茂县土地岭大熊猫走廊带

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1 中国组织工程研究第 16 卷第 40 期出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research September 30, 2012 Vol.16, No.40 doi: /j.issn [ 张力丹, 罗彦彦, 林青, 任向荣, 苏绍波, 林有坤. 小鼠次级淋巴组织趋化因子的原核表达及纯化 [J]. 中国组织工程研究,2012,16(40): 小鼠次级淋巴组织趋化因子的原核表达及纯化 ** 张力丹 1, 罗彦彦 1, 林青 2, 任向荣 2, 苏绍波 2 1, 林有坤文章亮点 : 实验成功构建了次级淋巴组织趋化因子 CCL21 基因的原核表达载体 pben-ccl21, 并获得相应的融合蛋白结果显示 CCL21 可在大肠杆菌中高效表达, 经链霉亲和柱层析纯化即可获得 CCL21 重组目的蛋白关键词 : 原核表达 ;CCL21; 蛋白纯化 ; 大肠杆菌 ; 小鼠缩略语 : 次级淋巴组织趋化因子 :secondary lymphoid-tissue chemokine,slc/ccl21 摘要背景 : 次级淋巴组织趋化因子 (secondary lymphoid-tissue chemokine,slc/ccl21) 是近年来发现的, 具有免疫调节作用及抗肿瘤活性目的 : 构建小鼠次级淋巴组织趋化因子原核表达载体, 并在大肠杆菌中高效表达重组蛋白方法 : 取 C57BL/6 小鼠淋巴结细胞, 体外用 Poly(I:C) 刺激后提取 RNA 并反转录, 以此 cdna 为模板, 通过 PCR 技术扩增出 CCL21 成熟蛋白编码序列克隆入原核表达载体 pben-sbp-set1a, 构建融合表达载体 pben-ccl21 将表达载体转化大肠杆菌 BL21(DE3), 经异丙基 -β-d- 硫代吡喃半乳糖苷诱导后 TRICINE-SDS-PAGE 电泳分析和鉴定重组蛋白的表达 CCL21 融合蛋白经链霉亲和柱层析纯化结果与结论 : 实验成功构建了 CCL21 基因的原核表达载体 pben-ccl21, 并获得相应的融合蛋白结果显示 CCL21 可在大肠杆菌中高效表达, 经链霉亲和柱层析纯化即可获得 CCL21 重组目的蛋白 Prokaryotic expression and purification of mouse secondary lymphoid-tissue chemokine Zhang Li-dan 1, Luo Yan-yan 1, Lin Qing 2, Ren Xiang-rong 2, Su Shao-bo 2, Lin You-kun 1 Abstract BACKGROUND: Secondary lymphoid-tissue chemokin (CCL21) is a recently discovered chemotactic factor with a broad range of immunoregulatory activities and anti-tumor effects. OBJECTIVE: To establish the prokaryotic expression vector of mouse CCL21, and highly express the recombinant protein in Escherichia coli. METHODS: Lymph node cells in C57BL/6 mice were collected and subsequently stimulated using Poly(I:C) in vitro, then its extracted RNA was reverse-transcripted. This cdna was used as template in polymerase chain reaction amplification to collect CCL21 coding sequence. The gene was cloned into the prokaryotic expression vector pben-ccl21 and was expressed in Escherichia coli BL21 on the induction of isopropy-β-d-thiogalactoside. Then the recombinant protein expression were analyzed by TRICINE-SDS-PAGE electrophoresis and purified by streptevidin affinity chromatography. 1 广西医科大学第一附属医院皮肤性病科, 广西壮族自治区南宁市 ; 2 中山大学中山眼科中心, 眼科学国家重点实验室, 广东省广州市张力丹, 女,1987 年生, 贵州省遵义市人, 汉族,2010 年广西医科大学毕业, 主要从事结缔组织病的研究 lidan311@ yahoo.com.cn 通讯作者 : 林有坤, 主任医师, 广西医科大学第一附属医院皮肤性病科, 广西壮族自治区南宁市 linyoukun7@ yahoo.com.cn 中图分类号 :R318 文献标识码 :B 文章编号 : (2012) 收稿日期 : 修回日期 : ( /WL C) RESULTS AND CONCLUSION: The prokaryotic expression vector pben-ccl21 of mouse CCL21 gene was successfully constructed, and the fusion protein was obtained. The experiment proves that CCL21 can be highly expressed in Escherichia coli BL21, and the CCL21 target protein can be obtained by streptevidin affinity chromatography. Zhang LD, Luo YY, Lin Q, Ren XR, Su SB, Lin YK. Prokaryotic expression and purification of mouse secondary lymphoid-tissue chemokine.zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2012;16(40): ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 7491

