50 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No 认证的食品安全级酵母菌, 较之蛋白表达系统, 其优点如下 : 碳源利用种类多 ; 繁殖快 ; 可分泌大分子量蛋白 ; 表达产物无需繁琐的纯化过程 ; 发酵过程中采用的诱导表达试剂为半乳糖或乳糖, 无废气产生

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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2017,37(12):49 58 溶葡球菌酶在乳酸克鲁维酵母中重组表达诱变优化及酶学研究王 1 曦 1 张光德 2 陈熙明 1 浦铜良 (1 兰州大学生命科学学院兰州中国科学院西北生态环境资源研究院兰州 ) 摘要根据模仿葡萄球菌 (Staphylococussimulans) 的溶葡球菌酶基因序列以及乳酸克鲁维酵母密码子偏好性设计引物扩增溶葡球菌酶基因表达片段, 构建溶葡球菌酶 (lysostaphin,lys) 基因表达载体 (pklac1 Lys), 转化乳酸克鲁维酵母 (K.lactisGG799), 实现了 Lys 基因的分泌表达对重组菌株 (K.lactisGG799/pKLAC1 Lys) 进行 NTG 随机化学诱变, 优化表达条件, 筛选获得高表达菌株, 并通过 Ni NTA 亲和层析纯化蛋白并研究其酶学性质结果表明 : 通过诱变重组溶葡球菌酶乳酸克鲁维菌株,Lys 酶比活性提高了约 5.2 倍 ( 约 8000U/L) 最适接种量为 40g/L, 诱导过程中每 24h 添加一次终浓度为 20g/L 的半乳糖和 NH 4 NO 3 可提高酶比活性, 最适表达 ph 为 7.0 ~7.5, 最适反应 ph 为 7.0~8.0, 最适反应温度为 37 实验表明, 低于 40,pH3~6 之间时, 重组溶葡球菌酶较稳定 Sr 2+ 对其酶活性有明显的促进作用,Ba 2+ Ca 2+ Zn 2+ Cu 2+ Mn 2+ Mg 2+ 对其有明显的抑制作用关键词乳酸克鲁维酵母溶葡球菌酶重组表达诱变中图分类号 Q819 溶葡球菌酶 (lysostaphin,lys) 最初是由 Schindler [1] 等从一株命名为 NRRLB 2628 的模仿葡萄球菌的培养物中分离获得, 是一种 Zn 2+ 依赖的蛋白酶, 能够特异性地水解葡萄球菌胞壁肽聚糖交联结构 Gly 五肽桥联其相对分子质量约为 27kDa, 由 246 个 AA 组成的单链分子,pI 是 9.5, 最适 ph 是 7.5 金黄色葡萄球菌是一种给人和动物健康带来严重危害的病原菌, 能够使人体全身或局部发生感染, 给临床治疗带来极大困难此外, 金黄色葡萄球菌主要引起奶牛乳房炎与子宫内膜炎, 对乳业发展造成巨大损失近年来, 随着各种抗生素的大量应用, 越来越多的耐药菌出现, 引起了人们的广泛关注其中金黄色葡萄球菌对传统抗生素耐药性日益加重, 以对甲氧西林产生耐药性的金黄色葡萄球菌 (methicilin resistants.aureus,mrsa) 为例, 使得治疗由 MRSA 引起的感染变得极为困难, 迫使寻找治收稿日期 : 修回日期 : 国家自然科学基金 ( ) 甘肃国际合作项目 (1504WKCA097) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :tlpu@lzu.edu.cn 疗 MRSA 的药物成为当务之急有学者研究表明,Lys 能够治疗由 MRSA 引起的感染, 并且没有耐药菌出现 [2], 因此, 溶葡球菌酶的药用潜力备受人们的重视目前, 溶葡球菌酶已实现在大肠杆菌中成功表达在大肠杆菌表达系统中, 溶葡球菌酶大多以包涵体的形式出现, 即宿主菌表达的目的蛋白在胞内相互聚集形成低活性的固体颗粒, 属于细胞内不溶性表达, 致使产物纯化极为困难, 同时, 大肠杆菌表达系统不完善的翻译后加工修饰功能, 比如, 表达的目的蛋白, 部分肽链在折叠过程中出现特异性错误聚合, 致使形成完全解链或者未成熟的蛋白, 使表达产物活性及表达量较 [3 4] 低, 此外, 菌株的稳定性较差不利于溶葡球菌酶的 [5 6] 表达毕赤酵母在发酵过程中溶氧和甲醇需求量高, 甲醇有毒, 需要考虑表达产物的安全性问题, 同时甲醇易燃存在安全隐患, 发酵过程中可能发生爆罐, 此外, 发酵周期相对较长, 容易污染 [7 9], 给溶葡球菌酶大规模生产造成困难乳酸克鲁维酵母 (Kluyveromyceslactis) 是美国 FDA

