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1 中国肿瘤临床 06 年第 43 卷第 6 期 Chin J Clin Oncol 06. Vol. 43. No 临床研究与应用 EB 病毒阳性的胃弥漫大 B 细胞淋巴瘤特点及预后 刘琳 高子芬 李敏 刘校龙 刘翠苓 李艳 摘要目的 : 探讨 EB 病毒阳性患者的胃弥漫大 B 细胞淋巴瘤 (diffuse large B-cell lymphoma,dlbcl) 病理学特点及预后 方法 : 回顾性分析北京大学基础医学院病理学系 009 年 月至 05 年 月 75 例胃弥漫大 B 细胞淋巴瘤患者的临床资料,5 例 EB 病毒 (Epstein-Barr virus,ebv) 阳性者为病例组,60 例 EBV 阴性者为对照组, 采用免疫组织化学法和 EB 病毒 RNA 探针原位杂交法检测 Bcl- c-myc 蛋白表达及 EBV-EBER 情况, 分析 EBV 阳性的胃 DLBCL 患者的病理学特点及预后 结果 :EBV 阳性组在临床表现 年龄 性别 起源 细胞形态等方面与 EBV 阴性组相比, 差异无统计学意义 (P>0.05); 在 Bcl- c-myc 蛋白表达方面,EBV 阳性组与 EBV 阴性组相比, 差异无统计学意义 (P>0.05);R-CHOP 方案治疗下,EBV 阳性组与 EBV 阴性组相比, 中位总生存期 (median overall survival,os) 分别为 5. 个月和 3.4 个月, 差异具有统计学意义 (P=0.0) 结论: 发生于胃 DLBCL 患者中,EB 病毒感染对临床表现 瘤细胞的起源 形态 蛋白表达等方面无明显影响 ;EB 病毒阳性的 DLBCL 患者并不局限于老年人 ;R-CHOP 治疗下 EB 病毒阳性患者的预后比 EB 病毒阴性的患者预后差 关键词弥漫大 B 细胞淋巴瘤胃肿瘤 EB 病毒预后 doi:0.3969/j.issn Characteristics and prognosis of EBV-positive gastric diffuse large B-cell lymphoma Lin LIU, Zifen GAO, Min LI, Xiaolong LIU, Cuiling LIU, Yan LI Correspondence to: Yan LI; liyan@medmail.com.cn Department of Hematology, The First Hospital Affiliated to China Medical University, Shenyang 0000, China; Department of Pathology, School of Basic Medical Science, Peking University, Beijing 00000, China Abstract Objective: To investigate pathological characteristics and prognosis of patients with Epstein-Barr virus (EBV) positive gastric diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL). Methods: Through retrospective study, we collected 75 cases of patients with DLBCL that occurs in the stomach. The patients were divided into two groups consisting of 60 cases of EBV negative control group and 5 cases of EBV positive group. To analyze the pathological characteristics and prognosis of patients with EBV positive gastric DLBCL, immunohistochemical and Epstein-Barr encoding region (EBER) in situ hybridization methods were used to detect Bcl-, c-myc protein expression, and EBV-encoded RNA (EBER). Results: In certain aspects of clinical manifestations, such as age, gender, and origin, the comparison between EBV-positive and EBV-negative groups had no statistically significant difference. The same results were obtained for Bcl- and c- myc protein expression. However, a statistically significant difference (P=0.0) was observed under the R-CHOP regimen where the median overall survival (OS) of the EBV- positive and