2010,30(7) 李荷等 : 热稳定 α 半乳糖苷酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究相关试剂和材料 RNaseA ProteaseK Taq 酶 DNAMarker 及各种酶购自 TaKaRa 公司,PCR 纯化试剂盒购自 Omega 公司,QIAquickGelEx

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救弘
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2010,30(7):18?23 热稳定 α 半乳糖苷酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究李 1,2 荷游 1 娟 1 顾取良杨 1 红 (1 广东药学院基础学院生物化学与分子生物学系广州中山大学生命科学学院广州 ) 摘要克隆前期筛得分枝犁头霉 AbsidiaramosaWL511 的热稳定 α 半乳糖苷酶 cdna 基因 aga (GenBankNo.DQ234280), 将 aga 基因插入表达载体 ppiczαa 并电转化整合到毕赤酵母 P. pastorisgs115 的染色体上 30 甲醇流加量 0.5%(V/V) 时, 酵母发酵上清液中酶活达 32U/ ml 纯化后酶的比活力为 137U/mg,SDS PAGE 显示单一条带, 凝胶过滤和 SDS PAGE 估算其分子量分别为 348kDa 和 87kDa, 该酶为四聚体结构, 糖基化导致重组蛋白的分子量比原酶大 6 kda 该酶等电点为 5.2, 最适反应温度 73, 最适 ph6.8,60 以下及 ph5.5~9.0 范围内活性稳定 75 时保温 2 小时保留 54% 的酶活,85 时酶活完全消失以对硝基苯酚 α D 半乳糖苷为底物, 该酶 K m 值为 0.42mmol/Lol/L;V max 为 413U/mg;k cat 为 64531/min 关键词热稳定 α 半乳糖苷酶基因毕赤酵母分泌表达中图分类号 Q786 α 半乳糖苷酶 (α galactosidase,ec ), 也称蜜二糖酶, 是催化 α 半乳糖苷键水解的酶类, 催化移除不同底物中 α 连接的末端非还原性 D 半乳糖, 不仅作用于蜜二糖棉子糖水苏糖和毛蕊花糖等低聚糖, 还能水解 α 半乳糖苷键的杂多糖以及人工合成的对硝基苯 α D 半乳吡喃糖苷结构的低聚糖或多聚糖类 α 半乳糖苷存在于豆科植物中, 主要包括棉子糖水苏糖和毛蕊花糖这些寡糖不能被单胃动物消化道内的内源酶降解, 只有经过肠道内产气微生物发酵后才能被利用, 易引起胀气等疾病, 影响动物对营养物质的消化与吸收添加 α 半乳糖苷酶是去除豆粕中 α 半乳糖苷寡糖类抗营养因子的首选 [1], 此外,α 半乳糖苷酶还广泛应用于制糖食品和医疗卫生行业 [2 4] α 半乳糖苷酶在微生物植物动物和人体内广泛存在, 获得的这些性质各异的半乳糖苷酶, 不仅具有在不同领域的实际应用价值, 也为研究其结构和功能提收稿日期 : 修回日期 : 国家自然科学基金 ( ) 广东省科技攻关项目 (2009B ) 广东省自然科学基金博士启动基金 ( ) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :yanghong@gdpu.edu.cn 供了良好的材料目前, 微生物来源的 α 半乳糖苷酶研究得比较深入, 特别是丝状真菌 α 半乳糖苷酶, 因其具有合适的 ph 