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谨窘翟
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1 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology, 36(6): DOI:.844/cjcb 对乙酰氨基酚诱导的小鼠药物性肝损伤的模型研究李大伟陆天飞华相伟张健健王维刚崔小兰戴绘娟张明夏强 ( 上海交通大学医学院附属仁济医院肝脏外科, 上海 7; 上海南方模式生物研究中心, 上海 3) 摘要改良对乙酰氨基酚 (acetaminophen, APAP) 单独诱导小鼠急性肝损伤的模型和致死模型随机将小鼠分为 4 组 : 空白对照组 APAP 3 h 组 APAP 6 h 组和 APAP h 组, 每组 5 只饥饿 5 h 后用对乙酰氨基酚诱发小鼠肝损伤测定各组血清 ALT AST 及胆红素含量, HE 染色观察各组肝组织损伤情况观察生存率时, 小鼠随机分为对照组禁食 +APAP(5 mg/kg) 组禁食 +APAP(3 mg/kg) 组和不禁食 +APAP(5 mg/kg) 组, 四组同时给药, 然后记录各组小鼠的生存情况, 绘制四组小鼠的生存曲线小鼠注射 APAP 后, 随时间的延长, ALT AST 水平逐渐升高, 均明显高于空白对照组 (P<.5) 小鼠肝脏 HE 染色可见, APAP 中毒组小鼠肝细胞坏死及炎性细胞浸润禁食 +APAP(5 mg/kg) 组小鼠自 6 h 开始出现死亡, 7 h 时全部死亡, 死亡率明显高于不禁食组和禁食 +APAP(3 mg/kg) 组小鼠该研究对 APAP 引起的 C57/BL6 小鼠药物性肝损伤模型进行改良, 使其更加稳定和便于研究, 为进一步探究 APAP 诱导肝毒性的机制及防治措施奠定了基础关键词急性肝损伤 ; 对乙酰氨基酚 ; 动物模型 The Model of Acute Liver Injury Induced by Acetaminophen in Mice Li Dawei, Lu Tianfei, Hua Xiangwei, Zhang Jianjian, Wang Weigang, Cui Xiaolan, Dai Huijuan, Zhang Ming, Xia Qiang ( Department of Liver Surgery, Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 7, China; Shanghai Research Center of Model Organisms, Shanghai 3, China) Abstract The aim of the study was to improve the acute liver injury model and lethal model of mice induced by acetaminophen (APAP) injection. mice were divided into 4 groups randomly: normal control, APAP 3 h group, APAP 6 h group, and APAP h group. Mice were fasted for 5 hours before APAP injection to induce liver injury. We assayed serum alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and examined liver pathologic changes after APAP injection by HE staining. mice were divided into four groups: control group, fast+apap (5 mg/kg) group, fast+apap (3 mg/kg) group and non-fast+apap (5 mg/kg) group. The four groups were administrated at the same time. We observed the survival status of mice before and after APAP administration and made survival curve. Serum ALT and AST levels increased by time after APAP administration and were significantly higher than that in control group (P<.5). Liver specimens of APAP mice displayed characteristic centrilobular necrosis and inflammatory infiltration. All mice of fast+apap (5 mg/kg) group died within 6 to 7 hours, and the mortality was significantly higher than those of the other 3 groups. Our study successfully improved acute liver injury model and lethal model of C57/BL6 mice induced by APAP, which laid the 收稿日期 : 3--9 接受日期 : - 3- 国家自然科学基金 ( 批准号 : 87558) 资助的课题通讯作者 Tel: , xiaqiang@medmail.com.cn Received: December 9, 3 Accepted: March, This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No.87558) Corresponding author. Tel: , xiaqiang@medmail.com.cn 网络出版时间 : :9 URL:

2 86 技术与方法 foundation for further exploration of mechanism and control measures of APAP-induced hepatotoxicity. Key words acute liver injury; acetaminophen; mice model 对乙酰氨基酚 (acetaminophen, APAP) 是临床常用的解热镇痛药, 治疗剂量内安全并且疗效可靠但当使用过量时, APAP 可以导致严重的急性肝脏及肾脏功能衰竭, 严重者可导致患者死亡 APAP 造成的急性肝衰竭已成为发达国家急性肝衰死亡的最常见因素, 已引起了严重的公共健康安全问题 [-] 对于保守治疗无效的患者, 肝移植是唯一有效的治疗措施 APAP 诱导的肝脏毒性是一种毒性代谢损伤, 肝细胞内经 CYP45 酶系代谢转化生成高活性的亲电子物 N- 乙酰对苯醌亚胺 (N-acetyl-p-benzo-quinone Imine, NAPQI), 可通过坏死和凋亡的方式造成肝细胞的死亡, 进而活化人体 NK NKT 中性粒细胞, 使炎性因子过表达, 从而激活人体固有免疫系统 [3-4] 最新研究表明 [5], 人体炎症反应及免疫应答在 APAP 所致的肝脏毒性中也起重要作用另外, 文献报道认为 [6], APAP 的肝脏毒性与肝细胞线粒体功能障碍自由基代谢产物增加及氧化应激等有密切关系 APAP 诱导的相关动物肝毒性模型是研究临床上 APAP 肝损伤的重要手段本文对 APAP 诱导的 C57/BL6 小鼠药物性肝损伤模型进行研究和改良, 造模方法简单有效, 有助于对 APAP 肝脏毒性的相关研究材料与方法. 实验动物试剂与仪器实验试剂与仪器 : APAP(Sigma 公司 ) 溶于中, 浓度为 mg/ml, 55 C 水浴锅加热至完全溶解, 现用现配 ; % 中性福尔马林 ; ml 注射器实验动物 : 9 周龄健康雄性 C57/BL6 小鼠购自上海南方模式生物科技发展有限公司小鼠体重 ~ g. APAP 改良模型的制备.. APAP 损伤模型制备 C57/BL6 小鼠只, 随机分为 4 组 : 空白对照组 APAP 3 h 组 APAP 6 h 组 APAP h 组所有小鼠均禁食不禁水 5 h( 晚 8: 至第二天早 9:), 空白对照组腹腔注射, 注射剂量同相同体重 APAP 组小鼠 APAP 3 h 组 6 h 组和 h 组小鼠均腹腔注射 mg/ml 的 APAP 溶液, 注射剂量为 5 mg/kg 注射 APAP 后恢复正常食物供应.. APAP 致死模型制备 C57/BL6 小鼠只, 随机分为 4 组 : 对照组禁食 +APAP(3 mg/kg) 组禁食 +APAP(5 mg/kg) 组和不禁食 +APAP(5 mg/kg) 组, 根据组别分别给予腹腔注射或 APAP, 处理方法同上.3 模型评价.3. 肝功能及肝组织病理损伤的检测 APAP 3 h 组 APAP 6 h 组和 APAP h 组共 3 组小鼠分别于注射 APAP 后 3, 6, h, 以 3% 戊巴比妥钠按. ml/g 麻醉, 然后采集各组小鼠腹主动脉血分离血清, 测定血清丙氨酸转氨酶 (alanine aminotransferase, ALT) 和天冬氨酸转氨酶 (aspartate aminotransferase, AST) 的水平 ; 取小鼠肝组织, 用体积分数为 % 的福尔马林固定, 脱水, 石蜡包埋, 切片 ( 厚 5 μm), HE 染色, 于显微镜下观察肝组织病理改变根据病理结果, 评定各组标本的 SUZUKI 评分 ( 主要包括三项指标 : 充血空泡形成及坏死程度, 每项指标根据严重程度分为到 4 分, 总分共分 ), 比较各组肝组织损伤程度.3. 生存率的测定四组 APAP 致死模型 : 对照组禁食 +APAP(5 mg/kg) 组禁食 +APAP(3 mg/kg) 组和不禁食 +APAP(5 mg/kg) 组在处理后每 h 观察小鼠生存状态, 连续观察 7 h.4 统计学分析采用 SPSS 9. 软件进行统计处理数据以均数 ± 标准差 (x _ ±s) 表示, 组间均数的比较采用单因素方差分析, P<.5 为差异有统计学意义结果. 小鼠肝功能变化由图可知, APAP 3 h 组 APAP 6 h 组 APAP h 组与对照组比较, 血清 ALT AST 均明显高于空白对照组 (P<.5), 且随时间延长而逐渐升高. 小鼠肝脏病理变化肝脏坏死情况逐渐加重 SUZUKI 评分亦逐渐增高, 与肝脏病理 HE 染色坏死程度呈正相关 ( 图和图 3) 空白对照组 : 肝小叶结构完整, 肝细胞绕中央静脉呈放射状排列, 肝细胞未见变性坏死

87 李大伟等: 对乙酰氨基酚诱导的小鼠药物性肝损伤的模型研究 5 5 5 5 3h 6h AST level (U/L) ALT level (U/L) 5 5 h 3h 6h h P<.5, 与空白对照组(组)相比 P<.5 compared with the control group ( group). 图 APAP处理后ALT和AST随时间的变化 Fig.