2 张力丹, 等. 小鼠次级淋巴组织趋化因子的原核表达及纯化 1 Department of China; 2 State Key Laboratory of Ophthalmology, Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University, Guangzhou , Guangdong Province, China Zhang Li-dan, Department of China lidan311@yahoo. com.cn Corresponding author: Lin You-kun, Chief physician, Department of China linyoukun7@yahoo. com.cn Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No *, * Received: Accepted: 引言次级淋巴组织趋化因子 (secondary lymphoid-tissue chemokine,slc/ccl21) 是 CC 类趋化因子, 其受体为 CCR7 [1], 两者结合后趋化成熟的树突状细胞淋巴细胞 NK 细胞等到外周淋巴组织或器官 [2-5] 在淋巴细胞的迁移归巢炎症反应 HIV 感染移植排斥等生理病理过程中发挥着重要作用 [6-10] Sharma [11] 等对 CCL21 在肿瘤治疗等方面的研究证实, CCL21 通过大量聚集免疫效应细胞到肿瘤组织, 引发非特异性免疫应答实验应用 DNA 重组技术构建了次级淋巴组织趋化因子表达质粒, 通过核酸序列分析进行鉴定后将其转化入大肠杆菌 BL21(DE3) 中, 使其在原核系统中高效表达, 为下一步分析 CCL21 蛋白的特性与功能, 阐明其在自身免疫疾病器官特异性免疫中的作用奠定基础 [12-14] 1 材料和方法设计 : 观察性实验时间及地点 : 实验于 /09 在中山大学中山眼科中心, 眼科学国家重点实验室完成材料 : 动物 : 雌性 C57BL/6 小鼠 4 只, 鼠龄 6-8 周, 体质量 g, 购自中山大学实验动物中心载体 : 表达载体 pben-sbp-set1a 购自 STRATAGENE 公司, 载体的特性为 : 全长 bp, 含有 SBP Tag( 纯化标签, 约 4 900) 和 SET Tag( 促可溶标签, 约 4 500),T7Lac 启动子,Amp 抗性试剂主要试剂 : 高保真 DNA 聚合酶 Premix PrimeSTAR HS T 4 DNA 连接酶限制性内切酶 (BamH Ⅰ 和 Hind Ⅲ) 质粒抽提试剂盒胶回收试剂盒 Trizol 反转录酶 Poly(I:C) 大肠杆菌 BL21(DE3) 感受态细胞来源 TaKaRa 公司 Invitrogen 公司 Sigma 公司 TIANGEN 公司主要仪器 : 仪器来源 CO 2 培养箱 HERA Cell Heraeus, 德国倒置荧光显微镜 IX70-S1F2 生 Olympus, 日本物显微镜 BX41TF 生物安全柜 HF safe1200 Heal Force, 香港扫描酶标仪 MAX340PC molecular device, 英国垂直电泳系统 Mini PROTEAN Bio-Rad, 美国 3 Cell 转移仪 Trans-Blot SD Cell 紫外分光光度计电泳仪 ( 琼脂糖凝胶 DNA 电泳 ) 激光扫描共聚焦显微镜 Nikon, 日本 TE-2000E 台式高速冷冻离心机 5810R Eppendorf, 德国热磁力搅拌器 1000 Jenway, 美国超低温冰箱 982 Thermo, 美国循环水浴培养箱 1013 GFL, 德国酸度计 MP200 Mettler Toledo, 瑞士 PCR 扩增仪 PTC-200 MJ Research, 美国凝胶成像分析系统 SYNGENE, 美国电子天平 BP310S Sartorius, 德国实验方法 : cdna 的获得 : 麻醉状态下取 C57BL/6 小鼠腹股沟淋巴结, 研磨后制成单细胞悬液, 加入 Poly(I:C)(100 mg/l) 刺激,37 培养 6 h, 离心收集细胞, 用 Trizol 重悬, 提取总 RNA, 反转录成 cdna 引物的设计与合成 : 登录 GenBank 查找小鼠 CCL21 核酸序列信息, 参考文献报道选择合适的序列 (NM_ ), 去除信号肽序列, 以编码成熟肽的 330 bp( ) 核酸序列为模板设计引物, 由上海英骏生物技术有限公司合成上游引物序列 :5 -GCG GGA TCC AGT GAT GGA GGG GGT CAG GA-3 ; 下游引物序列 :5 -GCG CTA AGC TTG TCC TCT TGA GGG CTG TG-3 其中, 在上下游引物中分别加入了限制性核酸内切酶 BamH Ⅰ 和 Hind Ⅲ 的酶切位点, 以便 CCL21 核酸片段定向克隆于相应的酶切位点上, 保证阅读框架的正确性和完整性此外, 在 BamH Ⅰ 和 Hind Ⅲ 的 5 端引入 3 个保护性碱基, 以利于酶切反应的进行 CCL21 片段的扩增与纯化 :PCR 反应体系为 : 模板 cdna 10 μl,2 Premix PrimeSTAR DNA 聚合酶 25 μl, 无菌蒸馏水 13 μl, 引物 2 μl, 7492 P.O. Box 1200, Shenyang

张力丹, 等. 小鼠次级淋巴组织趋化因子的原核表达及纯化 www.crter.org 总体积 50 μl PCR 扩增条件 :98 10 s,55 5 s, 72 30 s,40 个循环, 反应结束前 72 延伸 7 min PCR 产物经 SYBR Green Ⅰ 核酸凝胶染料染色 1.

