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1 550 临床研究与应用 BRMS1 和 Cx43 蛋白异常表达与甲状腺癌发生发展关系的研究 * 吴宇 刘辉 摘要目的 : 探索甲状腺癌组织中乳腺癌转移抑制基因 1(breast cancer metastasis suppressor 1,BRMSl) 和细胞缝隙连接蛋白 43(connexin 43,Cx43) 的表达与患者临床资料 预后的关系 方法 : 收集 2009 年 1 月至 2013 年 6 月间福建省肿瘤医院头颈外科采用免疫组织化学 S 法检测 195 例组织石蜡标本中 BRMS1 和 Cx43 蛋白表达情况, 其中包括甲状腺癌 90 例, 甲状腺腺瘤 45 例, 结节性甲状腺肿和正常甲状腺组织各 30 例 结果 : 甲状腺癌组织中 BRMS1 和 Cx43 蛋白的阳性表达率分别为 56.7%(/90) 和 41.1%(37/ 90), 均显著低于其他 3 组组织标本 ( 均 ) Cx43 蛋白在不同病理类型组织中阳性表达率差异有统计学意义 ( 均 <0.05): 乳头状癌 61.9%, 髓样癌 27.8%, 滤泡状癌 27.3%, 未分化癌 12.5%; 而 BRMS1 的表达未见显著性差异 BRMS1 和 Cx43 蛋白在淋巴结转移患者癌组织中表达率均显著低于无淋巴结转移患者 ( 均 ); 亚组分析显示随着肿瘤 TNM 分期的改变,BRMS1 和 Cx43 蛋白的阳性表达率逐渐下降, 且两种蛋白表达呈正相关 (r=0.494,=0.032) 结论:BRMS1 和 Cx43 蛋白在甲状腺癌组织中表达均显著下降, 且其表达差异与甲状腺癌的浸润转移 肿瘤恶性程度及 TNM 分期有关, 二者联合检测或有利于复发转移的判断 关键词甲状腺癌乳腺癌转移抑制基因 1 连接蛋白 43 免疫组织化学 doi: /j.issn Yu WU, Hui LIU Abnormal expression of BRMS1 and in thyroid cancer occurrence and progression Correspondence to: Hui LIU; @qq.com Department of Head and Neck Surgery, Fujian rovince Cancer Hospital, Teaching Hospital of Fujian Medical University. This work was supported by the Scientific Research roject of Fujian rovincial Health Bureau (No ). Abstract Objective: To investigate the protein expression levels of breast cancer metastasis suppressor 1 (BRMS1) and Connexin 43 (Cx43) in thyroid cancer and their correlation with clinicopathologic parameters. Methods: Immunohistochemistry Streptavidin-eroxidase method was used to detect the BRMS1 and expression in 195 tissue samples, including 90 cases with thyroid carcinoma, 45 cases with thyroid adenoma, 30 cases with nodular goiter, and 30 cases with normal thyroid glands. Results: The positive rates of BRMS1 and Cx43 expression was 56.7% (/90) and 41.1% (37/90) in thyroid carcinoma, respectively, which are significantly lower than the rates in thyroid adenoma, nodular goiter, and normal thyroid gland tissues (). Of the three pathological types of thyroid cancer, the positive expression rate of Cx43 was 61.9% in papillary carcinoma, 27.8% in medullary carcinoma, 27.3% in follicular carcinoma, and 