试剂盒组成 : 名 称 EHC 规格 EHC 规格 保存条件 抗体预包被酶标板 冻干标准品 2 支 1 ng/ 支 3 支 1 ng/ 支 4 标准品 & 标本通用稀释液 ( 橙盖瓶 ) 1 瓶 12 ml 1 瓶 20 ml 4 浓缩生物素化抗体 1

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1 人 MCP-2/CCL8 ELISA 试剂盒 Human MCP-2/CCL8 ELISA kit Cat#:EHC156 尊敬的客户, 感谢您选用本公司 QuantiCyto ELISA 系列产品 本产品选用世界著名生产厂家的原料, 采用专业体外诊断试剂生产技术制造 适用于体外定量检测人血清 血浆或细胞培养上清液中天然和重组人 MCP-2/CCL8 浓度 仅供科研使用, 其他特殊体液标本请咨询 使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分 如有疑问, 请联系欣博盛生物科技有限公司

2 试剂盒组成 : 名 称 EHC 规格 EHC 规格 保存条件 抗体预包被酶标板 冻干标准品 2 支 1 ng/ 支 3 支 1 ng/ 支 4 标准品 & 标本通用稀释液 ( 橙盖瓶 ) 1 瓶 12 ml 1 瓶 20 ml 4 浓缩生物素化抗体 1 支 ( 规格见标签 ) 1 支 ( 规格见标签 ) 4 生物素化抗体稀释液 ( 蓝盖瓶 ) 1 瓶 10 ml 1 瓶 16 ml 4 浓缩酶结合物 1 支 ( 规格见标签 ) 1 支 ( 规格见标签 ) 4 ( 避光 ) 酶结合物稀释液 1 瓶 10 ml 1 瓶 16 ml 4 ( 绿盖瓶 ) 浓缩洗涤液 20 1 瓶 25 ml 1 瓶 50 ml 4 ( 白盖瓶 ) 显色底物 (TMB) ( 棕盖瓶 ) 1 瓶 6 ml 1 瓶 12 ml 4 ( 避光 ) 反应终止液 1 瓶 6 ml 1 瓶 12 ml 4 ( 红盖瓶 ) 封板胶纸 3 张 6 张 产品说明书 1 份 1 份 备注 : 所有试剂的批号见标签 EHC156 Human MCP-2/CCL8 2

3 检测原理 : 欣博盛 QuantiCyto ELISA 试剂盒采用双抗体夹心法 : 抗人 MCP-2/CCL8 单抗包被于酶标板上, 标本和标准品中的人 MCP-2/CCL8 会与单抗结合, 游离的成分被洗去 加入生物素化的抗人 MCP-2/CCL8 抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素, 生物素与亲和素特异性结合 ; 抗人 MCP-2/CCL8 抗体与结合在单抗上的人 MCP-2/CCL8 结合而形成免疫复合物, 游离的成分被洗去 加入显色底物, 若反应孔中有人 MCP-2/CCL8, 辣根过氧化物酶会使无色的显色剂现蓝色, 加终止液变黄 在 450 nm 处测 OD 值, 人 MCP-2/CCL8 浓度与 OD450 值之间呈正比, 可通过绘制标准曲线求出标本中人 MCP-2/CCL8 的浓度 试验所需自备试验器材 ( 不提供, 但可协助购买 ) : 1. 酶标仪 (450 nm 波长滤光片 ) 2. 进口品牌高精度加液器及一次性吸头 : ul, 2-20 ul, ul, ul 恒温箱, 双蒸水或去离子水, 坐标纸等 可协助代购相关产品, 请咨询 3 EHC156 Human MCP-2/CCL8