3 张力丹, 等. 小鼠次级淋巴组织趋化因子的原核表达及纯化总体积 50 μl PCR 扩增条件 :98 10 s,55 5 s, s,40 个循环, 反应结束前 72 延伸 7 min PCR 产物经 SYBR Green Ⅰ 核酸凝胶染料染色 1.2% 琼脂糖凝胶进行电泳, 在凝胶成像分析系统紫外光下进行拍照和图像分析 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳后, 在紫外照射下切下含有目的基因 CCL21 片段的凝胶块, 采用小量胶回收试剂盒回收 DNA 原核表达载体的构建 : 将目的基因 CCL21 和载体 pben-sbp-set1a 分别进行双酶切 (BamH Ⅰ Hind Ⅲ), 经琼脂糖凝胶电泳后回收酶切产物进行连接, 转化感受态细菌 BL21(DE3) 挑取克隆接种于含 100 mg/l 氨苄青霉素的 LB 培养液中培养, 破裂细胞提取质粒, 进行基因测序鉴定原核表达载体 pben-ccl21 的框架图见图 bp ampicillin pbr322 ori The vector contains the following elements or encoding sequences: T7 promoter with lac Operon, extended ribosome binding site, solubility enhancement tag 1 (SET1 tag), streptavidin binding peptide (SBP tag), multiple cloning site, T7 terminator, ampicillin resistance (bla) ORF, pbr322 origin of replication and laci repressor ORF Figure 1 Schematic representation of the pben-secondary lymphoid-tissue chemokine recombinant vector 图 1 pben-ccl21 重组载体构建图振荡过夜将菌液按 1% 接种于 200 ml 含 100 mg/l 氨苄青霉素的 LB 培养液,37 剧烈振荡 3 h, 直至 A 600 nm 为加入诱导剂 IPTG 至终浓度 0.5 mmol/l,37 继续振荡 5 h g 离心 15 min 收集细菌 CCL21 目的蛋白的纯化 : 加 streptavidin binding buffer(10 mmol/l Tris Hcl, 150 mmol/l NaCl, ph=8.0)100 ml 重悬菌体,4 振荡 30 min 超声破碎细菌直至黏稠菌液变清亮 g 离心 5 min, 收集上清取 2 ml Streptavidin 纯化填料装入聚丙烯纯化柱, 加入 8 ml 超声碎菌后收集的上清 ( 经之前 SDS-PAGE 分析表明, 目的蛋白以分泌形式表达的比例居多 ), 再加入苯甲基磺酰氟 (PMSF, 蛋白酶抑制剂 ) 至终浓度为 1 mmol/l,4 200 r/min 振荡充分结合 1 h, 收集流出液, 置 4 保存用 streptavidin binding buffer 洗去杂蛋白, 直至吸光度小于 0.01 共流洗 4 次, 每次 8 ml, 收集流洗液, 置 4 保存用 streptavidin low salt Elution Buffer(10 mmol/l Tris HCl,150 mmol/l NaCl, 2 mmol/l Biotin, ph=8.0) 洗脱结合于 Streptavidin Resin 的目的蛋白共洗 13 次, 每次 1.5 ml, 收集洗脱液, 置 4 保存将上述收集的 Elution 洗脱液进行 SDS-PAGE 电泳主要观察指标 : 扩增的 CCL21 基因片段是否与预期的目的核酸片段相同 ; 重组克隆载体 pben-ccl21 目的片段序列与 GenBank 的 CCL21 相对应基因序列是否 (NM_ ) 完全一致 ; 重组目的蛋白的表达形式 ; 目的蛋白的最优表达时间 ; 经 SDS-PAGE 蛋白电泳分析, 是否能得到纯化的 CCL21 目的蛋白条带 CCL21 蛋白的诱导表达 : 将重组质粒 pben-ccl21 转化 BL21(DE3) 感受态细胞, 挑取单个菌落, 接种于 3 ml LB( 含 100 mg/l 氨苄青霉素 ), r/min 振荡培养过夜吸取 100 μl 加到 10 ml 新鲜的 LB 培养液中 ( 含 100 mg/l 氨苄青霉素 ),37 培养 3 h, 直至 A 595 nm 约为 0.6, 加入 IPTG 终浓度 0.5 mmol/l 继续培养, 分别于 1, 2,3,4,5,6,7 h 各取 1 ml 菌液以未加 IPTG 诱导的重组质粒转化细菌为对照 CCL21 重组蛋白的电泳分析 : 将细菌培养物 1 ml 于 4 离心收集细菌加适量的蛋白上样缓冲液, 煮沸 10 min 后进行 15%TRICINE-SDS-PAGE 电泳, 经考马斯亮蓝染色后观察 CCL21 目的蛋白的大量表达 : 将含有重组原核表达质粒 pben-ccl21 的大肠杆菌 BL21(DE3) 接种于 3 ml 含 100 mg/l 氨苄青霉素的 LB 培养液, r/min 2 结果 2.1 CCL21 基因片段扩增将 PCR 产物行 1.2% 琼脂糖凝胶电泳, 可见到预期的 336 bp 大小的目的核酸片段, 见图 bp bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp M CCL21 Figure 2 PCR products of secondary lymphoid-tissue chemokin in agarose gel 图 2 PCR 检测 CCL21 基因产物的琼脂糖电泳图 ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 7493