2 50 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No 认证的食品安全级酵母菌, 较之蛋白表达系统, 其优点如下 : 碳源利用种类多 ; 繁殖快 ; 可分泌大分子量蛋白 ; 表达产物无需繁琐的纯化过程 ; 发酵过程中采用的诱导表达试剂为半乳糖或乳糖, 无废气产生, 不会出现爆罐现象, 因此安全性较高, 可用于异源蛋白高密度发酵进行大规模生产 [10 13] 目前, 国内外关于溶葡球菌酶在乳酸克鲁维酵母表达系统中表达鲜有报道本研究 Lys 基因在乳酸克鲁维酵母表达系统中重组表达, 并对其进行 NTG 诱变 [14 15], 筛选得到一株高效表达菌株, 同时分析了酶学性质, 为早日实现溶葡球菌酶的商业化提供相关理论指导 1 材料与方法 1.1 材料培养基 LB 培养基 (g/l): 胰蛋白胨 10.0, 酵母提取物 5.0, 氯化钠 10.0 YPD 培养基 (g/l): 胰蛋白胨 20.0, 葡萄糖 20.0, 酵母提取物 10.0 YPGal 培养基 (g/l): 半乳糖 20.0, 胰蛋白胨 20.0, 酵母提取物 10.0 YCB 培养基 (g/l): 葡萄糖 10.0, 磷酸二氢钾 1.0, 硫酸镁 0.5, 氯化钠 0.1, 氯化钙 0.1, 精氨酸 1mmol/L, 赖氨酸 1mmol/L, 维生素与微量元素, 灭菌后加入乙酰胺 5mmol/L 以上固体培养基需加琼脂 20.0g 菌株与质粒大肠杆菌 DH5α 和金黄色葡萄球菌 (Staphylococusaureus) 菌株由本实验室保存, 乳酸克鲁维酵母 (K.lactisGG799) 菌株由威尼斯大学生物技术研究所 KestuisSasnauskas 博士惠赠,PUC57, pklac1 载体购自 NewEnglandBiolabs 公司生化试剂和工具酶 PCR 引物合成与基因测序由北京莱兹生物工程有限公司完成 ; 质粒提取试剂盒与胶回收试剂盒等购自上海生工生物工程有限公司 ; 溶葡球菌酶标准品购自 SIGMA 公司 ;Ni NTA 亲和层析柱购自北京韦氏博慧色谱科技有限公司 ;XhoⅠ KpnⅠ SacⅡ 及 T4DNAligase 购自杭州宝赛生物有限公司 ; 试剂均为国产分析纯 1.2 溶葡球菌酶基因克隆根据模仿葡萄球菌 (Staphylococussimulans) 溶葡球菌酶基因序列以及乳酸克鲁维酵母密码子偏好性设计引物, 上下游引物中分别引入 XhoI 和 KpnI 两个酶切位点,PCR 引物 pklac1 F(5 GTCTCGAGAAAAGAGC CGCA 3 ) 和 pklac1 R(5 GCGGTACCTTAGTGGTGA TG 3 ), 以引物 pklac1 F 与 pklac1 R 进行 PCR 扩增溶葡球菌酶基因表达片段 PCR 反应条件 :94 变性 5min;94 30s,57 40s,72 50s, 进行 35 个循环,4 保存 PCR 反应体系如表 1 所示 PCR 扩增片段连接 PUC57 载体后转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞, 筛选阳性单克隆, 将筛选获得的转化子送至北京莱兹生物工程有限公司进行测序 ddh 2 O 表 1 PCR 反应体系 Table1 PCRreactionsystem 10 Bufer ( 含 Mg 2+ ) dntps (2.5mmol/L) P1 P2 Taq 酶整合型表达载体 pklac1 Lys 构建测序验证正确的质粒 PUC57 Lys, 用限制性内切酶 XhoⅠ 与 KpnⅠ 酶切后与使用相同酶切后的载体 pklac1 连接, 转入大肠杆菌 DH5α, 挑取转化子, 提取质粒, 经 XhoⅠ 与 KpnⅠ 进行酶切验证, 获得构建成功的整合型表达载体 pklac1 Lys 1.4 整合型表达载体 pklac1 Lys 转化乳酸克鲁维酵母提取重组质粒 pklac1 Lys, 采用 SacⅡ 酶对其线 [16] 性化, 琼脂糖凝胶浓缩回收, 电击转化乳酸克鲁维酵母 (K.lactisGG799), 置 30 恒温培养箱静置 2h, 涂 YCB 平板,30 恒温培养 4d 后, 挑取阳性单克隆接种于 YPD 液体培养基摇瓶扩增繁殖, 命名为 K.lactis GG799/pKLAC1 Lys 采用同样的电击转化方法将空载体 pklac1 转化 K.lactisGG799 菌株, 作为阴性对照, 命名为 K.lactisGG799/pKLAC1 1.5 Lys 基因在 K.lactisGG799 中分泌表达挑取 20 个阳性克隆, 对其分别进行编号为 :1 至 20#, 分别接种于 5mlYPD 液体培养基过夜培养, 6000r/min 离心 2min, 收集菌体, 等量接种于 YPGal 液体培养基,30,220r/min 恒温震荡培养, 分别于和 120h 取样离心收集保存上清采用比浊法测定 Lys 酶活筛选得到 8# 菌株为高表达菌株, 命名为 K.lactisGG799/pKLAC1 Lys8# 1.6 定量测定 Lys 酶活溶葡球菌酶活性采用比浊法进行测定 [17], 即规定 ph7.5 条件下 37 水浴 10min 将金黄色葡萄球菌菌悬液 6ml 从比浊度 (A 620nm )0.250 降至所需酶的量为 1U 本文根据溶葡球菌酶标准品绘制标准曲线, 计算发酵液相应酶活