4 QuantiCyto 双抗体夹心法 ELISA 原理图 : 加标本 加生物素化检测抗体 加酶结合物 加底物显色 EHC156 Human MCP-2/CCL8 4

5 标本收集 : 1. 收集血液的试管应为一次性的无热原, 无内毒素试管 2. 血浆抗凝剂推荐使用 EDTA 避免使用溶血, 高血脂标本 3. 标本应清澈透明, 悬浮物应离心去除 4. 标本收集后若不及时检测, 请按一次使用量分装, 冻存于 -20, -70 电冰箱内, 避免反复冻融,3-6 月内检测 5. 如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值, 请根据实际情况, 做适当倍数稀释 ( 建议做预实验, 以确定稀释倍数 ) 注意事项 : 1. 试剂盒使用前请保存在 2-8 复溶后的标准品若未用完, 请废弃 2. 浓缩生物素化抗体, 浓缩酶结合物体积小, 运输中颠簸和可能的倒置, 会使液体沾到管壁或瓶盖 因此使用前请用手甩几下或 1000 转 / 分离心 1 分钟, 以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底 取用前, 请用移液器小心吹打 4-5 次使溶液混匀 3. 从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶, 属于正常现象, 微加热至 40 使结晶完全溶解后再配制洗涤液 ( 加热温度不要超过 50 ) 使用时洗涤液应为室温 4. 不同批号的试剂盒组份不能混用 ( 洗涤液和反应终止液除外 ) 请提前咨询欣博盛生物科技有限公司 5. 充分轻微混匀对反应结果尤为重要, 最好使用微量振荡器 ( 使用最低频率 ), 如无微量振荡器, 可在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀 6. 在试验中标准品和样本检测时建议作双孔检测 7. 试验中所用的试管和吸头均为一次性使用, 严禁在不同的液体之间混用! 否则将影响试验结果 8. 试验中请穿着试验服并带乳胶手套做好防护工作 特别是检测血液或者其他体液标本时, 请按国家生物试验室安全防护条列执行 9. 如果分次使用, 请根据需要量配制各组分, 以免配制过多造成浪费而影响后续试验 剩余板孔请用封板胶纸封住, 放回铝箔袋中,2 个月内用完 5 EHC156 Human MCP-2/CCL8

6 检测前准备工作 : 1. 请提前 20 分钟从冰箱中取出试剂盒, 以平衡至室温 2. 用双蒸水将 20 浓缩洗涤液稀释成 1 工作液 未用完的放回 4 3. 标准品 : 加入标准品 & 标本通用稀释液 1.0 ml 至冻干标准品中, 静置 15 分钟, 待其充分溶解后, 轻轻混匀 ( 浓度为 1000 pg/ml) 然后根据需要进行稀释 ( 建议标准曲线使用以下浓度 : pg/ml) 复溶标准品原液(1000 pg/ml) 若未用完的请废弃 4. 生物素化抗体工作液 : 按当次试验所需要得用量, 使用前 20 分钟, 用生物素化抗体稀释液将 30 浓缩生物素化抗体稀释成 1 工作液 当日使用 若实验次数过多导致生物素化抗体量不足, 可向欣博盛公司单独购买生物素化抗体 ( 须提供抗体批号 ) 5. 酶结合物工作液 : 按当次试验所需要的用量, 使用前 20 分钟, 用酶结合物稀释液将 30 浓缩酶结合物稀释成 1 工作液 当日使用 若实验次数过多导致浓缩酶结合物量不足, 可向欣博盛公司单独购买浓缩酶结合物 ( 须提供酶结合物批号 ) 标准品稀释方法图例 : 以 500 ul/ 管为例, 用标准品 & 标本通用稀释液将复溶后的标准品母液进行倍比稀释, 具体稀释方法如下图, 也可根据实际用量来稀释, 如 200 ul/ 管 500 ul Standard 500 ul 500 ul 500 ul 500 ul 500 ul 250 pg/ml 125 pg/ml 62.5 pg/ml pg/ml pg/ml 7.8 pg/ml 3.9 pg/ml EHC156 Human MCP-2/CCL8 6

7 洗涤方法 : 1. 自动洗板机 : 要求注入的洗涤液为 350 ul, 注入与吸出间隔 秒 洗板 5 次 2. 手工洗板 : 甩尽孔内液体, 在洁净的吸水纸上拍干, 每孔加洗涤液 350 ul, 静置 30 秒后甩尽液体, 在厚迭吸水纸上拍干 洗板 5 次 操作步骤 : 1. 从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条, 未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压实自封条, 密封口袋, 放回 4 2. 空白孔加标准品 & 标本通用稀释液, 其余相应孔中加标本或不同浓度标准品 (100 ul/ 孔 ), 用封板胶纸封住反应孔,37 孵箱孵育 90 分钟 3. 提前 20 分钟准备生物素化抗体工作液 4. 洗板 5 次 5. 空白孔加生物素化抗体稀释液, 其余孔加入生物素化抗体工作液 (100 ul/ 孔 ) 用新封板胶纸封住反应孔,37 孵箱孵育 60 分钟 6. 提前 20 分钟准备酶结合物工作液 避光室温 (22-25 ) 放置 7. 洗板 5 次 8. 空白孔加酶结合物稀释液, 其余孔加入酶结合物工作液 (100 ul/ 孔 ) 用新封板胶纸封住反应孔,37 孵箱, 避光孵育 30 分钟 9. 打开酶标仪电源, 预热仪器, 设置好检测程序 10. 洗板 5 次 11. 加入显色底物 (TMB)100 ul/ 孔, 避光 37 孵箱, 避光孵育 15 分钟 12. 加入终止液 100 ul/ 孔, 混匀后即刻测量 OD450 值 (3 分钟内 ) 在仪器保存读数结果并打印一份纸质结果 13. 实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回电冰箱保存至有效期结束 建议保存酶标板框, 以备下次或者今后试验使用 7 EHC156 Human MCP-2/CCL8