www.crter.org 张力丹, 等. 小鼠次级淋巴组织趋化因子的原核表达及纯化 2.2 重组载体的鉴定将重组克隆载体 pben-ccl21 经 Invitrogen( 上海 ) 公司测序验证, 目的片段序列与 GenBank 的 CCL21 相对应基因序列 (NM_011124.

3 目的蛋白的诱导表达将重组质粒 pben-ccl21 转化大肠杆菌 BL21(DE3),37 培养至 A 值 0.6, 再经 IPTG 0.

M: Protein marker; 1: Uninduced bacteria lysate;2-8: Bacteria lysates expressed after treatment with 0.5 mmol/l isopropy-β-dthiogalactoside for 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 h, respectively.

4 张力丹, 等. 小鼠次级淋巴组织趋化因子的原核表达及纯化 2.2 重组载体的鉴定将重组克隆载体 pben-ccl21 经 Invitrogen( 上海 ) 公司测序验证, 目的片段序列与 GenBank 的 CCL21 相对应基因序列 (NM_ ) 完全一致, 见图 3 后达到高峰, 之后未见蛋白表达量明显增加, 见图 5 1 M Figure 3 Sequencing result of recombinant cloning vector secondary lymphoid-tissue chemokin 图 3 重组克隆载体 pben-ccl21 测序结果 2.3 目的蛋白的诱导表达将重组质粒 pben-ccl21 转化大肠杆菌 BL21(DE3),37 培养至 A 值 0.6, 再经 IPTG 0.5 mmol/l 诱导 5 h, 收集菌体进行超声, 将超声后的沉淀和上清进行 SDS-PAGE 电泳, 结果显示, CCL21 以可溶性融合蛋白形式表达, 超声上清中, 在相对分子质量约处有一特异性带出现, 与预期 CCL21 重组融合蛋白相对分子质量相符合超声沉淀中未见明显蛋白表达, 见图 4 表明重组目的蛋白以可溶性的形式存在, 适合进行非变性条件下的蛋白纯化 M: Protein marker; 1: Uninduced bacteria lysate;2-8: Bacteria lysates expressed after treatment with 0.5 mmol/l isopropy-β-dthiogalactoside for 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 h, respectively. The arrow indicates tagged secondary lymphoid-tissue chemokin Figure 5 SDS-PAGE analysis of secondary lymphoid-tissue chemokin recombinant protein expressed for different periods 图 5 SDS-PAGE 分析 CCL21 重组蛋白不同时间点的诱导表达 2.5 目的蛋白的分离纯化采用 Streptavidin 亲和层析系统, 纯化细菌裂解液上清, 采用 streptavidin binding buffer 洗去杂蛋白,streptavidin low salt Elution Buffer 洗脱目的蛋白, 收集洗脱溶液, 经 SDS-PAGE 蛋白电泳分析,CCL21 目的蛋白经过纯化可得到相对分子质量约为的单一目的蛋白条带, 见图 6 M 1 M M: Protein marker; 1: Purified secondary lymphoid-tissue chemokin Figure 6 SDS-PAGE analysis of purified secondary lymphoid-tissue chemokin 图 6 SDS-PAGE 分析纯化的 CCL21 M: Protein marker; 1, 3, 5, 7: Control (non-induced); 2, 4: Precipitation fraction; 6, 8: Soluble fraction of secondary lymphoid-tissue chemokin induced by isopropy-β-d-thiogalactoside Figure 4 Expression and identification of secondary lymphoid-tissue chemokin protein by SDS-PAGE analysis 图 4 SDS-PAGE 分析 CCL21 蛋白的表达形式及鉴定 2.4 目的蛋白表达的时间优化将重组质粒 