3 2017,37(12) 王曦等 : 溶葡球菌酶在乳酸克鲁维酵母中重组表达诱变优化及酶学研究 K.lactisGG799/pKLAC1 Lys8#NTG 诱变取 1.5 至 3ml 的 K.lactisGG799/pKLAC1 Lys8# 菌液,6000r/min 离心 1min, 弃上清, 加 1mlpbs,20μl NTG, 静置 40min, 用 1.5mlpbs 冲洗, 离心, 弃上清, 重复 3 遍, 加入 5mlYPD,30 静置孵育 2h, 用 pbs 稀释至不同浓度, 涂 YCB 平板挑取 100 个转化子命名为 1 至 100#, 菌体收集与转接方法同 1.5 定量测定发酵上清液酶活, 判断诱变菌株的表达能力筛选得到 4# 诱变菌株的表达能力最强, 将其命名为 mu4# 1.8 mu4# 生长曲线测定每 24h 收集摇瓶发酵液, 稀释后于波长 600nm 处测定吸光值,OD 600 =OD 600 读数稀释倍数 1.9 mu4# 表达条件优化不同起始量对酶活的影响将 mu4# 接种于 YPD 液体培养基,30,220r/min 持续震荡过夜, 离心收集菌体, 分别以 5g/L 10g/L 20g/L 40g/L 80g/L 160g/L 的终浓度接种于 5mlYPGal, 分别在和 120h 取上清 400μl,12000r/min 离心 2min, 收集保留上清, 测定酶活不同时间段半乳糖添加对酶活的影响将 mu4# 以 40g/L 的接种量接种于 5mlYPGal 液体培养基, 30,220r/min 震荡培养, 分别于与 96h 补终浓度为 20g/L 的半乳糖进行诱导表达, 分别在和 120h 取上清 400μl,12000r/min 离心 2min, 收集保存上清, 检测酶活不同时间段氮源添加对酶活的影响将 mu4# 以最适接种量和半乳糖添加量接种于 5mlYPGal 液体培养基,30,220r/min 震荡培养, 分别于与 96h 补终浓度与上述半乳糖等量的 NH 4 NO 3, 分别在和 120h 取上清 400μl,12000r/min 离心 2min, 收集保存上清, 检测酶活不同 ph 对酶活的影响将 mu4# 以最适接种量和半乳糖添加量接种于 5mlYPGal 液体培养基, 加入终浓度为 1mol/L 的磷酸盐缓冲液, 磷酸盐缓冲液设置以下几个梯度 : , 220r/min,30 恒温振荡培养, 分别在和 120h 离心收集保存上清, 测酶活 2 表达产物的纯化及鉴定离心收集发酵液上清, 利用 Ni NTA 亲和层析柱对其进行纯化, 收集洗脱液取纯化后蛋白溶液进行 SDS PAGE 电泳 ( 分离胶 12%, 浓缩胶 4%), 加入 5 上样缓冲液,95 煮沸 5min, 上样 10μl 进行电泳, 考马斯亮蓝 R250 法染色 2h, 脱色 3h, 观察分析 2.1 溶葡球菌酶酶学性质反应最适 ph 及 ph 稳定性测定分别用 1mol/LpH 的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液,1mol/LpH 的磷酸二氢钾磷酸氢二钾缓冲液以及 1mol/LpH 的 Tris HCl 缓冲液, 作用于发酵上清液, 于 620nm 处测定吸光值, 计算酶活, 以最高酶活作为 100% 计算其相对酶活将发酵液上清分别置于上述相应的 ph 缓冲液中, 分别作用 1h,2h,3h, 并在 ph7.5 条件下测残余酶活, 以最高酶活作为 100% 计算其相对酶活反应最适温度及热稳定性测定溶葡球菌酶发酵上清液分别置于条件下反应 30min, 测酶活, 以最高酶活作为 100% 计算其相对酶活将酶液分别置于分别水浴 30min 和 1h, 然后 37 反应测定剩余酶活, 并以未保温时的酶活作为 100% 计算其相对酶活二价金属阳离子对酶活的影响分别添加 SrCl 2 BaCl 2 CaCl 2 ZnCl 2 CuCl 2 MnCl 2 MgCl 2 二价金属离子至终浓度为 mmol/L, 测定酶活, 以未添加金属阳离子的发酵液上清酶活 100% 作为对照, 计算其相对酶活 3 结果与分析 3.1 溶葡球菌酶基因扩增片段与分析 Lys 基因 PCR 扩增片段如图 1 所示, 在 770bp 左右出现单一扩增片段, 与目的片段基本相一致 3.2 整合型表达载体 pklac1 Lys 的构建如图 2 所示, 溶葡球菌酶基因与整合型表达载体 pklac1 的构建图谱将测序正确的质粒 PUC57 Lys 经限制性内切酶 XhoⅠ 与 KpnⅠ 双酶切后与采用相同酶切后的载体 pklac1 相连接, 转入大肠杆菌 DH5α, 挑取阳性单克隆, 提质粒, 经双酶切验证, 如图 3 所示, 和预想结果相一致, 说明表达载体 pklac1 Lys 构建成功 3.3 表达载体 pklac1 Lys 转化乳酸克鲁维酵母 pklac1 为乳酸克鲁维酵母 (K.lactis) 整合型表达载体, 转化前需对其线性化, 使其能够与 K.lactis 基因组 (DNA) 产生同源重组 SacⅡ 酶切后载体分为两部分, 如图 4 所示, 胶回收较大片段, 电击转化 K.lactis 后

采取同样的方法将不含目的基因的载体 pklac1 转化 K.lactisGG799, 获得阳性克隆作为对照菌株图 1 PCR 扩增 Lys 基因琼脂糖凝胶电泳 Fig.1 AgarosegelelectrophoresisofLys M:DNAmarker;1:PCRproductofLys 图 4 表达载体 pklac1 Lys 单酶切 Fig.