值良好的稳定性胞外分泌和高表达量的特点而成为研究热点其中黑曲霉木酶青霉白腐真菌等来源的 α 半乳糖苷酶已被分离纯化和鉴定分析 [5 8] 前期工作中, 已从发酵的豆粕中筛选到一株产热稳定 α 半乳糖苷酶的分枝犁头霉菌株, 并构建 cdna 文库成功筛选到 α 半乳糖苷酶基因 aga(genbank 登录号 DQ234280) [9], 在此基础上, 成功构建了 aga 基因的毕赤酵母分泌表达系统, 并对重组酶进行了详细的酶学性质研究 1 材料与方法 1.1 材料菌种和质粒分枝犁头霉 A.ramosaWL511 由本实验室筛选保存 ; 大肠杆菌 E.coliDH5α, 毕赤酵母 P.pastorisGS115 由本实验室保存, 毕赤酵母表达载体 ppiczαa 购自 Invitrogen 公司携带 aga 基因的克隆载体 pgem aga 由本实验室构建保存

2 2010,30(7) 李荷等 : 热稳定 α 半乳糖苷酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究相关试剂和材料 RNaseA ProteaseK Taq 酶 DNAMarker 及各种酶购自 TaKaRa 公司,PCR 纯化试剂盒购自 Omega 公司,QIAquickGelExtractionKit 购自 Qiagen 公司蛋白质 Marker YNB DTT Zeocin Amp DAB 质粒提取试剂盒购自北京普博生物公司其他试剂为国产分析纯培养基 LB 培养基 ( 每升含有 5gYeast extract,10gtryptone,5gnacl,ph7.0);ypd 培养基 ( 每升含有 10gYeastextract,20gTryptone,20g 葡萄糖 ); YPDS( 每升含有 10gYeastextract,20gTryptone,20g 葡萄糖,182.2g 山梨醇,20g 琼脂,Zeocin 在培养基冷至 50 左右时加入 );MMOL/L 培养基 ( 每升含有 13.4g YNB, g 生物素,0.5% 甲醇,18g 琼脂 );MD 培养基 ( 每升含有 13.4gYNB, g 生物素,20g 葡萄糖,18g 琼脂 ) 1.2 α 半乳糖苷酶基因 aga 的重组表达重组表达载体的构建根据 aga 基因序列, 以及载体 ppiczαa 多克隆位点的序列组成, 设计一对特异性引物 : 上游引物 (A)5 GCTGAATTCGTGACAAAG AAGTCTACATACGTG 3 ( 引入 EcoRI 酶切位点 ); 下游引物 (B):5 CCCTCTAGAATCGTATGACTCTTCCAAAT AAACAAC 3 ( 引入 XbaI 酶切位点 ) 以保存 α 半乳糖苷酶 cdna 的克隆载体 pgem aga 为模板, 进行 aga 基因的 PCR 扩增 EcoRI 和 XbaI 双酶切处理 aga 基因的 PCR 产物及质粒 ppiczαa,16 连接 8h, 并转入大肠杆菌 DH5α 中采用菌落 PCR 结合质粒的酶切鉴定筛选阳性克隆, 并测序确认毕赤酵母的电击转化及筛选 SacI 酶切重组载体 ppiczαa aga 使之线性化, 混合 GS115 酵母感受态细胞与线性化重组质粒, 电击转化 (1500V;25μF; 400Ω;8.9ms), 细胞分别涂布于 YPDS 平板和含 100 μg/mlzeocintm YPDS 抗性平板,30 培养筛选挑取平板上单菌落, 作为模板, 对转化子进行 PCR 鉴定挑取较大菌落, 分别细接种针点种于含 1000μg/ ml 和 500μg/mlZeocin 的 