pben-ccl21 转化大肠杆菌 BL21(DE3),IPTG( 终浓度 0.5 mmol/l) 诱导表达, 分别于诱导后 1,2,3,4,5, 6,7 h 取 1 ml 菌液, 菌体超声后取上清进行检测结果显示, 在诱导后 1 h 即可在上清中检测到 CCL21 以可溶性融合蛋白形式表达, 表达量随时间延长而增加,5 h 3 讨论 CCL21 又称 SLC 或 6Ckine, 属于 CC 类趋化因子, 主要由活化的 T 淋巴细胞和内皮细胞等产生高表达于高内皮小静脉派氏结节脾脏及淋巴结的 T 细胞区 [15] 对多种免疫细胞特别是 T 淋巴细胞树突状细胞具有趋化作用 [16-17] 在抗肿瘤的免疫反应中,CCL21 的受体 CCR7 在 T 淋巴细树突状细胞 NK 细胞等免疫细胞膜表面表达, 通过大量吸引聚集免疫效应细胞到肿瘤组织, 引发非特异性免疫应答, 从而抑制肿瘤血管的形成 7494 P.O. Box 1200, Shenyang

5 张力丹, 等. 小鼠次级淋巴组织趋化因子的原核表达及纯化和肿瘤的生长 [18-20] 为进一步观察 CCL21 在体内外的免疫作用, 实验应用所设计的上游引物 BamH Ⅰ 酶切位点及下游引物 Hind Ⅲ 酶切位点, 将编码 CCL21 氨基酸序列的核酸片段定向连接到质粒 pben-sbp-set1a 的相应位点, 保证了插入片段方向的正确性然后以小鼠淋巴细胞的 cdna 为模板进行 PCR 扩增, 获得了 336 bp 大小的目的片段 CCL21 成熟编码区, 构建重组质粒 pben-ccl21 亚克隆, 经测序证实 pben-ccl21 重组质粒目的基因核酸序列完全正确而后经 IPTG 诱导, 于大肠杆菌中得到目的重组蛋白的大量表达再通过 Streptavidin Resin 纯化重组目的蛋白, 最终获得了相对分子质量大小约为的特异性目的蛋白条带与以往实验相比, 本实验首次构建了重组质粒 pben-ccl21 亚克隆, 在大肠杆菌 (E.coli) 作为宿主的情况下, 使用 pben 作为载体, 提供了一种针对 CCL21 蛋白表达的解决方法同时其中的 SET1 SBP 标签增强了蛋白的可溶性, 从而提高了 CCL21 的纯化效率 CCL21 蛋白的成功表达及纯化为进一步研究其生化特性功能以及探讨 CCL21 体内基因治疗肿瘤的可行性奠定了基础 4 参考文献 [1] Förster R, Davalos-Misslitz AC, Rot A. CCR7 and its ligands: balancing immunity and tolerance. Nat Rev Immunol. 2008; 8(5): [2] Sheridan BS, Lefrançois L. Regional and mucosal memory T cells. Nat Immunol. 2011;12(6): [3] Okada N, Mori N, Koretomo R, et al. Augmentation of the migratory ability of DC-based vaccine into regional lymph nodes by efficient CCR7 gene transduction. Gene Ther. 2005;12(2): [4] Moretta A, Marcenaro E, Parolini S, et al. NK cells at the interface between innate and adaptive immunity. Cell Death Differ. 2008;15(2): [5] Berahovich RD, Lai NL, Wei Z, et al. Evidence for NK cell subsets based on chemokine receptor expression. J Immunol. 2006;177(11): [6] Itakura M, Tokuda A, Kimura H, et al. Blockade of secondary lymphoid tissue chemokine exacerbates Propionibacterium acnes-induced acute lung inflammation. J Immunol. 2001; 166(3): [7] Baekkevold ES, Yamanaka T, Palframan RT, et al. The CCR7 ligand elc (CCL19) is transcytosed in high endothelial venules and mediates T cell recruitment. J Exp Med. 2001;193(9): [8] Saleh S, Solomon A, Wightman F, et al. CCR7 ligands CCL19 and CCL21 increase permissiveness of resting memory CD4+ T cells to HIV-1 infection: a novel model of HIV-1 latency. Blood. 2007;110(13): [9] Ziegler E, Oberbarnscheidt M, Bulfone-Paus S, et al. CCR7 signaling inhibits T cell proliferation. J Immunol. 