4 52 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No 涂布 YCB 平板 ( 含 5mmol/L 乙酰胺 ) YCB 平板不含酵母生长所需氮源, 而 pklac1 载体携带 amds 基因, 只有线性化 pklac1 Lys 片段整合到乳酸克鲁维酵母基因组中, 可使含有转化子的菌株分解利用 YCB 平板上的乙酰胺, 从而为其自身生长提供必需的氮源, 阳性克隆才得以在 YCB 平板上生长, 以此对转化子做出筛选采取同样的方法将不含目的基因的载体 pklac1 转化 K.lactisGG799, 获得阳性克隆作为对照菌株图 1 PCR 扩增 Lys 基因琼脂糖凝胶电泳 Fig.1 AgarosegelelectrophoresisofLys M:DNAmarker;1:PCRproductofLys 图 4 表达载体 pklac1 Lys 单酶切 Fig.4 SingleenzymedigestionofpKLAC1 Lys M:DNA marker;1:expresionvectorpklac1 Lysdigestedby SacⅡ 图 2 表达载体 pklac1 Lys 结构 Fig.2 StructureofexpresionvectorpKLAC1 Lys 图 3 表达载体 pklac1 Lys 酶切鉴定 Fig.3 TheenzymeidentificationofpKLAC1 Lys M:DNAmarker;1:ExpresionvectorpKLAC1 Lys;2:Expresion vectorpklac1 LysdigestedbyXhoⅠandKpnⅠ 3.4 Lys 基因在 K.lactisGG799 中分泌表达紫外分光光度法检测 Lys 抑菌活性 :Lys 基因在 K. lactisgg799 中分泌表达, 收集 K. lactisgg799/ pklac1 Lys 菌株不同时间发酵上清液, 检测 Lys 酶活, 如图 5 所示由图 5 可知,K.lactisGG799/pKLAC1 Lys 成功分泌产生了有活性的 Lys, 该酶水解 LB 中的金黄色葡萄球菌, 从而使 A 620 值下降, 而对照菌株 (K. lactisgg799/pklac1) 的发酵液上清未使 A 620 值降低, 说明对照菌株未表达 Lys 该酶从 24h 到 72h, 随着表达的持续, 酶活性呈上升趋势,72h 酶活达到最高 (1538U/L),96h 后酶活逐渐下降总而言之,K.lactis GG799/pKLAC1 Lys 菌株分泌表达的溶葡球菌酶酶活较低, 为了进一步提高 Lys 的酶活, 对 K.lactisGG799/ pklac1 Lys 菌株采用 NTG 随机诱变的方式, 筛选高表达菌株 3.5 K.lactisGG799/pKLAC1 Lys8#NTG 诱变 K.lactisGG799/pKLAC1 Lys8#NTG 诱变后, 检测 Lys 酶活实验结果表明, 诱变菌株 4# 的表达能力最强, 酶活最高为 (3086U/L), 如图 6 所示该酶从 24

7 Thegrowthcurveofmu4# 量过高, 后期酵母生长营养不足, 就会降解自身产生的蛋白, 用于维持自身新陈代谢接种量过低, 会使营养利用不充分, 表达量低, 酶活相应也会下降如图 8 所示, 接种量从 5g/L 提高到 10g/L 时, 从 24h 至 48h 酶活有所提高,48h 以后酶活呈缓慢下降趋势接种量从 20g/L 提高到 160g/L 时, 在 24h

5 2017,37(12) 王曦等 : 溶葡球菌酶在乳酸克鲁维酵母中重组表达诱变优化及酶学研究 53 图 5 K.lactisGG799/pKLAC1 Lys8# 不同诱导时间溶葡球菌酶酶活 Fig.5 TheLysenzymeactivityofK.lactis GG799/pKLAC1 Lys8#during theinductionbythegalactose h 到 48h 酶活呈上升趋势,48h 酶活最高,48h 之后酶活不断下降与诱变前菌株相比诱变后酶活提高了 2 倍左右图 7 mu4# 生长曲线 Fig.7 Thegrowthcurveofmu4# 量过高, 后期酵母生长营养不足, 就会降解自身产生的蛋白, 用于维持自身新陈代谢接种量过低, 会使营养利用不充分, 表达量低, 酶活相应也会下降如图 8 所示, 接种量从 5g/L 提高到 10g/L 时, 从 24h 至 48h 酶活有所提高,48h 以后酶活呈缓慢下降趋势接种量从 20g/L 提高到 160g/L 时, 在 24h 时酶活达到最高, 随着表达时间的增加, 各自的酶活呈不同水平下降趋势其中 40g/L 的起始接种量酶活力最高, 因此, 下面的实验均选择接种量为 40g/L 图 6 mu4# 不同诱导时间溶葡球菌酶的酶活 Fig.6 TheLysenzymeactivityofmu4#during theinductionbythegalactose 3.6 mu4# 生长曲线 mu4# 在摇瓶发酵过程中菌体生长曲线如图 7 所示 24h 时 mu4# 接种于培养基处于适应期, 所以此时的 OD 600 较低, 经过调整期的准备,48h 时菌体生长速度快速增加, 到达 72h 时进入稳定期,96h 时生长速度略微上升,120h 菌体 OD 600 下降进入衰亡期 3.7 mu4# 表达条件优化不同起始量对酶活的影响在一定体积的培养基中, 接种量会直接影响酶的表达量和活性接种图 8 mu4# 不同起始量对酶活的影响 Fig.8 Diferentinitialinoculum dosage ofmu4#onlysactivity 不同时间段半乳糖添加对酶活的影响溶葡球菌酶在诱导表达过程中, 半乳糖作为唯一碳源, 其含量会对溶葡球菌酶的表达量和酶活产生一定影响由图 9 分析可知, 不同时间段添加半乳糖, 从 24h 至 48h 酶活力大幅提高,48h 之后呈不同程度的下降趋势随着半乳糖添加次数的增多, 酶活下降的幅度越小由此可见, 在诱导过程中增加半乳糖的补加量, 前期分

