍照, 产物经铂尚生物技术 ( 上海 ) 有限公司测序, 结果采用 BLAST 软件进行分析, 与 GenBank 中序列比较碳青霉烯酶基因 OXA,IMP,VIM,SIM 等的检测参照本课题前期研 [10] 究进行引物序列见表 2 2 结果 2.1 亲代敏感菌株和诱导耐药菌株的 REP-PCR 结果利用 REP-PCR 对亲代敏感株 S25595 和 S7257 以及诱导耐药株 M25595 和 M7257 进行同源性分析, 亲代敏感株与诱导后相应耐药株带型一致 ( 图 1)

AdeABC 外排泵系统与鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药的关系豆清娅, 等 429 表 2 普通 PCR 的基因引物序列 Table 2 Primer sequences of general PCR genes 引物序列 (5'-3') 产物长度 /bp ader 全长 F: ATGTTTGATCATTCTTTTTCTTTTG 745 R: TTAATTAACATTTGAAATATG

4 AdeABC 外排泵系统与鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药的关系豆清娅, 等 429 表 2 普通 PCR 的基因引物序列 Table 2 Primer sequences of general PCR genes 引物序列 (5'-3') 产物长度 /bp ader 全长 F: ATGTTTGATCATTCTTTTTCTTTTG 745 R: TTAATTAACATTTGAAATATG ades 全长 F: ATGAAAAGTAAGTTAGGAATTAGTAAG R : TTAGTTATTCATAGAAATTTTTATG aders 全长 F: GCTCAGCTTGAGCGACTTCT R: GAGGGAGTGCTCGAGTTTGT 2.2 诱导前后菌株的药物敏感性及外排泵抑制试验结果 M25595 对美罗培南耐药, 对哌拉西林 / 他唑巴坦中介, 对其余药物敏感 ;M7257 对美罗培南哌拉西林 / 他唑巴坦头孢吡肟头孢他啶耐药, 对其余药物敏感 ; 在外排泵抑制实验中 CCCP 的浓度采用 μg/ml,m7257 和 M25595 加入外排泵抑制剂 CCCP 后美罗培南的 MIC 值均 < 加入 CCCP 前菌株美罗培南 MIC 值的 1/4( 表 3,4 和图 2) 600 bp M 图 1 诱导前后菌株的 REP-PCR 分型结果 Figure 1 REP-PCR results of strains before and after induction M: DNA marker; 1: S25595; 2: M25595; 3: S7257; 4: M 荧光定量 PCR 检测外排泵系统相关基因的表达水平 RNA 浓度和质量的提取提取 RNA 的 OD 260 /OD 280 均为 1.8~2.0, 浓度 > 800 ng/μl,rna 电泳时均可见 23 s rrna 和 16 s rrna 两条带, 说明提取的 RNA 质量和浓度较好 ( 图 3) 基因 ades,ader,adea,adeb,16s RNA 均有表达, 曲线成 S 形, 扩增效率一致 ( 图 4); 引物的熔解曲线为单一峰, 未见明显的非特异性峰, 说明引物的特异性好 ; 每个基因的 PCR 产物电泳结果可见明显的目的条带, 无非特异性条带, 可以进行后续的荧光定量 PCR 扩增 ( 图 5) 表 3 E-test 法检测诱导前后菌株的药敏结果 Table 3 Drug sensitivity of strains before and after induction by E-test method 药物敏感性 /(μg.ml 1 ) 菌株 FEP IPM MEM TZP AK CAZ CIP TGC S M > S M7257 > >32.00 > > FEP: 头孢吡肟 ;IPM: 亚胺培南 ;MEM: 美罗培南 ;TZP: 哌拉西林 / 他唑巴坦 ;AK: 阿米卡星 ;CAZ: 头孢他啶 ; CIP: 环丙沙星 ;TGC: 替加环素表 4 琼脂稀释法检测诱导前后菌株美罗培南的药敏结果 Table 4 Meropenem sensitivity of strains before and after induction by agar dilution method 菌株诱导前 /(μg.ml 1 ) 诱导后 /(μg.ml 1 ) MEM MEM MEM+CCCP M > M > 荧光定量 PCR 检测外排泵系统相关基因的表达量诱导后的耐药菌株 M25595 和 M7257 和亲代敏感菌相比,adeA 的表达量是亲代敏感菌株的 9.44 和 3.45 倍,adeB 的表达量是亲代敏感菌株的 3.57 和 5.79 倍, 基因 ades 和 ader 的表达量也有明显上升 ( 表 5)