YPDS 平板 30 培养, 观察菌落生长, 筛选高拷贝转化子挑取高拷贝重组菌, 接种于选择培养基 MMOL/L 平板与 MD 平板,30 培养挑取生长良好的转化子, 接种于含 Zeocin 的 YPDs 培养基中,30,200r/min 培养至 OD 值 1.2~1.4, 加入 0.5% 甲醇诱导, 每 24h 加入一次, 共诱导 96h, 发酵上清液用于酶活分析和 SDS PAGE 检测, 选择酶活力最高的转化子摇瓶培养, 镍离子亲合层析纯化发酵上清中的重组蛋白 1.3 α 半乳糖苷酶酶学性质研究酶活力测定 50,pH7.0 时,1min 催化特定底物 pnpg 释放 1μmol/L 对硝基苯酚所需要的酶量为一个酶活力单位 (U) 蛋白含量和表观分子量测定配置牛血清白蛋白标准溶液,Bradford 法测定蛋白质含量 SDS PAGE 方法测定分子量 : 根据标准蛋白在电泳中的相对迁移率 R f 作图, 求得酶亚基的分子量 SephadexG 100 凝胶过滤法测定分子量 : 根据标准曲线求待测蛋白的分子量等电点测定根据蛋白质与离子交换树脂选择性结合的原理测定等电点最适 ph 和 ph 稳定性的测定分别以磷酸二氢钾柠檬酸缓冲液,Na 2 HPO 4 NaH 2 PO 4 缓冲液,Tris HCl 缓冲液和甘氨酸 NaOH 缓冲液, 配置 ph 2.5~ 10.0 的不同 ph 的缓冲系统 (50mmol/L,pH 间隔 0.5) 将酶用不同 ph 的缓冲液稀释, 按标准方法测定不同 ph 下酶活力 ( 以酶活最高者为 100%), 以酶相对活力对 ph 作图将酶用不同 ph 的缓冲液稀释,30 保温 1h, 加入 PBS 缓冲液, 测定各自的酶活力以最适 ph 下测得的酶活力为 100%, 以相对活力对 ph 值作图, 绘制 ph 稳定性曲线最适反应温度和热稳定性的测定底物用 Tris HCl 缓冲液 (ph7.0,0.2mol/l) 溶解, 置于 20 ~ 85 水浴 ( 每个处理间隔 5 ) 中 30min, 加入酶液, 测定各个温度下的酶活力, 以酶活最高者为 100%, 以相对活力对温度作图酶液分别置于 20 ~85 水浴 ( 每个处理间隔 5 )2h, 立即置于冰中, 测定残余酶活力, 以未水浴处理的酶活为 100%, 以相对活力对保温时间作图底物特异性和动力学常数的测定以酶活定义描述的测定条件, 测定重组表达的酶对不同底物 ( 蜜二糖棉子糖水苏糖 ) 的水解能力水解产生的还原糖以 Nelson 方法测定, 蜜二糖水解产生的葡萄糖用葡萄糖氧化酶过氧化物酶系统方法测定 [10] 不同的底物浓度下, 水解反应的初速度在标准酶活测定条件下得到测定反应体系中, 最终底物浓度为 0.1~ 0.75mmol/L 根据底物浓度和测得的反应初速度 v ( 计算公式与酶活力相同 ), 以 1/[S] 对 1/V 作图, 求

7 各种化学物质对酶活力的影响将 HgCl 2 FeCl 3 MnCl 2 ZnCl 2 MgCl 2 EDTA 邻二氮杂菲对氯高汞苯甲酸 (PCMB) 吲哚 3 乙酸 (IAA) N 乙基马来酰亚胺 (NEM) 巯基乙醇二硫赤糖醇 (DTT) 二硫赤藓糖醇 (DTT) 谷胱甘肽 (GSH) 等金属离子和有机试剂用蒸馏水配制成溶液, 与一定量酶液混合,30 保温 30min, 测定酶活力

2kb, 图 1) 及载体 ppiczαa 分别经 EcoRI/XbaI 双酶切处理后相连, 构建分泌型表达载体 ppiczαa aga( 图 2) 图 3 重组质粒 ppiczαa aga 的 PCR 及酶切鉴定 Fig.