12.5% in undifferentiated carcinoma. Statistical differences in the BRMS1 expression among papillary carcinoma and the other pathological types were also noted. Unlike the patients without lymph node metastasis, the positive expression of BRMS1 and s were both significantly low among patients suffering from nodal metastasis. Subgroup analysis shows that the positive expression of BRMS1 and gradually decreased with TNM staging. In addition, a positive correlation was observed between the BRMS1 and expression (r=0.494, =0.032). Conclusion: The decreased expression of BRMS1 and s is significantly correlated with the metastasis of thyroid cancer and malignant grade. The combined detection of the two proteins can be ideal biomarkers for judging the prognosis of thyroid carcinoma. Keywords: thyroid cancer, breast cancer metastasis suppressor 1, connexin 43, immunohistochemisty 作为内分泌系统中常见的恶性肿瘤, 甲状腺癌 发病率表现出明显增高的趋势 [1] 甲状腺癌的发生 机制复杂, 其转移也涉及多基因和蛋白的相互作 用 因此, 探索同甲状腺癌复发转移相关的蛋白, 对 于患者疗效评估和预后判断意义重大 近来诸多研 究显示甲状腺癌细胞间通讯异常与甲状腺癌的转移 作者单位 : 福建医科大学教学医院, 福建省肿瘤医院头颈外科 ( 福州市 ) * 本文课题受福建省卫生厅青年科研计划 ( 编号 : ) 资助通信作者 : 刘辉 @qq.com

2 中国肿瘤临床 2015 年第 42 卷第 11 期 Chin J Clin Oncol Vol. 42. No 关系极为密切 细胞缝隙连接蛋白 43 connexin 43 为免疫反应阳性 + 免疫组织化学染色结果的鉴 tasis suppressor 1 BRMSl 广泛参与调节肿瘤细胞的 后进行统计 图 1 2 Cx43 和乳腺癌转移抑制基因 1 breast cancer metas 增殖和分化 恶性表型的进展及侵袭转移 本研 2-3 定均由本院两位病理科专业医师双盲阅片进行评分 究采用免疫组织化学 S 法检测 BRMS1 和 Cx43 蛋白 在甲状腺癌组织中的表达情况 并分析其潜在的临 床价值 材料与方法 一般资料 收集 2009 年 1 月至 2013 年 6 月间于福建省肿瘤 A B C D 医院行手术切除甲状腺石蜡组织标本 195 例 其中包 括 90 例甲状腺癌 30 例结节性甲状腺肿 45 例甲状 腺腺瘤 30 例甲状腺正常组织 来源良性病变甲状腺 次全切除的标本 90 例甲状腺癌中 男性 38 例 女 性 52 例 平均年龄 岁 组织标本收集前 均未进行放化疗或免疫治疗等治疗手段 所有标本 均为常规石蜡切片 经 HE 染色后由本院两位副高级 职称以上病理科医生对组织进行病理分型 乳头状癌42 例 滤泡癌 22 例 髓样癌 例 未分化癌 8 例 肿瘤分 期依据国际抗癌协会联盟 UICC 2002 年制定的 TNM A. Negative S 100 B. Weak positivity S 100 C. ositive S 200 D. Strong positivity S 200 图 1 BRMS1 免疫组织化学染色判断图谱 Figure 1 Immunohistochemical staining for judging the BRMS1 map 分期 Ⅰ Ⅳ期病例数分别为 和例 本研 究通过福建省肿瘤医院医学伦理委员会批准 方法 试剂和方法 实验试剂主要为兔抗人 BRMS1 单克隆抗体和 Cx43 多克隆抗体 购自美国 Santa Cruz 公司 BRMS1 和 Cx43 工作液浓度均为 免疫 组织化学 S 试剂盒和 DAB 试剂盒均购自上海长岛 A B C D 