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OXA-23,OXA-58,OXA-24,IMP,VIM 及 SIM 均为阴性 ( 图 6) 对 AdeABC 外排泵的调控基因 ader 和 ades 的碱基序列进行比对分析, 各菌株的亲代敏感菌株及其耐药突变菌株的基因序列一致性为 100%,

genes by PCR amplification 图 5 荧光定量 PCR 电泳图 Figure 5 Real-time PCR electropherogram M: DNA marker; 1 2: ades; 3 4: ader; 5 6:

ader, and ades in strains before and after induction 标本号 ades 相对量 ader 相对量 adea 相对量 adeb 相对量 S25595 1.00 1.00 1.00 1.00 M25595 3.

5 430 中南大学学报 ( 医学版 ), 2017, 42(4) 图 2 诱导前后菌株的部分 E-test 结果 Figure 2 Part of the E-test results of strains before and after induction 23 s 16 s OXA-23,OXA-58,OXA-24,IMP,VIM 及 SIM 均为阴性 ( 图 6) 对 AdeABC 外排泵的调控基因 ader 和 ades 的碱基序列进行比对分析, 各菌株的亲代敏感菌株及其耐药突变菌株的基因序列一致性为 100%, 没有基因突变或插入序列 ( 图 7~12) 图 3 RNA 电泳图 Figure 3 RNA electropherogram 1: S25595; 2: M25595; 3: S7257; 4:M bp M ΔRn Cycle 图 4 5 种基因 S 型曲线扩增图 Figure 4 S type curves present in 5 genes by PCR amplification 图 5 荧光定量 PCR 电泳图 Figure 5 Real-time PCR electropherogram M: DNA marker; 1 2: ades; 3 4: ader; 5 6: adea; 7 8: adeb; 9 10: 16 s RNA M N 表 5 诱导前后菌株的 ades,ader,adea 及 adeb 表达量 Table 5 Gene expressions of adea, adeb, ader, and ades in strains before and after induction 标本号 ades 相对量 ader 相对量 adea 相对量 adeb 相对量 S M S M 碳青霉烯酶基因及 ader 和 ades 基因的扩增及测序分析结果 2 株鲍曼不动杆菌诱导前后 OXA-51 均为阳性, 而图 6 多重 PCR 检测碳青霉烯酶基因电泳图 Figure 6 genes 500 bp Multiplex PCR electropherogram for carbapenem M: DNA marker; N: Negative control; 1: S25595; 2: M25595; 3: S7257; 4: M7257

AdeABC 外排泵系统与鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药的关系豆清娅, 等 431 M 1 2 3 4 5 6 7 8 M N 1 2 3 4 500 bp 500 bp 图 7 ader 和 ades

aders 基因扩增电泳图 Figure 8 PCR electropherogram for the aders gene M: DNA marker; N: Negative control; 1:

ader gene PCR product 图 10 ades 基因 PCR 产物部分测序结果图 Figure 10 Sequencing results for part of the ades gene PCR