6 54 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No 泌的溶葡球菌酶活性就越高因此, 以下实验均采用每 24h 添加一次终浓度为 20g/L 的半乳糖图 9 mu4# 不同时间半乳糖添加量对酶活的影响 Fig.9 Galactoseadditionofmu4#onLys activityatdiferenttimes a:theadditionofgalactoseatthefinalconcentrationof20g/lin 24h;b:Theadditionofgalactoseatthefinalconcentrationof20g/L in24hand48hrespectively;c:theadditionofgalactoseatthefinal concentrationof20g/lin24h 48hand72hrespectively;d:The additionofgalactoseatthefinalconcentrationof20g/lin24h 48h 72hand96hrespectivel 图 10 mu4# 不同时间氮源添加对酶活的影响 Fig.10 Nitrogensourceadditionofmu4#on Lysactivityatdiferenttimes a:theadditionofnh 4 NO 3 atthefinalconcentrationof20g/lin 24h;b:TheadditionofNH 4 NO 3 atthefinalconcentrationof20g/l in24hand48hrespectively;c:theadditionofnh 4 NO 3 atthefinal concentrationof20g/lin24h 48hand72hrespectively;d:The additionofnh 4 NO 3 atthefinalconcentrationof20g/lin24h, 48h,72hand96hrespectively 不同时间段氮源添加对酶活的影响溶葡球菌酶在诱导表达过程中, 氮源的含量会对溶葡球菌酶的表达量和酶活产生一定影响由图 10 分析可知, 不同时间段添加 NH 4 NO 3, 从 24h 至 48h 酶活力大幅提高,48h 之后呈不同程度的下降趋势随着 NH 4 NO 3 添加量的增多, 酶活下降的幅度越小与图 9 对比分析, 发现在 24h 和 48h 的酶活没有变化, 说明此阶段的氮源是充足的,48h 之后各个时期的酶活相对有所提高, 说明图 9 中 48h 之后酶活的下降, 部分原因是由氮源不足引起的, 同时也受菌体生长的影响不同 ph 对酶活的影响 ph 对酶活性产生一定的影响,pH 过高或者过低都会降低酶与底物的结合程度, 进而影响酶的活性由图 11 可知,pH 从 5.0 提高到 8.0 的过程中, 酶活呈不同程度的升高 ph 为 8.5 时, 酶活力骤降在 ph 为 7.0~7.5 时酶活力较高, 大约为 8000U/L 因此该酶适合在偏中性的 ph 范围内分泌表达 3.8 表达产物的纯化及鉴定为了进一步研究重组溶葡球菌酶表达情况, 对发酵液进行纯化, 对纯化产物进行 SDS PAGE 电泳检测如图 12 所示,27kDa 附近出现相应条带, 与预测的溶图 11 mu4# 不同 ph 对酶活的影响 Fig.11 TheefectofdiferentpHonmu4#Lysactivity 葡球菌酶分子量一致 [18], 说明重组溶葡球菌酶在乳酸克鲁维酵母中实现了分泌表达 3.9 溶葡球菌酶酶学性质反应最适 ph 及 ph 稳定性测定 ph 的变化不但影响酶的活性, 还会影响酶的稳定性由图 13 分析可知, 在 ph3.0~8.0 之间时, 随着 ph 的增大酶的相对活性在不断上升,pH 大于 8.0 时酶的相对活性骤降表明该酶最适反应 ph 在 7.0~8.0 范围内, 因此该酶适合在偏中性的 ph 范围内发挥作用由图 14 可知, 以每个时间段的最高酶活作为

7 2017,37(12) 王曦等 : 溶葡球菌酶在乳酸克鲁维酵母中重组表达诱变优化及酶学研究 55 图 12 mu4# 发酵液 SDS PAGE 分析 Fig.12 SDS PAGEanalysisofmu4# from fermentationbroth 图 14 溶葡球菌酶 ph 稳定性 Fig.14 ph stabilityoflys 100% 计算其相对酶活, 发现 ph 在 3~6 范围内时酶活在 80% 以上,pH 大于 7 时, 相对酶活迅速下降, 低于 40% 以下, 并且随着 ph 的增大, 呈下降趋势说明重组溶葡球菌酶在 ph3~6 范围内, 酶活比较稳定, 即该酶的耐酸性能好图 15 溶葡球菌酶反应最适温度 Fig.15 Theoptimum reactiontemperatureoflys 图 13 溶葡球菌酶反应最适 ph Fig.13 Theoptimum reactionph oflys 反应最适温度及热稳定性测定温度对酶活会产生一定的影响温度过低会使反应活化分子数降低, 酶促反应速率相应减慢温度过高会使酶在短时间内变性失活, 会使酶促反应速率变慢由图 15 分析可知,Lys 最适反应温度为 37, 在 20~30 酶活较低, 随着温度的上升酶活大幅提高, 在 37 时达到最高, 超过 37 酶活力快速下降由图 16 可知, 该酶在条件下分别水浴 30min 与 1h, 当温度高于 40 时, 酶的相对残余活力低于 40% 以下, 酶活力损失严重由此可见, 该重组溶葡球菌酶的热稳定性较差图 16 溶葡球菌酶热稳定性 Fig.16 ThethermostabilityofLys 二价金属阳离子对酶活的影响由图 17 可知, Sr 2+ 对其有明显的促进作用 ;Ba 2+ Ca 2+ Zn 2+ Cu 2+ Mn 2+ 随着金属阳离子浓度的增大对其抑制作用逐渐加强,Mg 2+ 随着金属离子浓度的增大对其抑制作用逐渐