3 20 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.30No 得 K m,v max,k cat,k cat /K m 以催化 pnpg 的酶活力为 100%, 计算酶对其它底物的相对活力各种化学物质对酶活力的影响将 HgCl 2 FeCl 3 MnCl 2 ZnCl 2 MgCl 2 EDTA 邻二氮杂菲对氯高汞苯甲酸 (PCMB) 吲哚 3 乙酸 (IAA) N 乙基马来酰亚胺 (NEM) 巯基乙醇二硫赤糖醇 (DTT) 二硫赤藓糖醇 (DTT) 谷胱甘肽 (GSH) 等金属离子和有机试剂用蒸馏水配制成溶液, 与一定量酶液混合,30 保温 30min, 测定酶活力以不处理的反应液的酶活力为 100%, 计算化学物质处理后酶相对活力 2 结果与分析 2.1 分泌型重组表达载体 ppiczαa aga 的构建和鉴定 aga 扩增产物 ( 长度为 2.2kb, 图 1) 及载体 ppiczαa 分别经 EcoRI/XbaI 双酶切处理后相连, 构建分泌型表达载体 ppiczαa aga( 图 2) 图 3 重组质粒 ppiczαa aga 的 PCR 及酶切鉴定 Fig.3 Identificationoftherecombinant vectorppiczαa aga (a)pcranalysis;m:dl2000dnamarker;2~6:thefragmentsof amplification(b)restrictionanalysis;m:dna15000marker; 1:pPICZαA aga+ecori;2:ppiczαa aga+ecori/xbai; 3:pPICZαA+EcoRI 2.2 重组载体 ppiczαa aga 在毕赤酵母的转化和筛选 ppiczαa aga 载体经 SacI 酶切线性化处理 ( 图 4), 并转入酵母细胞, 提取酵母基因组 DNA,PCR 鉴定, 重组质粒已整合到酵母染色体 ( 图 5) 图 1 分枝犁头霉基因全长扩增 Fig.1 PCRamplificationofagagene M:DL2000DNAMarker;1:Amplificationproduct 图 4 重组质粒 ppiczaa aga 载体线性化 (SacI) Fig.4 IdentificationofpPICZaA agavector M:DNA15000Marker;1:pPICZaA aga;2:ppiczaa 图 2 重组表达质粒 ppiczαa aga 的物理图谱 Fig.2 Physicalmapofrecombinant expresionplasmidppiczαa aga 连接产物转化宿主菌株 DH5α, 经菌落 PCR 酶切鉴定 ( 图 3), 及测序鉴定, 证明 ppiczαa 和 α 半乳糖苷酶基因 aga 成功相连经过抗生素梯度筛选, 甲醇利用鉴定和 PCR 鉴定所确认的毕赤酵母阳性转化子中,8 # 转化子经诱导后酶活明显高于其他转化子因此, 以 8 # 转化子进行后续的研究 2.3 重组蛋白的甲醇诱导表达和分离纯化甲醇诱导培养 8 # 转化子 96h, 发酵上清液的酶活为 32U/ml,SDS PAGE 分析表明该蛋白能被酵母分泌表达 ( 图 6a) 镍离子亲合层析纯化目标蛋白,SDS PAGE 显示仅为一条带 ( 图 6b), 说明纯化的酶已达到电泳纯, 比活力为 137U/mg, 分子量约为 87kDa

3 最适 ph 和 ph 稳定性该酶最适 ph 是 6.8 ( 图 8) ph5.5~9.0 范围内,30 温育 1h 后, 酶仍保持活力 80% 以上, 说明酶在比较宽广的 ph 范围内活性稳定图 6 aga 基因表达产物的 SDS PAGE 分析 Fig.