EBV- negative groups were 5. and 3.4 months, respectively. Conclusion: In patients with DLBCL of the stomach, the EBV infection had no obvious effects in terms of clinical manifestation, origin, morphology, and protein expression of tumor cells. EBV-positive DLBCL was not limited to elderly patients. Under the R-CHOP regimen, the prognosis of EBV-positive patients was worse than that of EBV-negative patients. Keywords: diffuse large B-cell lymphoma, gastric neoplasms, Epstein-Barr virus, prognosis 弥漫性大 B 细胞淋巴瘤 (diffuse large B-cell lym phoma,dlbcl) 是非霍奇金淋巴瘤中最常见的类型, 大多有很强的侵袭性, 预后不佳 胃肠道是最常见的结外发生部位, 占肠道淋巴瘤的 6.6% [-] 胃的 [3] DLBCL 在起源 治疗 预后方面存在争议, 所以研究胃 DLBCL 的特点尤为重要 近年来, 研究提示 EB 病毒 (Epstein-Barr virus,ebv) 感染可能对 DLBCL 的发 [4-5] 生 蛋白表达 基因异常及预后存在一定影响, 所 以本研究通过比较 EBV 阳性和 EBV 阴性的胃 DLBCL 患者的临床表现 年龄 性别 瘤细胞起源 蛋白表达 增殖指数 总生存时间等的差异, 分析 EBV 感染对胃 DLBCL 的影响 材料与方法. 临床资料回顾性分析北京大学基础医学院病理学系 009 年 月至 05 年 月 75 例胃 DLBCL 患者的临床资 作者单位 : 中国医科大学附属第一医院血液科 ( 沈阳市 0000); 北京大学基础医学院病理学系 通信作者 : 李艳 liyan@medmail.com.cn

2 56 中国肿瘤临床 06 年第 43 卷第 6 期 Chin J Clin Oncol 06. Vol. 43. No. 6 料,EBV 阳性者 5 例为病例组,EBV 阴性者 60 例为对照组 依据 008 年 WHO 造血与淋巴组织肿瘤分类标准, 至少由 位血液病理学专家进行诊断或复核, 均明确诊断为胃 DLBCL 30 例经标准 R-CHOP 方案治疗的患者经过 3~67 个月的随访, 中位随访时间 8 个月 本研究经过被研究对象或其家属知情同意及符合人体试验委员会所制定的伦理学标准并得到伦理委员会批准. 方法.. 研究方法采用 EnVision 二步法,3~5 μm 厚组织置于 APES 胶片上, 经过烤片, 二甲苯脱蜡, 梯度酒精脱水,3% 双氧水封闭,Tris-EDTA 修复液 (ph= 9.0) 高压修复,TBS 洗后加入一抗 (CD0 CD79a PAX5 CD3ε Ki- 67 CD0 Bcl- 6 Bcl- c- myc GCET- FOXP- Mum-),37.0 孵育 h,tbs 洗后加入兔 / 鼠通用二抗 37.0 孵育 40 min,dab 显色后, Mayer 苏木素复染, 脱水 透明 封片 严格按 EBV-EBER 探针试剂盒说明书进行原位杂交,3~5 μm 厚组织脱蜡 脱水后蛋白酶 K 消化 0 min,00% 乙醇干燥, 加入 EBER 探针杂交液, 贴封口膜,37.0 孵育 3 h,tbs 洗后揭膜, 加入辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase,hrp),37.0 孵育 40 min, DAB 显色, 甲基绿复染对比染色 所用抗体 Dako 购自上海拜力生物科技有限公司,EBV-EBER 探针购自北京中杉金桥生物技术有限公司,TBS 与苏木素均购自北京天合立恩生物科技有限公司.. 结果判读 CD0 CD0 均为细胞膜阳性, CD79a 为胞膜及胞质阳性,Ki- 67 Bcl- 6 c- myc FOXP- Mum- PAX5 均为细胞核阳性,CD3ε GCET- Bcl- 均为细胞质阳性 ;c-myc 阳性标准为 40%,Bcl- 阳性标准为 70% [6-7], 判断是否为双重表达淋巴瘤时也按此标准判定 EBV-EBER 原位杂交中, 以瘤细胞核内出现棕褐色颗粒为阳性信号 EBER 阳性标准为 0% [5,8] 阳性对照采用 EBER 阳性的鼻型 NK/T 细胞淋巴瘤的病例.3 统计学方法采用 SPSS 7.0 软件进行统计学分析 计数资料采用 χ 检验及 Fisher 确切概率法 ; 数值的比较采用独立样本 t 检验 ; 应用 Kaplan-Meier 描述生存曲线, 采用 Log-rank 检验比较生存曲线差异 以 P<0.05 为差异具有统计学意义 结果. EBV 阳性的 DLBCL 临床及病理学特点本研究所有患者均无明确的免疫缺陷病史, 均无黏膜相关淋巴组织结外边缘区 B 细胞淋巴瘤 (ex tranodal marginal zone lymphoma of mucosa-associated lymphoid tissue,maltoma) 病史, 因不同程度的胃痛或胃胀就诊 在年龄 50 岁和年龄 <50 岁 性别 B 症状上将两组进行比较, 差异无统计学意义 (P>0.05), 由于多数患者消瘦是由于胃部不适 食欲不佳所致, 故本研究将有无盗汗 发热 ( 体温超过 38.0 ) 为判断有无 B 症状的标准 ; 在形态方面, 两组从肿瘤细胞起源 (Choi 模型 ) 瘤细胞形态 是否伴有坏死 腺体破坏 MALToma 成分方面进行比较, 差异无统计学意义 (P>0.05, 表 ) 表 EBV 阳性与 EBV 阴性组临床及病理学特点比较 Table Comparison of clinical and pathological characteristics between EBV-positive and EBV-negative groups Group Age (years) <50 >50 Gender Male Female B symptoms With B Without B Origin GCB Non-GCB MALT With MALT Without MALT Necrosis With necrosis Without necrosis Morphology Polymorphism Monomorphism Acinar destruction With destruction Without destruction *Fisher exact probability n=5 5 (33.3) 0 (66.7) 9 (60.0) 6 (40.0) 3 (0.0) (80.0) (3.3) 3 (86.7) (6.7) 4 (93.3) 8 (53.3) 7 (46.7) (6.7) 4 (93.3) 5 (33.3) 0 (66.7) n=60 5 (5.0) 45 (75.0) 9 (48.3) 3 (5.7) 8 (3.3) 5 (86.7) 7 (8.3) 43 (7.7) 5 (8.3) 55 (9.7) 6 (43.3) 34 (56.7) (8.3) 49 (8.7) 3 (.7) 47 (78.3). 胃 DLBCL 中 EBV 阳性与 EBV 阴性的 Bcl- c-myc 表达情况的比较全部病例均经免疫组织化学法及 RNA 原位杂交法检测 Bcl- c-myc EBV-EBER 的表达情况, 见图 分别分析了 Bcl- c-myc 单独表达 双重表达的 [6-7] 情况, 阳性标准按以往文献中的标准判读 EBV 阳性组 Bcl- c-myc 的单独表达与 EBV 阴性组相比, χ P * * 0.344

3 中国肿瘤临床 06 年第 43 卷第 6 期 Chin J Clin Oncol 06. Vol. 43. No 差异无统计学意义 P>0.05 近年来 在 DLBCL 患 本研究对 75 例患者中 30 例经标准 R-CHOP 方案治 为避免偏倚及节约经费 首先选用免疫组织化学法 治疗方法 如 CHOP 化疗 手术切除 中医疗法 EBV 时 EBV 阳性组与 EBV 阴性组相比 差异无统计学意 个月 EBV 阳性组中位 OS 明显短于 EBV 阴性组中位 者中 研究越来越关注双重打击淋巴瘤的诊治 所以 初步分析双表达的情况 在 c-myc 和 Bcl- 同时表达 义 P>0.05 表 疗的患者成功进行了随访 其余患者或选用了其他 阳性组和 EBV 阴性组中位 OS 分别为 5. 个月和 3.4 OS P=0.0 见图 为了排除年龄的影响 本研究 又将年龄 50 岁的患者分为老年组 年龄<50 岁的 患者为年轻组 分别进行了分析 老年组中 EBV 阳 性组中位 OS 和 EBV 阴性组中位 OS 分别为 7.8 个月 和 30.4 个月 差异无统计学意义 P=0. 年轻组 中 EBV 阳性组中位 OS 和 EBV 阴性组中位 OS 分别为 A B A. EBV-EBER expression in EBER- positive gastric DLBCL patients (RNA 8.5 个月和 33.7 个月 EBV 阳性组中位 OS 短于 EBV 阴 性组中位 OS 差异具有统计学意义 P=0.0.0 protein expression in gastric DLBCL patients; C. c- myc protein expression in gastric DLBCL patients C 图 EBER 阳 性 的 胃 DLBCL 患 者 的 Bcl- c- myc EBER 的 表 达 SP 400 Figure Cumulative survival rate probe in situ hybridization); B. Bcl- Expression of Bcl-, c-myc, and EBER in EBER-positive gastric DLBCL patients (SP 400) 表 0 EBV 阳性组与 EBV 阴性组 Bcl- c-myc 表达情况的比较 Table Comparison of expression of Bcl- and c-myc in EBV-positive and EBV-negative groups Group 0 40 Time (month) 图 EBV 阳性组和 EBV 阴性组中位生存时间比较 Figure Median survival time of EBV-positive and EBV-negative groups was compared n=5 n=60 Bcl- χ P Bcl- (+) 8 (53.3) 9 (3.6) Bcl- (-) 