蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法 : 是根据载体的遗传特征筛选重组子, 如 α- 互补抗生素基因等现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的 DNA 的短区段, 其中有 β- 半乳糖苷酶基因 (lacz) 的调控序列和前 146 个氨基酸的编码信息在这个编码区中插入了一个多克隆位点 (MCS),

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霈农
5 years ago
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PCR 原理 ( 百度百科 ) PCR 技术的基本原理类似于 DNA 的天然复制过程, 其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物 PCR 由变性 -- 退火 -- 延伸三个基本反应步骤构成 :1 模板 DNA 的变性 : 模板 DNA 经加热至 93 左右一定时间后, 使模板 DNA 双链或经

TaqDNA 聚合酶的作用下, 以 dntp 为反应原料, 靶序列为模板, 按碱基互补配对与半保留复制原理, 合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链, 重复循环变性 -- 退火 -- 延伸三过程就可获得更多的半保留复制链, 而且这种新链又可成为下次循环的模板每完成一个循环需 2~4

可能的情况下可缩短该步骤时间变性时间过长损害酶活性, 过短靶序列变性不彻底, 易造成扩增失败引物退火退火温度需要从多方面去决定, 一般根据引物的 Tm 值为参考, 一般比 Tm 低 5~10 度退火温度对 PCR 的特异性有较大影响引物延伸引物延伸一般在 72 进行 (Taq

1 PCR 原理 ( 百度百科 ) PCR 技术的基本原理类似于 DNA 的天然复制过程, 其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物 PCR 由变性 -- 退火 -- 延伸三个基本反应步骤构成 :1 模板 DNA 的变性 : 模板 DNA 经加热至 93 左右一定时间后, 使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离, 使之成为单链, 以便它与引物结合, 为下轮反应作准备 ;2 模板 DNA 与引物的退火 ( 复性 ): 模板 DNA 经加热变性成单链后, 温度降至 55 左右, 引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合 ;3 引物的延伸 :DNA 模板 -- 引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下, 以 dntp 为反应原料, 靶序列为模板, 按碱基互补配对与半保留复制原理, 合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链, 重复循环变性 -- 退火 -- 延伸三过程就可获得更多的半保留复制链, 而且这种新链又可成为下次循环的模板每完成一个循环需 2~4 分钟,2~3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍预变性模板 DNA 完全变性与 PCR 酶的完全激活对 PCR 能否成功至关重要, 建议加热时间参考试剂说明书, 一般未修饰的 Taq 酶激活时间为两分钟变性步骤循环中一般 95,30 秒足以使各种靶 DNA 序列完全变性, 可能的情况下可缩短该步骤时间变性时间过长损害酶活性, 过短靶序列变性不彻底, 易造成扩增失败引物退火退火温度需要从多方面去决定, 一般根据引物的 Tm 值为参考, 一般比 Tm 低 5~10 度退火温度对 PCR 的特异性有较大影响引物延伸引物延伸一般在 72 进行 (Taq 酶最适温度 ) rtaq 扩增效率是 1000bp/min 延伸时间随扩增片段长短而定, 如, 目标片段 1800bp, 延伸时间可设为 2min 循环数大多数 PCR 含循环, 过多易产生非特异扩增最后延伸成双链在最后一个循环后, 反应在 72 维持 7~10 分钟. 使引物延伸完全, 并使单链产物退火

2 蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法 : 是根据载体的遗传特征筛选重组子, 如 α- 互补抗生素基因等现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的 DNA 的短区段, 其中有 β- 半乳糖苷酶基因 (lacz) 的调控序列和前 146 个氨基酸的编码信息在这个编码区中插入了一个多克隆位点 (MCS), 它并不破坏读框, 但可使少数几个氨基酸插入到 β- 半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能, 这种载体适用于可编码 β- 半乳糖苷酶 C 端部分序列的宿主细胞因此, 宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性, 但它们同时存在时, 可形成具有酶学活性的蛋白质这样,lacZ 基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补, 称为 α- 互补由 α- 互补而产生的 LacZ+ 细菌在诱导剂 IPTG 的作用下, 在生色底物 X-Gal 存在时产生蓝色菌落, 因而易于识别然而, 当外源 DNA 插入到质粒的多克隆位点后, 几乎不可避免地导致无 α- 互补能力的氨基端片段, 使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落这种重组子的筛选, 又称为蓝白斑筛选 RACE 是采用 PCR 技术由已知的部分 cdna 顺序来扩增出完整的 cdna 3 ' 和 5 ' 端的方法, 又被称为单边 PCR(one-sided PCR) 和锚定 PCR(anchored PCR) 3'-RA CE 的般过程是 : 以 oligo(dt)17 和在许多文章中被称为锚引物 (anchor primer) 或接头 (adaptor) 的序列组成的引物 QT 逆转录 mrna 得到第一条 cdna 链, 然后用含部分锚引物序列的引物 Q0 与基因特异性引物 GSP1 进行第一轮扩增得到双链 cdna, 第二轮扩增则采用内部引物 (nested primer)ql 和 GSP2, 以防止产生非特异性扩增产物采用同样的原理可以进行 5'-RACE, 先用基因特异性引物 GSP-RT 逆转录 mrna 获得 cdna 第一条链 I 然后用末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT) 和 datp 在 cdna 5 ' 端加上 poly(a) 尾巴再使用 (1)QT 引物合成 cdna 第二条链 ; (2)Qo 和一个在 GSP-RT 上游的引物 GSP1 扩增 cdna, 最后采用内部引物 Q1 和 GSP2 进行第二轮 PCR 扩增以提高特异性扩增后得到的双链 cdna 用限制性内切酶酶切和 Southern 杂交分析并克隆, 得到 5' 特异性和 3 特异性的 cdna 文库从两个有相互重叠顺序的 5' 和 3' RACE 产物中可以获得全长 cdna, 或者可以分析 5 ' 和 3 ' 端顺序, 合成相应引物扩增出全长 cdna 反转录两步法 1) 在 ProE K 处理的的 PCR 管中 ( 冰上操作 ) RNA 1ul Oligo(dT)18 Primer 2ul RNase Free H2O 9ul 12ul 2)70 保温 10min 后迅速在冰上急冷 2min 以上 3) 在 PCR 管中配置下列反转录溶液 5 M-MLV Buffer 4ul dntp mixture (10mM) 1ul