8 56 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No 减弱图 17 不同二价金属阳离子对溶葡球菌酶酶活的影响 Fig.17 TheEfectofdiferentdivalent mentalionsonlysenzymesactivity 4 讨论与结论金黄色葡萄球菌是一种对人与牲畜健康构成严重威胁的病原微生物, 可引起人体全身或局部感染, 给临 [19] 床治疗带来极大困难, 此外, 引起奶牛乳房炎与子宫内膜炎 [20 21], 给乳业发展带来重大的损失近年来, 由于抗生素的大量使用, 多种耐药菌的出现逐渐引起人们的关注, 因此, 寻找一种不产生耐药性的新药物是我们的研究重点有研究表明, 溶葡球菌酶对金黄色葡萄球菌 ( 尤其是 MRSA) 有很好疗效, 并且不产生耐药性, 同时在动物体内无残留, 对机体正常组织无刺激无致突变性, 安全有效因此, 对溶葡球菌酶的研究备受人们的关注, 使其再次成为研究新热点目前, 用于表达溶葡球菌酶的菌株大多存在病原性以及安全性隐患, 因此, 构建具有食品安全级的菌株显得尤为重要研究表明, 溶葡球菌酶在大肠杆菌和毕赤酵母表达系统中已实现成功表达大肠杆菌表达的蛋白, 纯化难度大, 活性低, 菌株稳定性差毕赤酵母是甲醇诱导型表达, 诱导过程中有毒性甲醇的添加会给发酵产物的安全性带来隐患, 同时甲醇易燃, 可能发生爆罐乳酸克鲁维酵母 (Kluyveromyceslactis) 为美国 FDA 认证的食品安全级酵母菌, 因此, 在食品饲料及医药领域, 可利用乳酸克鲁维酵母大规模生产异源蛋白, 实现商业化本实验实现了对来源于模仿葡萄球菌的溶葡球菌酶在乳酸克鲁维酵母中高效表达诱变表达条件优化并通过 Ni NTA 亲和层析纯化蛋白及酶学性质研究成功实现了溶葡球菌酶基因在乳酸克鲁维酵母中表达, 结果表明表达产物活性较低, 为了进一步提高溶葡球菌酶的表达活性, 对其进行 NTG 随机诱变, 结果发现酶活明显提高优化诱变后菌株表达条件, 结果表明最适接种量为 40g/L, 诱导过程中每 24h 添加一次终浓度为 20g/L 的半乳糖, 可防止前期表达蛋白降解, 每 24h 添加一次终浓度为 20g/L 的氮源, 能降低后期酶活下降的速度最适表达 ph 为 7.0~7.5, 酶活约为 8000U/L mu4# 优化表达条件后比原始菌株 K.lactis GG799/pKLAC1 Lys8# 酶活提高了约 5.2 倍 SDS PAGE 电泳分析表明, 重组溶葡球菌酶成功实现了分泌表达酶学性质分析表明 : 最适反应 ph 为 7.0~8.0, 最适反应温度为 37, 低于 40,pH3~6 之间时, 重组溶葡球菌酶较稳定 Sr 2+ 对酶活性有明显的促进作用 ;Ba 2+ Ca 2+ Zn 2+ Cu 2+ Mn 2+ Mg 2+ 对酶活性有明显的抑制作用综上所述, 乳酸克鲁维酵母在表达异源蛋白方面存在其独特优势, 因此将乳酸克鲁维酵母表达系统作为表达外源蛋白的宿主, 对大量生产药用蛋白具有一定的意义, 同时也显示出该系统在医药领域具有更加广阔的应用前景致谢感谢我的导师浦铜良老师和中国科学院西北生态环境资源研究院陈熙明老师的悉心指导和帮助参考文献 [1]SchindlerCA,SchuhardtVT.Lysostaphin:Anewbacteriolytic agentfosthestaphylococus.procnatlacadsciusa,1964,51 (3): [2] SzwedaP,SchielmannM,KotlowskiR,etal.Peptidoglycan hydrolases potentialweaponsagainststaphylococusaureus.appl MicrobiolBiotechnol,2012,96(5): [3]SzwedaP,GorczycaG,FilipkowskiP,etal.Eficientproduction ofstaphylococussimulanslysostaphininbenchtopbioreactorby recombinantescherichia coli. Preparative Biochemistry and Biotechnology,2014,44(4): [4] FarhangniaL,Ghaznavi RadE,MolaeeN,etal.Cloning, expresion, and purification ofrecombinantlysostaphin from Staphylococussimulans.JundishapurJMicrobiol,2014,7(5): e [5]ZhaoH,BlazanovicK,ChoiY,etal.Geneandproteinsequence optimization forhigh levelproduction offuly active and a glycosylated lysostaphin in Pichia pastoris. Applied and