6 AdeABC 外排泵系统与鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药的关系豆清娅, 等 431 M M N bp 500 bp 图 7 ader 和 ades 基因扩增电泳图 Figure 7 PCR electropherogram for the ader and ades genes M: DNA marker; 1 4: ader; 5 8: ades 图 8 aders 基因扩增电泳图 Figure 8 PCR electropherogram for the aders gene M: DNA marker; N: Negative control; 1: S25595; 2: M25595; 3: S7257; 4: M7257 图 9 ader 基因 PCR 产物部分测序结果图 Figure 9 Sequencing results for part of the ader gene PCR product 图 10 ades 基因 PCR 产物部分测序结果图 Figure 10 Sequencing results for part of the ades gene PCR product 图 11 S25595 和 M25595 菌株的 aders 基因测序结果比对图 Figure 11 Comparison of gene sequencing results of S25595 and M25595 strains

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7 432 中南大学学报 ( 医学版 ), 2017, 42(4) 图 12 S7257 和 M7257 菌株的 aders 基因测序结果比对图 Figure 12 Comparison of gene sequencing results of S7257 and M7257 strains 3 讨论 AdeABC 外排泵由膜融合蛋白 (AdeA) 外排蛋白 (AdeB) 和外膜通道蛋白 (AdeC) 组成,AdeA 和 AdeB 共同表达 AdeC 缺失时细菌的耐药性没有明显变化 [11], 说明 AdeC 可能并不是这个外排泵系统所必需的蛋白 ;AdeABC 外排泵受上游基因 ades 和 ader 编码蛋白质的严密调控,adeS 和 ader 基因反向转录, 分别编码感受器蛋白和调节器蛋白, 当环境条件改变时, 感受器蛋白 AdeS 受到刺激, 在组氨酸位点处自身磷酸化, 然后将磷酸基转移到调节器蛋白 AdeR 的天冬氨酸上,AdeR 磷酸化后可以增强外排泵 AdeABC 的表达 ;AdeS 的磷酸酶可以使 AdeR 去磷酸化,AdeS 通过对 AdeR 磷酸化或去磷酸化两种状态进行调节, [12] 进而控制外排泵 AdeABC 的表达 Jia 等发现在 102 株实验菌株中 90 株携带 AdeABC 外排泵相关基因本研究中亲代敏感株和诱导耐药株 AdeA,AdeB,AdeR 及 AdeS 等 PCR 结果均阳性, 同时,CCCP 外排泵抑制试验阳性, 说明实验菌株具有完整的 AdeABC 外排泵系统为探讨 AdeABC 外排泵系统与碳青霉烯类耐药的关系, 本研究采用碳青霉烯类药物对敏感菌株进行诱导以获得相应耐药菌株, 但在诱导耐药过程中发现亚胺培南不易诱导出耐药菌株, 最终选择美罗培南进行耐药菌株的诱导结果显示 : 美罗培南诱导出的耐药菌株对美罗培南高度耐药, 对亚胺培南耐药性虽有所上升, 但仍在敏感范围诱导后菌株对其他抗菌药物的敏感性也均有不同程度上升与亲代菌株相比, 诱导菌株 M7257 对头孢他啶哌拉西林 / 他唑巴坦美罗培南头孢吡肟等 β- 内酰胺类抗菌药物上升明显, 且均由敏感变为耐药, 而对阿米卡星环丙沙星以及替加环素耐药性上升不明显, M25595 也有类似特征, 说明在鲍曼不动杆菌中,β- 内酰胺类抗菌药物是 AdeABC 外排泵系统的良好底物, 与其耐药性密切相关, 而其他类抗菌药物的耐 [13] 药性可能与该外排泵系统关系不大 Wong 等将 adeb 基因敲除后亚胺培南的 MIC 值无变化, 美罗培南 MIC 值变为原菌株的 1/4, 提示 adeb 可能与美罗培南耐药密切相关, 而与亚胺培南关系不大在本研究中, 诱导菌株 M25595 和 M7257 对亚胺培南均敏感, 而对美罗培南耐药, 与上述研究结论一致外排泵抑制试验显示 : 加入外排泵抑制剂 CCCP 后美罗培南的 MIC 值均低于加入 CCCP 前菌株的美罗培南 MIC 值的 1/4 表明外排泵 AdeABC 系统对美罗培南具有明显的外排作用荧光定量 PCR 结果显示诱导后的耐药菌株 M25595 和 M7257 和亲代敏感菌相比,adeA, adeb,ades 及 ader 的表达量均有明显上升, 说明外排泵 AdeABC 外排泵系统的高表达是导致其耐药性上升的重要原因外排泵 AdeABC 的表达受上游的基因 ades 和 ader 的严密调控 [14] ades 和 ader 中的基因突变或插入序列可能与外排泵 AdeABC 的过度表达有关 Marchand [11] 等证实 AdeR 的 116 位亮氨酸代替脯氨酸, 可能增强了 AdeR 与 DNA 的结合能力 ;AdeS 的 153 位的苏氨酸突变为蛋氨酸, 可能阻止 AdeR 的脱磷酸化作用, 从 [15] 而激活外排泵系统, 使 AdeABC 高表达 Yoon 等发现在外排泵 AdeABC 高表达的菌株中 aders 基因有两个高突变区, 包括 ades 的 149 位组氨酸附近 ader 基因的 DNA 结合区域为探讨鲍曼不动杆菌耐药菌株 AdeABC 表达升高是否由 ader 和 ades 基因突变所致, 笔者对诱导前后菌株的主要碳青霉烯酶进行了检测, 同时对调控基因 ader 和 ades 进行序列分析, 结果显示 : 除鲍曼不动杆菌保守基因 OXA-51 以外, 亲代菌株未发现其他主要碳青霉烯酶基因, 且诱导后未