3 RNase Inhibitor 0.5ul RTase M-MLV (RHase H) 0.8ul RNase Free H2O 1.7ul 8ul 4) 42 延伸 60min,70 保温 15min, 冰上冷却得到 cdna -20 报存一步法 5 Reaction Buffer SupermoⅢ M-MLV RRI(40U/ul) dntp mixture (10mM) RNase Free H2O 引物 (Oligo(dT)18 Primer) RNA 4.0ul 1.0ul 0.5ul 2.0ul 10ul 1.0 ul 1.5ul 20ul 50 60min 70 10min 置冰上 cdna 内参检测内参引物用 Ef1α, 或者 GAPDH,ACTIN 10 buffer 2.5 μl 94 3min dntp mix (2.5mM) 2 μl 94 30s MgCL 2 (25mM) s 30~35 轮引物 1(10pM) 72 30s 引物 2(10pM) 72 7min Taq 酶 0.2μl cdna ddh2o 16 μl PCR 10 buffer ( 不含 MgCL 2 )2.5 μl 25 dntp mix (2.5mM) 2 μl 20 MgCL 2 (25mM) 1.5 引物 1(10pM) 10 引物 2(10pM) 10 Taq 酶 (2U/μl) 0.2μl 2 DNA 模板 (50ng-1μg/μl) ddh2o 16 μl ~5min 94 30s 50~65 30s 28~35 轮 72 30s~2min 72 7~10min

4 退火温度根据设计的引物设定,72 延伸根据片段长度设定一般先缓冲液,dNTP mix, 水, 引物 ( 若相同 ),Taq 酶配成混样, 混匀后分装到 PCR 管中若使用排管, 加石蜡结束反应,PCR 产物放置于 4 待电泳检测或 -20 长期保存电泳检测凝胶电泳 1% 的琼脂糖凝胶 : 称取 1g 琼脂糖, 加 100ml TAE 缓冲液, 微波加热后待温度降至 60 度以下, 加入适量 EB( 一般是两滴, 视 EB 浓度而定 ), 倒入板子上, 插上梳子一般检测用小号梳子 ( 一排 25 个 ), 加 10ulPCR 产物 ; 产物胶回收用中号 (18 个 ) 或大号梳子 (13 个 ), 一般分别加 20ul 产物或 50ul 产物产物凝胶回收采用胶回收试剂盒, 方法详见说明书, 按步骤操作注意 : 提前将 Eluent 或去离子水放入 80 度烘箱 BUFFER W2 确保使用前已经加入指定体积的无水乙醇最后洗脱时, 一般加 20ul Eluent 或去离子水, 可延长静置时间 PCR 产物回收采用产物回收试剂盒, 方法详见说明书, 按步骤操作连接目的片段 2.0ul ( 根据条带亮度酌量添加 ) Solution I 2.5 ul PMD19-T 0.5ul 5ul 离心 16 30~60min ( 使用金属浴或 PCR 仪, 片段长可增加延伸时间 ) 转化 1. 将连接产物加入大肠杆菌感受态 100ul( 至少 50ul), 混匀后冰浴 30min 2. 热激 ;42 60~90s 3. 冰浴 3min, 加入 LB 液体 600~800ul,37 摇床 1~2h 4. 凃板 : 离心 4000rpm/min 5min 或者 12000rpm/min 1min 在提前灭过菌的组培台上, 将上清液吸出, 留 100~200ul 上清, 吸打沉淀至混匀后加到板子上, 涂布至完全吸收 ( 刚开始涂布感觉是光滑的, 完全吸收后感觉是粘的, 自己体验吧 )