2007;179(10): [10] Wang L, Han R, Lee I, et al. Permanent survival of fully MHC-mismatched islet allografts by targeting a single chemokine receptor pathway. J Immunol. 2005;175(10): [11] Sharma S, Stolina M, Zhu L, et al. Secondary lymphoid organ chemokine reduces pulmonary tumor burden in spontaneous murine bronchoalveolar cell carcinoma. Cancer Res. 2001; 61(17): [12] Kochetkova M, Kumar S, McColl SR. Chemokine receptors CXCR4 and CCR7 promote metastasis by preventing anoikis in cancer cells. Cell Death Differ. 2009;16(5): [13] Shields JD, Kourtis IC, Tomei AA, et al. Induction of lymphoidlike stroma and immune escape by tumors that express the chemokine CCL21. Science. 2010;328(5979): [14] Li J, Sun R, Tao K, et al. The CCL21/CCR7 pathway plays a key role in human colon cancer metastasis through regulation of matrix metalloproteinase-9. Dig Liver Dis. 2011;43(1): [15] Hedrick JA, Zlotnik A. Identification and characterization of a novel beta chemokine containing six conserved cysteines. J Immunol. 1997;159(4): [16] Wu WL, Ho LJ, Chen PC, et al. Immunosuppressive effects and mechanisms of leflunomide in dengue virus infection of human dendritic cells. J Clin Immunol. 2011;31(6): [17] Legler DF, Krause P, Scandella E, et al. Prostaglandin E2 is generally required for human dendritic cell migration and exerts its effect via EP2 and EP4 receptors. J Immunol. 2006; 176(2): [18] Loeffler M, Le'Negrate G, Krajewska M, et al. Salmonella typhimurium engineered to produce CCL21 inhibit tumor growth. Cancer Immunol Immunother. 2009;58(5): [19] Yousefieh N, Hahto SM, Stephens AL, et al. Regulated expression of CCL21 in the prostate tumor microenvironment inhibits tumor growth and metastasis in an orthotopic model of prostate cancer. Cancer Microenviron. 2009;2(1): [20] Issa A, Le TX, Shoushtari AN, et al. Vascular endothelial growth factor-c and C-C chemokine receptor 7 in tumor cell-lymphatic cross-talk promote invasive phenotype. Cancer Res. 2009;69(1): 来自本文课题的更多信息 -- 基金声明 : 国家自然科学基金资助项目 ( ; ) 作者贡献 : 第一五作者进行实验设计, 实验实施为第一作者, 实验评估为通讯作者, 资料收集为第一二三四作者, 第一作者成文, 第五作者和通讯作者审校, 第一作者对文章负责伦理要求 : 实验中对动物的处置符合科技部 2006 年颁布的关于善待实验动物的指导性意见标准作者声明 : 文章为原创作品, 数据准确, 内容不涉及泄密, 无一稿两投, 无抄袭, 无内容剽窃, 无作者署名争议, 无与他人课题以及专利技术的争执, 内容真实, 文责自负 ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 7495

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