生物公司 手术切除后的组织标本 先用 10%中性福 尔马林溶液固定 然后石蜡包埋 每例标本切片厚 度约 4 μm 采用 S 法进行免疫组织化学染色 操作 步骤参考试剂盒详细说明书 分为阴性和阳性对 照 已知的乳腺癌阳性片作为阳性对照 BS 液代替 一抗作为阴性对照组 免疫组织化学判断标准 BRMS1 和 Cx43 蛋白 阳性细胞着色主要位于胞质或胞核内 显色呈淡黄 色至棕黄色 染色深浅需要清除背景着色的影响 A. Negative S 100 B. Weak positivity S 100 C. ositive S 200 D. Strong positivity S 200 图 2 Cx43 免疫组织化学染色 Figure 2 Immunohistochemical staining of Cx43 等 BRMS1 和 Cx43 蛋白结果判断将结合染色强度评 1.3 黄色及棕褐色分别记为 分 2 每张切片选择 BRMS1 蛋白表达阳性患者例数 Cx43 蛋白表达阳性 细胞表达的百分率 % <5%为 0 分 5% 25%为 1 组间比较采取χ2 检验 运用秩相关的 Spearman 方法 为 4 分 免疫组织化学结果根据染色阳性细胞百分 差异有统计学意义 分和阳性细胞率 1 无着色 或基本不着色 淡黄色 10 个高倍视野 400 各计数 100 个细胞 计算出阳性 分 26% 50%为 2 分 % 75%为 3 分 >75%以上 率和染色强度分别评分 0 分为阴性 分为弱 阳性 分为中等阳性 ++ >6 分为强阳性 +++ 染色强度与阳性细胞百分比的乘积>1 分计 统计学方法 采用 SSS 16.0 统计学软件进行实验数据分析 患者例数在不同组织中的比较为计数资料 组内及 分析 BRMS1 和 Cx43 蛋白表达的相关性 <0.05 为 结果 BRMS1 和 Cx43 蛋白在甲状腺癌 腺瘤 甲状腺 肿及正常组织中的表达

3 552 免疫组织化学染色结果提示 BRMS1 和 Cx43 主要分布于胞质和胞核, 呈弥漫性分布 ( 表 1):BRMS1 蛋白的表达在甲状腺癌组织 甲状腺腺瘤组织 结节性甲状腺肿组织及正常组织中均有显著性差异 (χ 2 =32.191,) 在甲状腺癌组织中 BRMS1 蛋白的阳性表达率为 56.7%(/90), 显著低于腺瘤 (χ 2 =14.178,) 结节性甲状腺肿 (χ 2 =10.989, =0.001) 和正常组织 (χ 2 =16.200,) Cx43 蛋白的表达在甲状腺癌组织 甲状腺腺瘤组织 结节性甲状腺肿组织及正常组织中也均有显著性差异 (χ 2 =58.658,), 且 Cx43 蛋白在甲状腺癌组织中的阳性表达率为 41.1%(37/90), 同样显著低于腺瘤 (χ 2 =21.815,) 结节性甲状腺肿 (χ 2 =24.714, ) 和正常组织 (χ 2 =31.642,, 表 1) 2.2 甲状腺癌 BRMS1 和 Cx43 蛋白的表达与临床病理因素的关系相比于无淋巴结转移的甲状腺癌患者, 有淋巴结转移的癌组织中 BRMS1 Cx43 蛋白阳性表达率均显著下降 (BRMS1:33.3% vs. 77.1%;Cx43:26.2% vs. 54.2%), 差异有统计学意义 ( 均, 表 2) Cx43 蛋白在乳头状癌 髓样癌 滤泡状癌以及未分化癌组织中的表达率分别为 61.9% 27.8% 27.3% 和 12.5%, 差异有统计学意义 ( 均 <0.05), 而 BRMS1 的表达在 不同病理类型癌组织中却未见显著性差异 本研究 同时发现肿瘤 TNM 分期和 BRMS1 蛋白间关系紧密, 而与 Cx43 蛋白中关系不大 进一步亚组分析显示 BRMS1 的阳性表达率随着肿瘤 TNM 分期 (Ⅰ~Ⅳ 期 ) 的提高有明显的下降趋势, 而在 Cx43 蛋白中却未观 察到这一趋势 ( 表 3) 表 1 BRMS1 和 Cx43 蛋白在甲状腺癌 腺瘤 甲状腺肿及正常 组织中的表达 例 (%) Table 1 BRMS1 and expression in thyroid carcinoma,adeno ma,goiter,and normal tissues Tissue types n Thyroid carcinoma 90 (56.7) 37(41.1) Adenoma 45 40(88.9) 38(84.4) Goiter 30 27(90.0) 28(93.3) Normal tissue 30 29(96.7) 30(100.0) 2.3 BRMS1 和 Cx43 蛋白表达的相关性分析 90 例甲状腺癌患者中,BRMS1 和 Cx43 蛋白表达均为阳性 21 例, 均为阴性 23 例 ;BRMS1 阳性但 Cx43 阴性 30 例,BRMS1 阴性但 Cx43 阳性 16 例 Spearman 相关性分析显示这两种蛋白表达呈正相关 (r=0.494, =0.032, 表 4) 表 2 BRMS1 和 Cx43 蛋白表达与甲状腺癌临床病理因素的关系例 (%) Table 2 Relationship of the Cx43 and BRMS1 expression with clinicopathologic factors of thyroid cancer Clinical pathology n Gender Male 38 21(55.3) 20(52.6) Female 52 30(57.7) 17(32.7) Age(years) (58.8) 22(43.1) > (53.8) 15(38.5) Histological types apillary carcinoma 42 25(59.5) 26(61.9) Follicular carcinoma 22 12(54.5) 6(27.3) Medullary carcinoma 11(61.1) 5(27.8) Anaplastic carcinoma 8 3(37.5) 1(12.5) Tumor diameter(cm) (60.4) (41.9) > (53.2) 19(40.4) Lymph node metastasis Yes 42 14(33.3) 11(26.2) No 48 37(77.1) 26(54.2) TNM staging Ⅰ+Ⅱ 41 29(70.7) 17(41.5) Ⅲ+Ⅳ 49 22(44.9) 20(40.8)

4 553 表 3 BRMS1 和 Cx43 蛋白表达与肿瘤分期的关系 Table 3 Relationship of the BRMS1 and Cx43 expression with tumor staging TNM staging Total number of cases Number of positive cases ositive rate(%) Number of positive cases ositive rate(%) Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Total χ 表 4 Table 4 BRMS1 和 Cx43 蛋白表达的相关性分析 Correlation analysis of BRMS1 and Cx43 expression Number of positive cases Number of negative cases Total 2.4 BRMS1 和 Cx43 蛋白表达与肿瘤复发 90 例甲状腺癌患者的随访采用电话随访或门诊 随访, 随访截至 2015 年 3 月 ( 其中失访或临床资料不 完整 11 例 ) 在完成随访的 79 例患者中,3 年生存率 为 97.5%(77/79), 无复发生存率为 89.9%(71/79) BRMS1 蛋白阳性和阴性患者 3 年无复发生存率分别 为 100.0%(45/45) 和 76.5%(26/34) Cx43 蛋白阳性 和阴性患者 3 年无复发生存率分别为 90.6%(29/32) 和 89.4%(42/47) 复发的 8 例患者 BRMS1 蛋白全部 阴性表达, 而 Cx43 蛋白阳性 阴性表达的分别为 3 例 和 5 例 3 讨论 Number of Number of Total positive cases negative cases 作为细胞间一种普遍存在的通讯方式, 细胞缝 隙连接 (gap junction,gj) 广泛参与调节细胞增殖分 化 凋亡及内环境的稳定等生物学行为 近年来新 发现的 Cx43 是人体内重要的细胞缝隙连接蛋白, 研 究已证实许多恶性肿瘤的发生发展 浸润转移与 Cx43 基因表达异常所导致的细胞间隙连接通讯 (gap junctional intercellular communication,gjic) 功 [4] [5] 能改变有关 有研究发现 Cx43 蛋白可作为乳腺 癌早期诊断较好的标记物, 其表达水平改变可反映 [6] 乳腺恶性肿瘤的浸润进展 李国等发现肺腺癌中 Cx43 蛋白和基因表达水平的差异与癌组织病理类 型 淋巴结有无转移及肿瘤分期密切相关, 可能是 影响肺腺癌患者预后的重要分子指标之一 王化 r [7] 修等发现 Cx43 在鼻咽癌的癌前病变组织中的表达 [8] 明显下调 高飞等同样发现骨肉瘤组织中 Cx43 蛋 白的低表达 甲状腺癌细胞的凋亡 迁徙转移等生物学特性 [9] 和细胞间隙连接通讯关系密切 Jensen 等发现通 过上调 Cx43 在甲状腺癌细胞中的表达, 会显著提高 该细胞对肿瘤坏死因子的反应性, 从而促进癌细胞 [10] 凋亡 Leithe 等认为甲状腺癌细胞逃避胸苷激酶 介导的旁观者杀伤效应的分子机制与 Cx43 表达改变 引起的 GJIC 受损有关 本研究通过免疫组织化学技 术观察发现甲状腺癌组织中 