3 87 李大伟等: 对乙酰氨基酚诱导的小鼠药物性肝损伤的模型研究 h 6h AST level (U/L) ALT level (U/L) 5 5 h 3h 6h h P<.5, 与空白对照组(组)相比 P<.5 compared with the control group ( group). 图 APAP处理后ALT和AST随时间的变化 Fig. Serum ALT and AST levels increased over time after APAP administration APAP 3 h APAP 6 h APAP h 4 ( ): 中性粒细胞; ( ): 单核细胞; ( ): 淋巴细胞 ( ): neutrophils; ( ): monocyte; ( ): lymphocyte. Fig. 图 APAP处理后小鼠肝脏HE染色随时间的改变 Pathologic changes of HE staining of mice liver after APAP administration..8 8 SUZUKI score Control 6 4.APAP 3 h APAP 6 h P<.5, 与空白对照组相比.8 P<.5 compared with the control group..8 APAP h.6.4 图3 各组SUZUKI评分比较.6 Fig.3 Comparison of SUZUKI score among different groups non-fast+apap ( Control 6 7 Time (h) fast+apap (5 mg/kg) Control fast+apap (3 mg/kg) fast+apap (5 mg/kg) non-fast+apap (5 mg/kg) fast+apap mg/kg) 图4 (3 不同处理组间生存率比较 non-fast+apap (5 mg/kg) Fig.4 Comparison of survival rates among different groups 36 Time (h) 6 fast+apap (3 m.6.. fast+apap (5 m 7 6 7

4 88 技术与方法 APAP 3 h 组 : 肝小叶轮廓清楚, 部分肝细胞轻度水肿, 胞浆早期气球样变和嗜酸性变 APAP 6 h 组 : 肝小叶结构尚可, 可见点状坏死灶及肝细胞水肿和炎症浸润等病变 APAP h 组 : 肝小叶结构模糊, 见大片状坏死灶, 门管区大量炎症细胞浸润, 炎症细胞主要以中性粒细胞为主, 其次还有淋巴细胞单核细胞.3 小鼠生存状态变化实验观察显示, 禁食 +APAP(5 mg/kg) 组小鼠注射 APAP 后体温逐渐降低, 饮食饮水减少, 精神萎靡, 活动性下降小鼠自 6 h 开始出现死亡, 7 h 时全部死亡, 死亡率 % 禁食 +APAP(3 mg/kg) 组小鼠同样出现体温降低及萎靡不振, 但生存状况明显优于禁食 +APAP(5 mg/kg) 组, 7 h 死亡率为 % 而不禁食 +APAP(5 mg/kg) 组出现轻度萎靡, 7 h 内无死亡对照组小鼠无明显饮食活动改变, 在观察时间内无死亡生存曲线见图 4 3 讨论对乙酰氨基酚是临床常用的解热镇痛药, 过量使用容易导致肝脏衰竭甚至死亡, 因此探究对乙酰氨基酚造成肝脏毒性的机制从而研究相应的预防及治疗措施是非常有必要的建立一套可以在 C57/ BL6 品系下实现 APAP 诱导小鼠肝脏毒性的模型方法, 对于研究 APAP 肝毒性的机制及防治措施具有重要的应用价值本实验结果显示, 小鼠禁食后给予对乙酰氨基酚 (APAP) 腹腔注射 (5 mg/kg), 血清谷草转氨酶及谷丙转氨酶明显高于空白对照组, 同时肝脏 HE 染色也可见明显的病理损伤及炎细胞浸润, 并随时间的延长而加重这些结果提示, 对乙酰氨基酚过量可引起肝脏的炎症反应肝细胞破坏及造成小鼠肝功能降低通过对小鼠生存状态的观察发现, 禁食 +APAP(5 mg/kg) 组小鼠在注射 APAP 后, 饮食饮水明显减少, 精神萎靡, 活动性下降小鼠自 6 h 开始出现死亡, 7 h 时已全部死亡, 而不禁食组及禁食 +APAP(3 mg/kg) 组小鼠生存状态明显优于禁食 +APAP(5 mg/kg) 组空白对照组小鼠生存状态正常, 无精神饮食及活动方面的变化这说明适当时间的禁食 (5 h 过夜 ) 并且给予大量的 APAP(5 mg/kg) 是造模的关键这也与临床实践中的发现相一致, APAP 多在空腹和过量服用的情况下导致病人发生急性药物性肝损伤对 APAP 肝细胞毒性的早期研究主要集中在代谢方面, 正常情况下, APAP 主要通过 CYP45 代谢, 通过与葡糖醛酸结合而解毒, 但同时会产生一定量的高活性代谢产物 NAPQI, NAPQI 可造成细胞膜的脂质过氧化, 并能够影响内质网线粒体等细胞器的功能, 从而导致肝细胞损伤及死亡机体通过使 NAPQI 和谷胱甘肽 (GSH) 