4 2010,30(7) 李荷等 : 热稳定 α 半乳糖苷酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究 21 图 5 重组酵母 GS115 基因组 DNA 的 PCR 鉴定 Fig.5 IdentificationofRecombinantyeastDNA M:DL2000DNAMarker;1~7:Amplificationproduction 图 7 温度对重组酶活性 ( ) 和稳定性 ( ) 的影响 Fig.7 Efectoftemperatureonactivity( )and stability( )ofrecombinantα galactosidase 最适 ph 和 ph 稳定性该酶最适 ph 是 6.8 ( 图 8) ph5.5~9.0 范围内,30 温育 1h 后, 酶仍保持活力 80% 以上, 说明酶在比较宽广的 ph 范围内活性稳定图 6 aga 基因表达产物的 SDS PAGE 分析 Fig.6 SDS PAGEAnalysisofagagene expresionproduct (a)thesupernatantofrecombinantcelculture;m:proteinmarker; 1:ThesupernatantofUninducedcels;2:Thesupernatantofinduced celswithmethanol(b)thepurifiedagaexpresionproduct; M:ProteinMarker;1:Purifiedrecombinantprotein 2.4 重组蛋白的酶学性质分析分子量和等电点 SDS PAGE 法求得酶亚基分子量为 87kDa; 采用凝胶过滤法, 绘制标准蛋白 logmw V e /V 0 图 ( 图略 ), 由样品 V e /V 0 值查得酶的分子量为 348kDa 表明该酶为四聚体酶蛋白根据离子交换层析原理, 用简单易行的方法测得酶等电点为 5.2, 与预测结果相符最适反应温度和热稳定性重组酶的最适反应温度是 73 ( 图 7) 60 以下保温 2h, 酶活仍可保持 95%,75 保温 2h 则降为 42%,85 时酶活完全丧失底物 Substrate 表 1 α 半乳糖苷酶的相对底物特异性和动力学参数图 8 ph 对重组酶活性 ( ) 和稳定性 ( ) 的影响 Fig.8 EfectofpH onactivity( )andstability ( )ofα Galactosidase 动力学常数绘制重组酶水解不同底物的动 1 力学曲线 υ =K m 1 v max [S] + 1, 底物特异性和动力学常 V max 数见表 1(K cat = V max [E],[E] 为反应的酶蛋白浓度 ) 水解相对速率为 pnpg> 蜜二糖 > 棉子糖 > 水苏糖而 K m 越小表示酶与底物的亲和力越大各底物的 K m 值表明 : 合成底物 pnpg 是该酶的最适底物, 自然底物中, 蜜二糖与酶的亲和力最大 Table1 Relativesubstratespecificityandkineticconstantsofpurifiedα Galactosidase 最大反应速度 V max (U/mg) 相对反应速度 Relativevelocity(%) 米氏常数 K m (mmol/l) 转换率 k cat (/min) 催化效率 k cat /K m (mmol/l/min) pnpg 蜜二糖棉子糖水苏糖

5 22 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.30No 各种化学物质对酶活的影响所测化学物质中,Hg 2+ Fe 3+ 对氯高汞苯甲酸 (PCMB) 碘乙酸 (IAA) 和 N 乙基马来酰亚胺 (NEM) 对该酶有强烈的抑制作用 ; 巯基乙醇二硫苏糖醇二硫赤藓糖醇谷胱甘肽有少许促进作用 ;EDTA 邻二氮杂菲和其他一些金属阳离子对酶活影响很小 ( 表 2) 表 2 化学物质对纯化后的酶活力的影响 Table2 Efectsofvariouscompoundson purifiedα Galactosidase 化学试剂浓度相对活力 Compounds Conc.