Cx43 蛋白表达水平显著 下降, 且其表达差异同淋巴结有无转移及组织病理 分型显著相关 同样观察到, 不同病理类型的甲状 腺癌组织中 Cx43 蛋白表达水平 强度差异一定程度 上提示甲状腺癌中细胞缝隙连接通讯功能的下降, 促进了异常的上皮细胞的增殖分化, 使得细胞出现 恶性表型, 从而导致甲状腺癌的发生发展, 甚至浸润 转移 影响恶性肿瘤细胞浸润转移的因素除了细胞缝 隙连接蛋白表达改变之外, 还与肿瘤转移相关基因 的异常表达密切相关 BRMS1 基因是最开始在研究 乳腺癌的转移机制时发现 [11], 近年研究提示该基因 在存在转移的其他恶性肿瘤组织中也显著低表达或 [12] [13] 表达缺失, 如前列腺癌 胃癌等 BRMS1 抑制 肿瘤转移的机制涉及多种途径, 其中重要的途径之 [14] 一为恢复细胞间缝隙连接通讯 Saunders 等通过 上调 BRMS1 在具有转移潜能的人乳腺癌细胞株 MDA-MB-435 发现, 细胞连接蛋白 Cx43 表达水平也 显著升高, 细胞间的缝隙连接通讯恢复正常, 从而 使得乳腺癌细胞的表型趋向于正常乳腺组织 李 [15] 晓瑜等发现喉癌中 Cx43 下调的患者容易发生颈部 淋巴结转移, 或许与 BRMS1 抑制转移有关 为验证甲状腺癌组织中 Cx43 蛋白的表达是否与 BRMS1 表达有一定的相关性, 本研究同时检测了癌

5 554 组织中 BRMS1 蛋白的表达 结果显示癌组织中 BRMS1 表达水平同样显著下降, 表达差异与淋巴结转移和 TNM 分期等临床因素相关, 结合患者的生存资料同样观察到 BRMS1 蛋白水平和甲状腺癌患者的复发转移间有一定的相关性 另外, 本研究还观察到甲状腺癌组织中 BRMS1 和 Cx43 蛋白表达呈一定的正相关, 或许提示其除在调节甲状腺癌细胞间缝隙连接及其恶性表型的转变中扮演重要角色外, 同样共同参与和调节了癌细胞的浸润转移 目前鲜见对甲状腺癌组织中 BRMS1 和 Cx43 临床价值的研究, 本研究为进一步明确甲状腺癌转移的分子机制及其后期患者诊治 预后判断提供了有力的依据 综上所述,BRMS1 和 Cx43 不仅参与甲状腺癌的发生发展, 同样参与调节癌细胞转移的进程 联合检测甲状腺癌组织中这两种基因的表达水平有望成为甲状腺癌诊治新靶点及其预后判断的分子标记物 为进一步明确 BRMS1 和 Cx43 在甲状腺癌转移中的作用机制, 本研究后期或将考虑从细胞层面对其进行验证 参考文献 [1] Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics[j]. CA Cancer J Clin, 2011, 61(2): [2] Wu ZY, Chen B. BRMS1 in the breast cancer tissue and the ex pression of VEGF- C protein and significance[j]. ractical Medi cal Journal, 2011, 27(4): [ 吴作友, 陈斌. 乳腺癌组织中 BRMS1 和 VEGF-C 蛋白的表达及意义 [J]. 实用医学杂志,2011, 27(4): ] [3] Hu L, Liu ZX, Bai ZM, et al. Expressions of Cx26, Cx32 and Cx43 in prostate cancer and their implications[j]. Zhonghua Nan Ke Xue, 2014, 20(1): [4] lante I, Stewart MK. Cx43 suppresses mammary tumor metasta sis to the lung in a Cx43 mutant mouse model of human disease [J]. Oncogene, 2011, 30(14): [5] Kańczuga-Koda L, Sulkowska M, Koda M, et al. Expression of connexin 43 in breast cancer in comparison with mammary dys plasia and the normal mammary gland[j]. Folia Morphol (Warsz), 2003, 62(4): [6] Li G, Wang JL, Chen W, et al. Expression of Cx43 in human lung adenocarcinoma and its signifance[j]. Cancer Research and Clinic, 2013, 25(5): [ 李国, 王建利, 陈武, 等. 间隙连接蛋白 Cx43 基因在肺腺癌中的表达及意义 [J]. 