8 AdeABC 外排泵系统与鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药的关系豆清娅, 等 433 出现新的碳青霉烯酶基因,adeR 和 ades 的碱基序列也未出现位点突变以及插入序列推测外排泵 AdeABC 表达上升可能有其他机制如外膜蛋白等缺失共同参与, 有待进一步研究参考文献 [1] 胡付品, 朱德妹, 汪复, 等年中国 CHINET 细菌耐药性监测 [ J]. 中国感染与化疗杂志, 2015, 15(5): HU Fupin, ZHU Demei, WANG Fu, et al. CHINET 2014 surveillance of bacterial resistance in China[ J]. Chinese Journal of Infect Chemotherapy, 2015, 15(5): [2] 李耘, 吕媛, 薛峰, 等. 卫生部全国细菌耐药监测网 (Mohnarin) 年革兰阴性菌耐药监测报告 [ J]. 中国临床药理学杂志, 2014, 30(3): LI Yun, LÜ Yuan, XUE Feng, et al. Antimicrobial susceptibility surveillance of gram-negative bacterial from Mohnarin [ J]. Chinese Journal of Clinical Pharmacology, 2014, 30(3): [3] 晏群, 邓爽, 李虹玲, 等. 鲍曼不动杆菌的同源性及碳青霉烯酶基因分析 [ J]. 中南大学学报 ( 医学版 ), 2012, 37(11): YAN Qun, DENG Shuang, LI Hongling, et al. Homology and carbapenemase gene in Acinetobacter baumannii[ J]. Journal of Central South University. Medical Science, 2012, 37(11): [4] 陈佰义, 何礼贤, 胡必杰, 等. 中国鲍曼不动杆菌感染诊治与防控专家共识 [ J]. 中国医药科学, 2012, 2(8): 3-8. CHEN Baiyi, HE Lixian, HU Bijie, et al. Dagnosis and treatment of Acinetobacter baumannii infection and prevention and control expert consensus in China[ J]. China Medicine and Pharmacy, 2012, 2(8): 3-8. [5] 何禄娟, 孟婕, 黄大毛, 等. ICU 多重耐药鲍曼不动杆菌血流感染的回顾性分析 [ J]. 中南大学学报 ( 医学版 ), 2015, 40(12): HE Lujuan, MENG Jie, HUANG Damao, et al. Multidrugresistant Acinetobacter Baumannii infection in Intensive Care Unit: A retrospective analysis[ J]. Journal of Central South University. Medical Science, 2015, 40(12): [6] Magnet S, Courvalin P, Lambert T. Resistance-nodulation-cell division-type efflux pump involved in aminoglycoside resistance in Acinetobacter baumannii strain BM4454[ J]. Antimicrob Agents Chemother, 2001, 45(12): [7] Deng M, Zhu MH, Li JJ, et al. Molecular epidemiology and mechanisms of tigecycline resistance in clinical isolates of Acinetobacter baumannii from a Chinese university hospital[ J]. Antimicrob Agents Chemother, 2014, 58(1): [8] Lin MF, Lin YY, Tu CC, et al. Distribution of different efflux pump genes in clinical isolates of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii and their correlation with antimicrobial resistance[ J]. J Microbiol Immunol Infect, 2017, 50(2): [9] 王同慧, 凌保东. 碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌 adeb 外排泵基因表达与多重耐药相关的研究 [ J]. 