5 5.37 度烘箱, 放置 12~16h 若板长模糊多可能是抗生素失效, 也可能是感受态污染若板未长出当跑胶条带不亮时, 板未长出菌时, 跑胶检测是否胶回收到产物, 可增加目的片段至 2.5ul,solutionI 加入 2ul, 或者将体系扩大到 10ul, 或者以胶回收产物为模板,PCR 扩增胶回收后再连接转化菌液检测 ( 仅适用大肠杆菌 ) 在 1.5ml 离心管中加入适量含抗生素的 LB(600ML) 用白枪头挑取单克隆 ( 白斑 ), 放入含抗生素 LB 中, 用 parafilm 包住离心管后, 放入摇床摇 2h 以上, 吸取 1~2ul 作模板, 引物是采用跑出条带的引物, 普通 PCR 程序跑胶查看是否可以跑出目的条带片段长度基因克隆中间片段获得 1) 从转录组中获得中间片段 2) 设计简并引物, 以 cdna 为模板,PCR 后胶回收连接转化测 3 RACE 利用 mrna 的 3' 末端的 poly(a) 尾巴作为一个引物结合位点, 以末端 poly(t) 通用引物作为锁定引物反转录合成标准第一链 cdna 然后用基因特异引物 GSP1(gene specific primer, GSP) 作为上游引物, 用一个含有部分接头序列的通用引物作为下游引物, 以 cdna 第一链为模板, 进行 PCR 循环, 把目的基因 3' 末端的 DNA 片段扩增出来 1) 反转录以 Adaptor 或者 B26 代替 OligodT(18) 进行反转录得到 cdna 2) 进行三轮 PCR 第一轮 : 模板 cdna 引物 :GSP1,Adaptor-R/B26-R 第二轮 : 模板第一轮产物引物 :GSP2,Adaptor-R/B26-R 第三轮 : 模板第二轮产物引物 :GSP3,Adaptor-R/B26-R 10 buffer 2.5 μl dntp mix (2.5mM) 2 μl MgCL 2 (25mM) 1.5 引物 1(10pM) 引物 2(10pM) Taq 酶 0.2μl 模板 ddh2o 16 μl 94 3~5min 94 30s 50~65 30s 35 轮 72 30s~2min 72 10min

6 5 RACE 1) 反转录 : 引物为设计的特异引物 SP1 2)PCR 产物回收 3)cDNA TdT 加尾 DEPC-ddH 2 O 6.5ul 5 Tail Buffer 5.0ul 2mM dctp 2.5ul 离心,94 2~3min 冰浴 1min 纯化的 cdna 10ul 稍离心置冰上 0.8~1ul TdT 稍混匀 37 10~30min 65 10min 离心, 于冰上 4) 第一轮巢式 PCR 10 buffer 2.5 μl dntp mix (10mM) 0.5 μl MgCL 2 (25mM) 1.5 GSP2(10pM) AAP Taq 酶 0.2μl dc-tailed cdna 2.5 μl ddh2o 16 μl 94 1~2min ~1min 50~65 0.5~1min 35 轮 72 1~2min 72 10min 5) 第二轮巢式 PCR 将第一轮产物稀释 100 倍

7 10 buffer 2.5 μl dntp mix (10mM) 0.5 μl MgCL 2 (25mM) 1.5ul GSP3(10pM) 0.5 μl AUAP 0.5μl Taq 酶 0.2μl 稀释 PCR 产物 2.5 μl ddh2o 17 μl 高保真全长验证所用反应组分置于冰上,DMSO 常温融化 RNA Free H2O 12 ul 27ul 5 phusion HF 或 GC Buffer 4 ul 10ul 10mM dntps 0.4 ul 1ul 10uM 正向引物 1 ul 2.5ul 10uM 反向引物 1 ul 2.5ul 模板 (cdna 或基因组 DNA) 1~2ul 5ul DMSO( 可选 ) 0.6 ul 1.5ul Phusion DNA 聚合酶 0.2ul 0.5ul 20ul 50ul 离心混匀 98 30s 98 5~10s 45~72 10~30s 25~ 35 轮 72 15~30s/Kb 72 5~10min 跑胶回收加 A 尾 PCR 回收产物加入下述混合液 10 buffer 2.5 μl dntp mix (2.5mM) 2.0 μl MgCL 2 (25mM) 1.5ul rtaq 0.2ul

8 离心,72 30min 产物回收也可以先用 2~3ul 确定是否有目的条带, 再产物回收, 加 A 尾, 胶回收

2004级研究生现代免疫学实验技术结业报告

2004级研究生现代免疫学实验技术结业报告 PCR PCR PCR RT-PCR PCR (Polymerase Chain Reaction,PCR) 80 DNA, DNA PCR PCR PCR DNA PCR -- -- DNA DNA 93 DNA PCR DNA DNA ( ) DNA 55 DNA DNA -- TaqDNA dntp DNA -- -- PCR PCR DNA DNA Y (1 X) n Y DNA X (Y)