9 2017,37(12) 王曦等 : 溶葡球菌酶在乳酸克鲁维酵母中重组表达诱变优化及酶学研究 57 EnvironmentalMicrobiology,2014,80(9): [6]SchoteP,DewerteI,GroeveM D,etal.PichiapastorisMutS strainsarepronetomisincorporationofo methyl l homoserineat methionineresidueswhenmethanolisusedasthesolecarbon source.microbialcelfactories,2016,15(1):1 9. [7] 杨梅, 温真, 林丽玉, 等. 毕赤酵母蛋白表达系统研究进展. 生物技术通报,2011,4(27): YangM,WenZ,LinLY,etal.Advancesofexpresionsystem ofpichiapastorisprotein.biotechnologybuletin,2011,4(27): [8] 傅小蒙, 孔令聪, 裴志花, 等. 毕赤酵母表达系统优化策略概述. 中国生物工程杂志,2015,35(10): FuXM,KongLC,PeiZH,etal.Advanceintheresearchof antimicrobialpeptidesgeneexpresioninpichiapastor.china Biotechnology,2015,35(10): [9] 黄雪月, 张梁, 李赢, 等. 黑曲霉阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的组成型表达. 微生物学通报,2017,44(1): HuangX Y,ZhangL,LiY,etal.Constitutiveexpresionof feruloylesterase from A Spergilusnigerin Pichia pastoris. MicrobiolChina,2017,44(1): [10] 肖超, 张梁, 李颜颜, 等. 蜡样芽胞杆菌磷脂酶 C 在乳酸克鲁维酵母中重组表达纯化及酶学性质分析. 微生物学报, 2017,57(1): XiaoC, ZhangL,LiY Y, etal. Heterologousexpresion, purificationandcharacterizationofphospholipasecfrombacilus cereusinkluyveromyceslactis.actamicrobiologicasinica,2017, 57(1): [11]vanOoyenAJ,DekkerP,HuangM,etal.Heterologousprotein production in the yeastkluyveromyces lactis. FEMS Yeast Research,2006,6(3): [12]vandenBergJA,vandenLakenKJ,vanOoyenAJJ,etal. Kluyveromycesas a hostfor heterologous gene expresion: expresionandsecretionofprochymosin.biotechnology,1990,8 (2): [13] SwinkelsB W,vanOoyenA J,BonekampF J.Theyeast Kluyveromyceslactisasaneficienthostforheterologousgene expresion.antonievanleeuwenhoek,1993,64(2): [14] He X Z, Zhao D F, Huang H F, etal. Screening of Propionibacterium shermani strains with high production antibacterialmetabolitesbyntg mutation. JournalofAnhui AgriculturalSciences,2016,44(2):18?20. [15] 郭玮婷, 张慧, 查东风, 等. 产耐高温谷氨酰胺转胺酶菌株的快速筛选方法. 中国生物工程杂志,2015,35(8): GuoW T,ZhangH,ZhaD F,etal.A rapidmethodof screeningforthermostable transglutaminase from Streptomyces mobaraensis.chinabiotechnology,2015,35(8): [16] 袁伟, 柯涛, 杜敏华, 等. 牛凝乳酶原基因的合成及其在乳酸克鲁维酵母中的表达. 生物工程学报,2010,26(9): YuanW,KeT,DuM H,etal.Genesynthesisofthebovine prochymosin gene and high levelexpresion in Kluyvermyces lactis.chinesejournalofbiotechnology,2010,26(9): [17] 杨信怡, 游雪甫, 蒋建东. 溶葡球菌酶研究进展. 中国生化药物杂志,2005,26(6): YangXY,YouXF,JiangJD.Advancesinlysostaphinresearch. ChineseJournalofBiochemicalPharmaueuties,2005,26(6): [18] 王永, 刘沐荣, 万海同, 等. 聚乙二醇修饰重组溶葡球菌酶的初步研究. 