中国抗生素杂志, 2013, 38(11): WANG Tonghui, LING Baodong. Research on the expression of the efflux pump gene adeb in carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii and related to multidrug resistance[ J]. Chinese Journal of Antibiotics, 2013, 38(11): [10] 豆清娅, 邹明祥, 李军, 等. 耐碳青霉烯类鲍氏不动杆菌碳青霉烯酶基因型及插入序列 ISAba1 研究 [ J]. 中华医院感染学杂志, 2014, 24(9): DOU Qingya, ZOU Mingxiang, LI Jun, et al. Study on carbapenemase genotypes in carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii and insertion sequence ISAba1[ J]. Chinese Journal of Nosocomiology, 2014, 24(9): [11] Marchand I, Damier-Piolle L, Courvalin P, et al. Expression of the RND-type efflux pump AdeABC in Acinetobacter baumannii is regulated by the AdeRS two-component system[ J]. Antimicrob Agents Chemother, 2004, 48(9): [12] Jia W, Li C, Zhang H, et al. Prevalence of genes of OXA-23 carbapenemase and AdeABC efflux pump associated with multidrug resistance of Acinetobacter baumannii isolates in the ICU of a comprehensive hospital of Northwestern China[ J]. Int J Environ Res Public Health, 2015, 12(8): [13] Wong EW, Yusof MY, Mansor MB, et al. Disruption of adeb gene has a greater effect on resistance to meropenems than adea gene in Acinetobacter spp. isolated from University Malaya Medical Centre[ J]. Singapore Med J, 2009, 50(8): [14] Hornsey M, Ellington MJ, Doumith M, et al. AdeABC-mediated efflux and tigecycline MICs for epidemic clones of Acinetobacter baumannii[ J]. J Antimicrob Chemother, 2010, 65(8): [15] Yoon EJ, Courvalin P, Grillot-Courvalin C. RND-type efflux pumps in multidrug-resistant clinical isolates of Acinetobacter baumannii: major role for AdeABC overexpression and AdeRS mutations[ J]. Antimicrob Agents Chemother, 2013, 57(7): ( 本文编辑陈丽文 ) 本文引用 : 豆清娅, 邹明祥, 李军, 王海晨, 胡咏梅, 刘文恩. AdeABC 外排泵系统与鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药的关系 [ J]. 中南大学学报 ( 医学版 ), 2017, 42(4): DOI: /j.issn Cite this article as: DOU Qingya, ZOU Mingxiang, LI Jun, WANG Haichen, HU Yongmei, LIU Wen en. AdeABC efflux pump and resistance of Acinetobacter baumannii against carbapenem[ J]. Journal of Central South University. Medical Science, 2017, 42(4): DOI: / j.issn

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

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