结合而解毒, 但当肝细胞内的 GSH 耗竭之后, 肝细胞坏死随即发生及时使用 GSH 前体乙酰半胱氨酸或硫乙胺处理, 则可减轻对乙酰氨基酚对肝脏的损害 APAP 还可以使线粒体的膜流动性降低, 改变线粒体的膜电位, 从而诱发线粒体功能障碍, 继而造成肝细胞坏死线粒体膜稳定剂, 如环胞菌素 A 三氟拉嗪等可明显降低 [7] APAP 的肝细胞毒性 [8] 越来越多的研究证实, APAP 首先通过毒性代谢产物直接造成肝细胞的坏死和凋亡, 继而激活人体固有免疫系统, 通过活化 NK 细胞 NKT 细胞中性粒细胞等造成炎性因子表达上调肝细胞坏死产物激活固有免疫系统的分子机制与无菌炎症反应的过程有很多共同点, 是目前的研究热点 APAP 诱导的肝细胞凋亡后产生的 DNA 可以激活 Tlr9, Tlr9 与 Nalp3 协同作用可促使 pro-il-β pro-il-8 转化成 IL-β 和 IL-8 IL-β 是一种重要的促炎因子, 在 APAP 诱导的肝毒性过程中明显升高 Tlr9 拮抗物和阿司匹林可明显缓解 APAP 造成的小鼠肝功能损害并降低其死亡率这种保护效果可能与阿司匹林下调促炎因子的表达有关, 应用 APAP 与阿司匹林的混合制剂可能会对 APAP 过量时产生的肝细胞毒性有保护作用中性粒细胞也在 APAP 引起的炎性过程中起重要作用, 通过阻断中性粒细胞激活的通路, [9-] 可明显减轻 APAP 的肝细胞毒性关于 NKT 细胞在 APAP 肝细胞毒性的发病过程中的作用尚存在争议, 有研究报道, NKT 细胞在 APAP 诱导的肝损中起 [] 保护作用, 敲除 NKT 后损伤加重而也有研究认为, [4] NKT 促进了 APAP 的肝毒性所以, 固有免疫系统在 APAP 的发病过程中起的作用可能是多方面的, 明确的机制及其临床应用仍需要进一步的研究有文献报道在饥饿情况下, 肝内的谷胱甘肽耗竭, APAP 的毒性代谢产物清除不及时更容易造成 [3-4] 肝细胞损伤本实验在饥饿条件下给予小鼠

5 李大伟等 : 对乙酰氨基酚诱导的小鼠药物性肝损伤的模型研究 89 APAP 处理, APAP 组小鼠 ALT AST 均明显高于对照组, 同时病理组织学检查证实饥饿条件下给予小鼠 APAP 处理, 可引起肝细胞变性, 并随时间延长逐渐出现炎性细胞浸润, 最终导致肝小叶网架的塌陷及中央型坏死和灶性坏死, 实验组与对照组比较有显著性差异通过比较生存率发现, 不禁食组小鼠无死亡, 而禁食组小鼠全部死亡, 进一步肯定了禁食对 APAP 肝毒性的重要作用另外, 禁食时间的长短也是造模的关键因素, 过长时间的禁食会造成小鼠的体内代谢紊乱, 增加干扰因素 ; 而禁食时间太短又会造成小鼠体内剩余食物过多, 无法达到 APAP 迅速消耗 GSH 的效果本研究的病理结果与文献报道的 APAP 的肝毒性的发展过程相符合, 即在第一阶段, APAP 的毒性代谢产物 NAPQI 通过影响线粒体内质网的功能及氧化应激等方式造成肝细胞的变性及少量的肝细胞坏死 ; 在第二阶段, 坏死的肝细胞释放的 DNA 可以激活人体固有免疫系统, 通过活化 NK 细胞 NKT 细胞中性粒细胞等造成炎性因子表达上调, 进而加速肝细胞的破坏, 造成肝小叶结构破坏和肝细胞大片状坏死 APAP 诱导的小鼠急性肝脏损伤已有大量的相关模型报道, 但是否禁食禁食时间的长短及注射 APAP 的剂量各不相同, 从 mg/kg 到 5 mg/kg 不等, 这些模型都存在着造模不稳定不同研究中心的实验数据及不同的实验批次之间差距很大的缺陷小鼠个体差异明显影响造模成功率本模型模拟临床病人发病情况, 造模前对小鼠预先禁食 5 h, 消耗小鼠食物储备, 进而消除小鼠的饮食差异对造模的影响, 然后腹腔注射大剂量 APAP(5 mg/kg) 小鼠 7 h 内死亡率为 %, 转氨酶随时间延长而升高, 模型稳定性明显优于低剂量 3 mg/kg 组及不禁食组综上所述, 本文介绍了可以有效且稳定地诱导 C57/BL6 小鼠 APAP 肝中毒模型的方法, 同以往模型相比, 本方面造模简单, 稳定性高, 可供研究者对 APAP 引起的肝损伤同时进行肝功能及生存率的研究该模型的应用对进一步研究 APAP 肝毒性的发病机制及防治措施具有重要意义参考文献 (References) Lee WM. Acetaminophen toxicity: Changing perceptions on a social/medical issue. Hepatology 7; 46(4): Kaplowitz N. Acetaminophen hepatoxicity: What do we know, what don t we know, and what do we do next? Hepatology ; 4(): Liu ZX, Han D, Gunawan B, Kaplowitz N. Neutrophil depletion protects against murine