中国生物工程杂志,2013,33(6): WangY,LiuM R,WanH T,etal.Chemicalmodificationof lysostaphin with activated polyethlene glycol. China Biotechnology,2013,33(6): [19]HoernigK J,DonovanD M,PithuaP,etal.Evaluationofa lysostaphin fusionproteinasadry cowtherapyforstaphylococus aureus mastitis in dairy catle. American Dairy Science Asociation,2016,99(6): [20] 袁怀兵. 重组溶葡萄球菌酶对奶牛子宫内膜炎的疗效研究. 当代畜禽养殖业,2013,12(19):6 7. YuanHB.Thestudyofrecombinantlysostaphinontreatmenttrial ofendometritisindairycatle.modernanimalhusbandry,2013, 12(19):6 7. [21] 陆锦春, 陈华鹏, 马怀彦, 等. 重组溶葡萄球菌酶在患子宫内膜炎奶牛体内的药代动力学与残留研究. 疾病防治,2012,2 (19): LuJC,ChenHP,MaHY,etal.Pharmacokineticsandresidue ofrecombinantlysostaphin in dairy cowswith endometritis. DiseasePrevention,2012,2(19):40 44.

10 58 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No HeterologousExpresion,Mutation,OptimizingtheExpresionCondition andcharacterizationoflysostaphininkluyveromyceslactis WANGXi 1 ZHANGGuang de 1 CHENXi ming 2 PUTong liang 1 (1SchoolofLifeSciences,LanZhouUniversity,Lanzhou ,China) (2NorthwestInstituteofEco EnvironmentandResources,ChineseAcademyofSciences,Lanzhou ,China) Abstract Accordingtothesequenceoflysostaphingenefrom Staphylococussimulansandcodonbiasof Kluyveromyceslactis,thePCRprimersweredesignedtoamplifythefragmentoflysostaphingene.Thefragment wasinsertedinpklac1,andtransformedtok.lactisgg799.thek.lactisgg799/pklac1 Lyswas cultivatedtoexpreslys.ahighexpresionstrain(mu4#)wereabtainedbyusingpowerfulmutagen(n methy1 N nitro N nitrosoguanidine,ntg)ontherecombinantandoptimizedtheexpresioncondition.thefermentation brothofmu4#waspurifiedbyni NTAagaroseandtheenzymecharacterizationwasstudied.Theresultshowed thattheactivityoflyswasapproximately5.2times(8000u/l)higherinthemutation.theoptimalinoculum doseofthemutant(mu4#)was40g/l;galactoseandnh 4 NO 3 (20g/L)wereaddedinevery24hours,Lys exhibitedoptimalexpresionatph 7.0~7.5;Furthermore,theLysenzymeoptimalreactionperformedat ph7.0~8.0andtemperatureat37.therecombinantlyswasstablebelow40 andph between3.0and 6.0.Sr 2+ stimulateditsactivitywhereasba 2+ Ca 2+ Zn 2+ Cu 2+ Mn 2+ Mg 2+ inhibitedtheactivities.this researchaccomplishedlysrecombinantexpresion,yieldimprovementbychemicalmutagenesisink.lactisand characterizationoflysostaphin.theseresearchresultsprovideprofoundguidingsignificanceforthelarge scale productionandapplicationofrecombinantlysostaphin. Keywords Kluyveromyceslactis Lysostaphin Recombinant Mutation

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