肿瘤精准医学是精确诊断与靶向治疗的结合精确诊断靶向治疗分子靶点 EGFR ALK Met FGFR1 HER-2 药物吉非替尼厄洛替尼埃克替尼阿法替尼 CO-1686, AZD9291 克唑替尼 Alectinib Tivantinib(ARQ197), Onartuzumab(Met

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唯颜
5 years ago
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1 液体活检和二代测序带来的若干思考主讲人 : 陈鸣第三军医大学大坪医院

XL999 阿法替尼 RET/ROS 融合基因克唑替尼, AP 26113, ASP 3026 RAS/MAPK 通路 PI3K/PTEN/AKT PD-1/PDL-1 HSP 90.

2 肿瘤精准医学是精确诊断与靶向治疗的结合精确诊断靶向治疗分子靶点 EGFR ALK Met FGFR1 HER-2 药物吉非替尼厄洛替尼埃克替尼阿法替尼 CO-1686, AZD9291 克唑替尼 Alectinib Tivantinib(ARQ197), Onartuzumab(MetMab) Cabozantinib(XL184) Nintedanib, XL999 阿法替尼 RET/ROS 融合基因克唑替尼, AP 26113, ASP 3026 RAS/MAPK 通路 PI3K/PTEN/AKT PD-1/PDL-1 HSP 90.. Trametinib(GSK ), Pimastertib,Refametinib, TAK733 BEZ235, XL-765 Nivolumab,MPDL3280A Ganetespib

3 肿瘤个体化用药检测 NCCN 指南对肺癌基因变异的治疗推荐 247 基因 200 余种药物

4 未来 5 年内靶向临床药物的选择将会有一个爆炸性的增长 Explosive Growth for Targets Therapies Expected in Next 5 Years FDA 统计于 2012 年

5 仅根据初诊时标本指导后续治疗可能产生偏歧 Annu Rev Pathol. 2013;8:

6 再次肿瘤活检对进展期肿瘤至关重要 NEJM: 四次活检带来 ALK 阳性长期生存再次肿瘤活检 (RTB) 对进展期肺癌患者有重要临床意义 : 克利夫兰临床试验 (n=184) RTB:repeated tumor biopsy N Engl J Med. 2016;374(1):54-61

7 个体化治疗依赖于实时样本提供分子遗传学信息第三军医大学第三附属医院同一患者的疾病不同部位分子遗传信息存在差异 N Engl J Med Mar 8;366(10):883-92

8 2015 年十大突破技术 -- 液态活检技术 MIT Technology Review 杂志发布了 2015 年度十大突破技术 (10 Breakthrough Technologies 2015) 的榜单液态活检技术光荣上榜液态活检 : 快速简便无痛苦无创伤的癌症血液检测方法

9 传统而又崭新的检测技术 -- 液态活检 A liquid biopsy is a liquid biomarker that can be easily isolated from many body fluids (blood, saliva, urine, ascites, pleural effusion, etc.) and, as well as a tissue biopsy, a representative of the tissue from which it is spread. -- Christian Rolfo, Biochimica Biophysica Acta, 2013.

10 液体活检途径 ctdna AutoAntibody 由肿瘤细胞释放到血液的循环 DNA 液体活检由肿瘤免疫监视产生肿瘤免疫自身抗体 CTC 从实体瘤中脱离出来并进入血液的循环肿瘤细胞 Exosome 肿瘤细胞脱落的囊泡, 携带肿瘤 RNA DNA 与蛋白等信息

11 Cancer Res. 2001;61(4): 第三军医大学第三附属医院循环细胞游离 DNA

循环肿瘤 DNA(Circulating Tumor DNA, ctdna) 肿瘤细胞 DNA 脱落或细胞坏死凋亡后释放进入循环系统的游离 DNA 1977-LEON,S.A.et.al.free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy.cancer Res.37;646-650 1989-STROUN,M.