7 (46.7) 4 (68.3) c-myc 5 (33.3) 3 (38.3) c-myc (-) 0 (66.7) 37 (6.7) c-myc+bcl-* (8.) Single expression or no expression 9 (8.8) 38 (97.4) DLBCL 是非霍奇金淋巴瘤中最常见的类型 瘤 佳 9 DLBCL 可以发生在全身多个系统 其中结外部 位以胃部最常见 但是发生于胃的 DLBCL 在胃部肿 瘤中罕见 发生率不足 5% 008 年 WHO 分类中 有 c-myc+bcl- 讨论 细胞形态呈多形性或单形性 侵袭性强 总体预后不 c-myc (+) 3 (.6) 一种类型称为 EBV 阳性的老年弥漫大 B 细胞淋巴 瘤 临床上无明确的免疫缺陷病史 如移植 激素应 用等 形态上表现为多形性或单一性大细胞增生浸 *Excluding the c-myc, Bcl-, Bcl-6 simultaneous expression cases, 润 常伴有地图样坏死 WHO 将这种疾病的年龄段 n=, n=39 界定在年龄 50 岁 但是近年来部分研究提示 4-5 一.3 比较 胃 DLBCL 中 EBV 阳性与 EBV 阴性增殖指数的 采用独立样本 t 检验比较两组差异 EBV 阳性组 75.0±4.33 与 EBV 阴性组 79.±.94 相比 差异无 统计学意义 P= R- CHOP 方 案 下 胃 DLBCL 中 EBV 阳 性 组 与 EBV 阴性组总生存时间的比较 由于 R-CHOP 方案是 DLBCL 的标准治疗方案 些无免疫缺陷的 DLBCL 的年轻患者 年龄<50 岁 也 会存在 EBV 感染 故本研究集中收集 75 例胃部 DL BCL 的患者进行分析 发现 EBV 阳性的患者中有 5 例年龄<50 岁为 33.3% 5/5 最小者为 0 岁 这 5 例 患者既往均无 HIV 感染 风湿病 移植及激素使用史 等 并且在形态 蛋白表达水平上与年龄 50 岁的患 者类似 这与以往的研究相符 0 所以 以往用年龄 相关的免疫缺陷来解释 DLBCL 出现 EBV 阳性的情况 并不充足 EBV 阳性老年 DLBCL 发生在儿童原因还

4 58 中国肿瘤临床 06 年第 43 卷第 6 期 Chin J Clin Oncol 06. Vol. 43. No. 6 有待研究 [-] 在年龄方面, 本研究以 50 岁为界限, 将 EBV 阳性组同 EBV 阴性组进行对比, 差异无统计学 意义 (P=0.5) 所以在胃 DLBCL 患者中,EBV 阳性 的 DLBCL 并不只发生于老年人群 在 DLBCL 患者中,EBV 感染占 0% 左右, 常伴随 免疫缺陷 研究证实 [3-4] EBV 感染本身可以导致多 种肿瘤, 如伯基特淋巴瘤, 霍奇金淋巴瘤, 淋巴系统 增殖性疾病等, 它可以通过促进 c-myc 基因过表达, 激活 NF-κB,JAK/STAT,PI3K/AKT 通路促进肿瘤的 发生, 但是在无免疫缺陷的 DLBCL 病例中,EBV 的作 用仍有待研究 [] 在胃肠肿瘤中,EBV 也可以通过 影响基因表达促进肿瘤的发生 [5] 为明确 EBV 对胃 DLBCL 的影响, 本研究对比了两组的症状 性别 瘤 细胞起源 形态 增殖指数, 差异无统计学意义 (P>0.05), 与以往报道相符 [5,6] 所以胃 DLBCL 中 EBV 感染对 临床表现 性别 细胞形态 MALToma 成分 起源 增 殖指数无明显影响 伴随分子生物学诊断水平的研究深入, 研究发 现 DLBCL 患者中出现 c-myc(+)/bcl-(+) 或少见的 c-myc(+)/bcl-6(+) 或 c-myc(+)/bcl-(+)/bcl-6(+) 的 双重打击 或 三重打击 淋巴瘤时, 预后尤其差 [6-7] 即使在标准方案 R-CHOP 治疗下, 也未能改善预后 [7] 双重打击 三重打击 淋巴瘤确诊需要基因学的 检测, 本研究因病例数有限, 未能深入进行 但有研 究提示 [8,6], 即使蛋白水平出现 双重表达 的情况, 预后也较差, 这一观点已逐渐达成共识 为明确 双 重表达 淋巴瘤是否与 EBV 感染有关, 本研究从蛋白 水平分析了 Bcl-,c-myc 表达与 EBV 的关系 研究 发现无论单独表达还是同时表达, 双重表达淋巴瘤 出现的情况与 EBV 感染无关 (P>0.05), 这与以往的 研究相符 因此, 本研究推测胃 DLBCL 中,Bcl-, c-myc 蛋白表达与 EBV 感染无关 R-CHOP 是目前治疗 DLBCL 的标准方案, 疗效 优于其他方案 本研究随访 30 例 R-CHOP 治疗的患 者, 将 EBV 阳性组和 EBV 阴性组相比, 中位 OS 分别 为 5. 