(mmol/Lol/L) Relativeactivity(%) None 100 MgCl CuCl ZnCl MnCl FeCl HgCl EDTA 1 93 o phenanthroline 1 92 PCMB IAA NEM mercaptoethanol Dithiothreitol Dithioerythritol Glutathione 讨论培养筛得的高活性转化菌株,20, 甲醇诱导 96h 后, 发酵上清液中 α 半乳糖苷酶的酶活力为 32U/ml, SDS PAGE 表明源于分枝犁头霉的 aga 基因在毕赤酵母中得到了表达电泳显示重组蛋白的分子量为 87 kda 左右, 明显大于该酶的理论分子量和在大肠杆菌表达的分子量在于对应基因含有 4 个潜在的糖基化位点, 毕赤酵母表达系统有转录翻译后的糖基化修饰的功能, 获得表达产物为糖蛋白, 从而造成表观分子量和理论分子量的差异 SDS PAGE 和凝胶过滤法测定重组 α 半乳糖苷酶的表观分子量分别为 87kDa 和 348kDa, 表明该重组酶是四聚体, 同已报道的 Streptococusmutans,Bacilus stearothermophilus [11 12] 的 α 半乳糖苷酶一样, 均以四聚体的形式存在, 亚基分子量分别为 82kDa 和 82kDa, 与本文中获得重组酶的亚基大小相近而源于真菌曲霉 Aspergilusniger [6,13 14] 的 3 个 α 半乳糖苷酶 ( 分子量 : AglA 82kDa,AglB 48.8kDa,AglC 79.7kDa), 源于木霉 Trichodermaresei [15] 的 3 个 α 半乳糖苷酶 ( 分子量 : AGLI 45.7kDa,AGLI 79.5kDa,AGL I 66.3kDa), 源于 Peniciliumpurpurogenum [16] α 半乳糖苷酶 (46.3kDa), 及源于 Mortierelavinacea [17] 的 α 半乳糖苷酶 (62kDa) 均为单体表明分枝犁头霉具有明显不同于上述这些真菌的 α 半乳糖苷酶的特性重组酶的最适反应温度 73,60 以下保温 2h 后, 酶活基本保持不变, 热稳定性较好最适 ph 值为 6.8, 在 ph 值为 5.5~9.0 范围内仍保持较高的活性, 具有较广泛的 ph 稳定性与 P.Purpurogenum 来源的 α 半乳 [16] 糖苷酶相比较, 该酶具有更高最适温度和更广泛 ph 适应性来源于 M.vinacea 的 α 半乳糖苷酶最适反应温度 60, 最适 ph 值为 3.5 就已报道的真菌而言, 实验筛得的分枝犁头霉, 所产生的 α 半乳糖苷酶具有最佳热稳定性但是, 细菌来源的 α 半乳糖苷酶热稳定性差别很大, 最高能达到 100 以上而源于 Thermussp.strain T2 的嗜热 α 半乳糖苷酶 [18], 最适反应温度为 65, 最 [19] 适 ph 值年 Shankar 等从 Aspergilustereus GR 得到的嗜热 α 半乳糖苷酶最适 ph 值在 5.0, 最适温度为 65, 在 65 保温 40 分钟活性保持 100%,70 保 [20] 温 20 分钟酶活性只有 55% 2007 年 Judit 等从嗜热真菌 ThermomyceslanuginosusCBS395.62/b 获得的 α 半乳糖苷酶最适 ph 值在 5~5.5, 最适温度为 65, 纯化后的酶在 45 保持 90% 的活性,pH 值在 5.0~9.0 属于 36 家族比较这些 α 半乳糖苷酶, 说明不同来源的酶最适 ph 范围和最适温度差别较大 α 半乳糖苷酶的生产尚未产业化, 其中, 性质优良的 α 半乳糖苷酶的发掘是一个亟待解决的关键问题与已报道的各种来源的酶比较, 实验室筛选 WL511 菌株所产生的 α 半乳糖苷酶, 具有 ph 热稳定性范围广活力高等优良性质, 较其他来源的 α 半乳糖苷酶更具有商业竞争力, 具有良好的应用前景参考文献 [1] 郑爱娟, 郑树贵, 杨桂芹. 大豆抗营养因子及其消除方法. 饲料与添加剂,2002,141(1): ZhengA J, ZhengSG, YangG Q. LivestockandPoultry Industry,2002,141(1): [2] 于桂阳.α 半乳糖苷酶在猪日粮中的应用. 畜禽业,2006,8 (15): YuGY.LivestockandPoultryIndustry,2006,8(15): [3] 梁素钰, 郑学勤. 具血型转换功能的咖啡 α 半乳糖苷酶基因的克隆与表达. 遗传,2005,27(5): LiangSY,ZhengXQ.Hereditas,2005,27(5): [4] 崔玉, 杨军, 詹林盛. 咖啡豆 α 半乳糖苷酶基因在大肠杆菌 JM83 中可溶性表达纯化及活性检测. 感染炎症修复, 2007,8(2): CuiY,YangJ,ZhanLS.etal.InfectionInflammationonRepair,

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材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌

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