12 循环肿瘤 DNA(Circulating Tumor DNA, ctdna) 肿瘤细胞 DNA 脱落或细胞坏死凋亡后释放进入循环系统的游离 DNA 1977-LEON,S.A.et.al.free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy.cancer Res.37; STROUN,M.et.al.Neoplastic characte ristics of the DNA found in the plasma of ca ncer patient.oncology 46; Dich F,et.al.Detection and quantificati on of mutation in the plasma of patiens with colorectal tumor Proc Natl Acad Sci USA 10 2; Dichl F,Schmidt K,Choti MA,Romans K,Goodman S,Li M,et.al.Circulating mutant DNA to asscss tumor dynamics Nature medi cine ,

13 Mutations are highly specific Pre-Cancer cell Cancer cell Normal cell Mutations No Mutations 携带有实体肿瘤细胞基因突变 / 变异甲基化微卫星序列等信息更能反应肿瘤的异质性, 更全面实时的反应肿瘤信息

ctdna 性质含量低 (<1.0% 总 cfdna) 片段短 (180-200bp) Nat Med. 2008 Sep; 14(9): 985 990 PNAS.

14 ctdna 性质含量低 (<1.0% 总 cfdna) 片段短 ( bp) Nat Med Sep; 14(9): PNAS (11):E 半衰期短 (~2 小时 ) ctdna 的检测对痕量核酸检测技术提出全新的挑战!! Nat Med Sep; 14(9):

15 基因检测技术的发展不断适应临床需求

16 测序技术的发展第一代 HiSeq 2500/3000/4000/X NextSeq 500/550 MiSeq MiniSeq 第二代 Pacific 单分子测序仪第三代 ABI 3730xl Roche 454 ion torrent Oxford Nanopore ABI solid

17 NGS 技术特点多线程高通量边合成边测序

18 单人全基因组测序成本 ( 美金 ): HGP: 测序成本迅速下降, 超过了摩尔定律 Cost is Decreasing Exponentially, Beating Moore s Law $3 Billion 2004: $30,000, : $100, : $10, : $4, : $1,000???: $100 18

19 测序是一种强大的方法学工具特定酶切 - 测序 Nucleosome Mapping( 核小体 ) 甲基化测序 ChIP-Seq( 基因 - 蛋白互作 ) 非编码 RNA

20 目前高通量测序大量应用于国内外临床癌症研究 2013 年 NEJM 发表的临床文献,43% 运用高通量技术

21 NGS 在 ctdna 检测中的应用技术检出限检测区域技术特点 Sanger >10% 全基因序列双脱氧链终止法 qpcr 1% 已知位点荧光素标记 ARMS PCR 0.1% 已知位点扩增阻滞突变数字 PCR 0.1% 或更低已知位点微滴 PCR 反应 NGS 0.1%-1% 全基因序列 SBS/ 半导体测序

22 基因的突变类型多种多样, 单位点检测漏掉大量信息突变类型单碱基突变 (KRAS G12D) 小范围碱基缺失 / 插入 (KIT V559del) 大范围碱基缺失 / 插入 (EGFR 19 外显子 ) 基因扩增 / 表达变化 (ERBB2/HER2 扩增 ) 基因融合 (EML4-ALK 融合 ) 现常用检测方法 PCR+ 桑格测序 PCR+ 桑格测序 ARMS PCR 荧光定量 PCR, FISH FISH 高通量测序可以一次检测上面列举的所有突变类型人类基因组结构变化示图 : 基因突变类型多种多样

23 NGS 已成为 NCCN 推荐技术

24 ctdna 检测的临床应用 Sci Transl Med Feb 19;6(224):224ra24

25 ctdna 应用早期诊断

26 ctdna 应用早期诊断 Sci Transl Med 6, 224ra24 (2014)

27 ctdna 应用早期诊断 Clinical validation of the detection of KRAS and BRAF mutations from circulating tumor DNA Nature med. 2014; 20(4):

28 ctdna 应用微小残留病灶 What is Minimal Residual Disease(MRD)?