8 结果判断 : 1. 每个标准品和标本的 OD 值应减去空白孔的 OD 值 2. 以标准品浓度作横坐标,OD 值作纵坐标, 手工绘制或用软件绘制标准曲线 通过标本的 OD 值可在标准曲线上查出其浓度 3. 若标本 OD 值高于标准曲线上限, 应适当稀释后重测, 计算浓度时应乘以稀释倍数 Human MCP-2/CCL8 注意 : 本图仅供参考, 应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本中 人 MCP-2/CCL8 的含量 灵敏度 特异性和重复性 : 灵敏度 : 最小可测人 MCP-2/CCL8 达 2 pg/ml 特异性 : 不与重组人 MCP-1 和 MCP-3 反应 重复性 : 板内, 板间变异系数均 <10% EHC156 Human MCP-2/CCL8 8

9 人 MCP-2/CCL8 简介 : CCL8(Chemokine (C-C motif) ligand 8) 也被称为单核细胞趋化蛋白 2 (MCP-2), 是由 CCL8 基因编码 CCL8 属于 CC 趋化因子家族, 人 CCL8 前体蛋白由 109 个氨基酸组成, 切割掉信号肽后形成 75 个氨基酸的成熟 CCL8 CCL8 在小肠和外周血细胞中表达水平最高, 心脏 胎盘 肺 骨骼肌 胸腺 结肠 卵巢 脊髓和胰腺中等表达水平, 脑 肝脏 脾脏和前列腺表达水平最低 CCL8 的趋化因子受体包括 CCR1, CCR2B 和 CCR5, 分布于多种细胞表面 其中 CCR5 为 HIV-1 的协同受体, CCL8 与 CCR5 有高亲和力可作为 HIV-1 的抑制剂 CCL8 可趋化和活化多种免疫细胞, 包括参与过敏反应的肥大细胞 嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞与参与炎症应答的单核细胞 T 细胞和 NK 细胞 Rev Y 9 EHC156 Human MCP-2/CCL8

10 QuantiCyto ELISA 常见问题分析 : 问题一 : 高背景或阴性对照值偏高可能原因建议阴性对照孔被阳性对照或洗涤时, 勿将洗液溢出孔外 样品污染洗涤不充分确保在洗涤时每个孔都充满了液体, 确保将残余液体从孔中移除 酶结合物过浓孵育温度过高底物在使用前曝光读板前停留时间过长 请检查酶结合物是否按说明书规定稀释检查孵育箱的温度是否正确 稳定应保存在暗处, 避光 加终止液后 3 分钟内读数 问题二 : 阳性对照值偏低或低吸光度 可能原因 建议 试剂未平衡至室温 开始实验前, 将试剂盒平衡至室温 包袋中有湿气 首次开袋标上日期, 封好未使用的孔条, 放入干燥剂 样本中有抑制剂 叠氮化钠抑制 HRP 的活性 试剂在使用前未混匀 使用前混匀试剂 洗涤步骤过于剧烈 降低洗涤系统的压力 实验开始后, 微孔变干燥 实验过程勿中断, 应连续完成所有的实验 步骤 检测体积偏小 确保移液器已校正 问题三 : 边缘效应可能原因蒸发温度不均匀 建议 各步之间, 须使用封版胶密封反应板 校准孵育箱, 勿叠放反应板 EHC156 Human MCP-2/CCL8 10

11 问题四 : 标准曲线不佳可能原因倍比稀释标准品时未混匀过早稀释加入的体积不正确 建议稀释标准品的每一步均需混匀标准品在快要使用时稀释使用校准过的移液器, 快速 等量的将标准品分配到各个微孔中 问题五 : 标准曲线良好, 但样本无检测信号可能原因建议样本中无检测物或检测物设置内参, 重新实验含量极低样本中其他物质影响 / 掩作适当稀释, 降低其他物质的干扰, 或作盖检测系列稀释, 检测回收率 样本中检测物浓度过高, 适当倍数稀释样本, 检测物浓度尽量在试 Hook 效应导致假低值剂盒检测范围内 问题六 : 重复性较差可能原因微孔中有气泡试剂未混匀样本中有杂质或沉淀物微孔包被面被吸头划破使用用过的封板胶纸 建议用针尖挑破气泡确保充分混匀试剂使用前离心加液时小心操作每次须使用新的封板胶封住反应孔 11 EHC156 Human MCP-2/CCL8

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