acetaminophen hepatotoxicity. Hepatology 6; 43: Liu ZX, Govindarajan S, Kaplowitz N. Innate immune system plays a critical role in determining the progression and severity of acetaminophen hepatotoxicity. Gastroenterology ; 7(6): Connolly MK, Ayo D, Malhotra A, Hackman M, Bedrosian AS, Ibrahim J, et al. Dendritic cell depletion exacerbates acetaminophen hepatotoxicity. Hepatology ; 54(3): Saini SP, Zhang B, Niu Y, Jiang M, Gao J, Zhai Y, et al. Activation of liver X receptor increases acetaminophen clearance and prevents its toxicity in mice. Hepatology ; 54(6): Reid AB, Kurten RC, McCullough SS, Brock RW, Hinson JA. Mechanisms of acetaminophen-induced hepatotoxicity: Role of oxidative stress and mitochondrial permeability transition in freshly isolated mouse hepatocytes. J Pharmacol Exp Ther 5; 3(): Connolly MK, Ayo D, Malhotra A, Hackman M, Bedrosian AS, Ibrahim J, et al. Dendritic cell depletion exacerbates acetaminophen hepatotoxicity. Hepatology ; 54(3): Marques PE, Amaral SS, Pires DA, Nogueira LL, Soriani FM, Lima BH, et al. Chemokines and mitochondrial products activate neutrophils to amplify organ injury during mouse acute liver failure. Hepatology ; 56(5): Jaeschke H, McGill MR, Williams CD. Pathophysiological relevance of neutrophils in acetaminophen hepatotoxicity. Hepatology 3; 57(): 49. Jaeschke H, Liu J. Neutrophil depletion protects against murine acetaminophen hepatotoxicity: Another perspective. Hepatology 7; 45(6): 588-9; author reply 589. Martin-Murphy BV, Kominsky DJ, Orlicky DJ, Donohue TM Jr, Ju C. Increased susceptibility of natural killer T-cell-deficient mice to acetaminophen-induced liver injury. Hepatology 3; 57(4): James LP, Mayeux PR, Hinson JA. Acetaminophen-induced hepatotoxicity. Drug Metab Dispos 3; 3(): Gujral JS, Knight TR, Farhood A, Bajt ML, Jaeschke H. Mode of cell death after acetaminophen overdose in mice: Apoptosis or oncotic necrosis? Toxicol Sci ; 67(): 3-8.

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中草药致谢李沛赵继敏郑智敏江亚楠等病理生理学教研室老师在实验中给予的指导和帮助狄建彬顾振纶赵笑东钱培刚蒋小岗郭次仪中草药中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 8 期 10 年 8 月 1324 LDL C 非常明显升高 (