29 ctdna 应用微小残留病灶 Before Surgery Day 0 After Surgery Day 1 CT scan negative After Surgery Day 42 CT scan positive After Surgery Day 244 Wild-type fragments Mutant fragments Nat Med Sep;14(9):985-90

30 ctdna 应用病情监测与肿瘤标志物检测相比,ctDNA 检测更能反映病情的进展某些病例里,ctDNA 检测与病情更一致 ; 某些病例里,CTC 检测与病情进展更一致

31 ctdna 应用耐药突变检测突变率治疗前 EGFRL858R 95% BRAF V600E ~6% 获得耐药性后 EGFR T790M ~14% BRAF V600E 60% 在人类 H3255NSCLC 细胞株 ( 携带 EGFR L858R, 但无 BRAF V600E, 对厄洛替尼敏感 ) 中, BRAF V600E 的过表达会导致耐药性的产生 BRAF V600E 介导的厄洛替尼耐药可通过 BRAF 抑制剂 Vemurafenib 逆转结论 : EGFR 突变 NSCLC 可包含额外 BRAF 致癌驱动突变且在治疗前发生率低 EGFR TKI 治疗可以导致 BRAF V600E 表达肿瘤细胞扩增, 产生获得性 EGFR TKI 耐药, 而 BRAF 抑制剂治疗后可逆转

32 ctdna 检测的临床应用易瑞沙 (Iressa) 血液 ctdna 伴随诊断获欧盟批准 2014 年 9 月, 欧洲药品管理局 (EMA) 已批准易瑞沙 (Iressa) 标签 II 型变化更新, 使 ctdna 检测方法成为医生评估 EGFR 突变状态的重要方法之一, 该方法的使用能鉴别出最可能从易瑞沙治疗中受益的患者群体易瑞沙 (Iressa) 血液 ctdna 检测获 CFDA 批准 CFDA 在 2015 年 2 月已批准吉非替尼说明书进行更新, 在推荐所有 NSCLC 患者的肿瘤组织都应进行 EGFR 突变检测基础上, 补充了如果肿瘤标本不可评估, 则可使用从血液 ( 血浆 ) 标本中获得的 ctdna 进行评估

33 液体活检面临的挑战 Not all clonal events are cancer

34 Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin

35 液体活检面临的挑战临床监管临床前必须建立严格的数据质量评价体系和数据分析流程既保证结果准确可靠建立统一的行业标准, 以保证分析和临床的需要中国人数据库 CGP TCGA ICGC 以西方人群为主, 分析主要依赖于西方人群数据库, 直接用于中国人会有偏差缺乏中国人自己权威标准的数据库技术复杂大数据技术应用, 数据储存传输设备技术复杂推广普及复杂针对性肿瘤检测 panel 的研发数据分析海量数据, 如何寻找关键突变是挑战之一 ( 数据产出 > 数据分析 > 数据解读 ) 数据类型复杂数据量庞大应用面多样临床意义确定如何精准地发现临床应对的的变异更好用于早发现早诊断早治疗肿瘤机理复杂, 已知 marker 有限, 再加上肿瘤异质性

36 中国首个 NGS 共识肺癌领域二代测序 (NGS) 技术应用于临床肿瘤精准医学诊断的共识

37 我们准备好了吗? ----NGS 在液体活检中的应用 NGS 技术理论与实验培训 NGS 数据分析培训个体化检测 Panel: 基础方案标准方案全面方案基础科学研究 :70-80% 意义未名突变检测 + 分析人员配置实验室空间改造 Panel 制定实验流程控制科研点实验室物理分区 ( 试剂准备区标本制备区 PCR 扩增与文库构建区文库检测区测序区及电泳区 ) 质量控制结果解释

东吴证券研究所

东吴证券研究所证券研究报告公司研究基因测序行业基因测序行业分析这里的黎明静悄悄行业评级 ( 看好 ) 报告摘要 : 基因测序行业蓄势待发 : 近几年基因测序市场飞速发展, 尤其是二代测序技术高通量, 高准确率, 低成本等优点让其得到更广泛的

肿瘤精准医学是精确诊断与靶向治疗的结合 精确诊断 靶向治疗 分子靶点 EGFR ALK Met FGFR1 HER-2 药物 吉非替尼 厄洛替尼 埃克替尼 阿法替尼 CO-1686, AZD9291 克唑替尼 Alectinib Tivantinib(ARQ197), Onartuzumab(Met

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