个月和 3.4 个月, 所以在 EBV 感染状态下胃 DLBCL 的预后较差 (P=0.0), 这与一项韩国的研究 相符 [4] 但后者认为在 R-CHOP 治疗下的 DLBCL 患 者中,EBV 对年轻组患者 ( 年龄 <50 岁 ) 的 OS 无影响, 而老年组 ( 年龄 50 岁 )EBV 阳性患者预后较差, 以往 [8-9] 国内和国外的研究均认为在老年组中,EBV 对 OS 无影响 本研究将 30 例患者按年龄是否超过 50 岁分为老年组和年轻组分别分析 在老年组中,EBV 阳性组和 EBV 阴性组中位 OS 分别为 7.8 个月和 30.4 个月, 差异无统计学意义 (P=0.), 这与以往国内和 国外的研究相符 [8-9] ; 年轻组中 EBV 阳性组中位 OS 和 EBV 阴性组中位 OS 分别为 8.5 个月和 33.7 个月, EBV 阳性组中位 OS 明显短于 EBV 阴性组中位 OS (P=0.0) 由于年轻人 EBV 阳性的 DLBCL 发生例数少, 所以该结论缺乏相关文献支持 本研究推测, EBV 阳性的胃 DLBCL 患者预后要比 EBV 阴性的患者预后差 综上所述, 目前已不能将 EBV 阳性的 DLBCL 当做仅发生于老年人或免疫缺陷者的疾病, 年轻 无免疫缺陷者也可能发生 EBV 对于 DLBCL 患者的临床表现 肿瘤细胞的特点 蛋白表达情况均无明显影响, 但对于 双重表达 淋巴瘤的研究, 还需进一步扩大样本量 R-CHOP 治疗下,EBV 阳性患者比 EBV 阴性患者预后差 具体原因还需进一步深入做基因水平的研究 参考文献 [] Gollub MJ. Imaging of gastrointestinal lymphoma[j]. Radiol Clin North Am, 008, 46():87-3. [] Ding W, Zhao S, Wang J, et al. Gastrointestinal lymphoma in southwest China: subtype distribution of,00 cases using the WHO (008) classification in a single institution[j]. Acta Haematol, 06, 35():-8. [3] Zhang Z, Shen Y, Shen D, et al. Immunophenotype classification and therapeuticout comes of Chinese primary gastrointestinal diffuse large B-cell lymphoma[j]. BMC Gastroenterol, 0, 5(0):- 77. [4] Hong JY, Yoon DH, Suh C, et al. EBV- positive diffuse large B- cell lymphoma in young adults: is this a distinct disease entity[j]? Ann Oncol, 05, 6(3): [5] Cohen M, De Matteo E, Metrebian F, et al. EBV- positive diffuse large B-cell lymphoma association is not only restricted to elderly patients[j]. Int J Cancer, 03, 3(7): [6] Schneider KMC, Banks PM, Collie AMB, et al. Dual expression of MYC and BCL proteins predicts worse outcomes in diffuse large B- cell lymphoma[j]. Leuk Lymphoma, 05, 3(30):-3. [7] Yoshida M, Ichikawa A, Miyoshi H, et al. Clinicopathological features of double-hit B-cell lymphomas with MYC and BCL, BCL6 or CCND rearrangement[j]. Pathology International, 05, 65(0): [8] Al-Humood S, Alqallaf A, Shemmari A, et al. Genetic and immunohistochemical characterization of epstein-barr virus-associated diffuse large B-Cell lymphoma[j]. Acta Haematol, 04, 3():-0. [9] Paydas S. Helicobacter pylori eradication in gastric diffuse large B cell lymphoma[j]. World J Gastroenterol, 05, (3): [0] Uccini S, Al-Jadiry MF, Scarpino S, et al. Epstein-Barr virus-positive diffuse large B-celll ymphoma in children: a disease reminiscent of epstein-barr virus-positive diffuse large B-cell lymphoma of the elderly[j]. Hum Pathol, 05, 46(5): [] Wang TT, Yuan T, Zhang YZ. Research progress on epstein-barr virus and its Related lymphoma[j]. J Exp Hema, 04, (6): [ 王滕滕, 袁田, 张翼鷟.EB 病毒与其相关淋巴瘤的研究进展 [J]. 中国实验血液学杂志,04,(6): ] [] Vockerodt M, Yap LF, Shannon-Lowe C, et al. The epstein-barr virus

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