肿瘤研究与临床, 2013,25(5): ] [7] Wang HX, Tian DF. The expression of Cx43 and Cx32, Cx26 changes of Nasopharyngeal carcinoma precancerous nasopharyn geal mucosa epithelial tissue in mice[j]. Shandong medicine, 2015, 55(2):29-31.[ 王化修, 田道法. 鼻咽癌癌前病变小鼠鼻咽粘膜上皮组织 CX43 CX32 CX26 的表达变化 [J]. 山东医药,2015,55(2): ] [8] Gao F, Li W, Yu MK, et al. Expression of BRMS1 gene in pros tate cancer and its clinical significance[j]. Shandong medicine, 2015, 55(2):29-31.[ 高飞, 李伟, 于明克, 等. 细胞间隙连接蛋白 43 增殖细胞核抗原在骨肉瘤组织中的表达及临床意义 [J]. 山东医药,2015,55(2):29-31.] [9] Jensen K, atel A, Klubo-Gwiezdzinska J, et al. Inhibition of gap junction transfer sensitizes thyroid cancer cells to anoikis[j]. En docr Relat Cancer, 2011, (5): [10] Leithe E, Kjenseth A, Bruun J, et al. Inhibition of connexin 43 gap junction channels by the endocrine disruptor ioxynil[j]. Toxi col Appl harmacol, 2010, 247(1): [11] Seraj MJ, Samant RS, Verderame MF, et al. Functional evidence for a novel human breast carcinoma metastasis suppressor, BRMS1, encoded at chromosome 11q13[J]. Cancer Res, 2000, 60 (11): [12] Shi BT, Zheng A, Jiang N, et al. Expression of BRMS1 gene in prostate cancer and its clinical significance[j]. Chinese Journal of Andrology, 2013,27(12):3-6.[ 史本涛, 郑爱萍, 姜妮, 等.BRMS1 基因在前列腺癌组织中的表达及临床意义 [J]. 中国男科学杂志, 2013,27(12):3-6.] [13] Zhigang J, Xiaoping C, Zhengrong L, et al. Effect of breast-can cer metastasis suppressor 1(BRMS1) on growth and metastasis of human gastric cancer cells in vivo[j]. Chinese-German Journal of Clinical Oncology, 2012, 11(10): [14] Saunders MM, Seraj MJ, Li Z, et al. Breast cancer metastatic po tential correlates with a breakdown in homospecific and hetero specific gap junctional intercellular communication[j]. Cancer Res, 2001, 61(5): ] [15] Li XY, Guo X, Li XT, et al. Expression of gene BRMS1protein in supra- glottic laryngeal carcinoma and its clinical significance [J]. J Otolaryngol Ophthal Shandong Univ, 2007, 21(6): [ 李晓瑜, 郭星, 李笑天, 等.BRMS1 基因蛋白在声门上型喉癌中的表达及临床意义 [J]. 山东大学耳鼻咽喉学报,2007,21(6): ] ( 收稿 ) ( 修回 ) ( 编辑 : 邢颖 ) 作者简介吴宇专业方向为头颈肿瘤外科治疗 @qq.com

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