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橘鞠杜
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1 516 郑州大学学报 ( 医学版 ) 2018 年 7 月第 53 卷第 4 期 doi: / j. issn VEGF MMP-9 在卵巢癌组织中的表达及贝伐单抗联合顺铂对卵巢癌细胞 SKOV3 的作用刘端, 李红雨, 臧星卉, 鱼志琪, 孙玮, 李玉光郑州大学第三附属医院妇产科郑州关键词卵巢癌 ; 血管内皮生长因子 ; 基质金属蛋白酶 -9; 贝伐单抗 ; 顺铂 ; SKOV3 细胞中图分类号 R 摘要目的 : 探讨卵巢癌组织中 VEGF MMP-9 蛋白的表达及贝伐单抗联合顺铂对卵巢癌细胞 SKOV3 的作用机制方法 : 收集 41 例上皮性卵巢恶性肿瘤组织 30 例卵巢良性肿瘤组织 30 例正常卵巢组织, 采用免疫组化法检测卵巢组织中 VEGF MMP-9 蛋白的表达情况 MTT 实验检测 mg / L 的贝伐单抗对卵巢癌细胞 SKOV3 的体外增殖抑制作用 ; 流式细胞仪检测 5 mg / L 贝伐单抗 3 mg / L 顺铂单独及联合使用对卵巢癌细胞凋亡的影响 ;Western blot 法检测 5 mg / L 贝伐单抗 3 mg / L 顺铂单独及联合使用对 VEGF 下游信号通路中关键蛋白 AKT Bad 和 MMP-9 表达的影响结果 : 卵巢癌卵巢良性肿瘤正常卵巢组织中 VEGF 蛋白阳性表达率分别为 75. 6% 40. 0% 6. 7% ;MMP-9 蛋白阳性表达率分别为 70. 7% 20. 0% 3. 3%, 卵巢癌组与卵巢良性肿瘤组和对照组相比均升高 ( P 均 < ) 贝伐单抗在体外可浓度依赖性地抑制卵巢癌细胞 SKOV3 的增殖, 其 IC 50 为 (8. 89 ± 0. 27) mg / L 贝伐单抗顺铂可联合诱导卵巢癌细胞 SKOV3 凋亡 (P < ); 贝伐单抗联合顺铂处理组与单独药物处理组相比, 可减弱磷酸化 AKT 和 MMP-9 蛋白的表达, 增强促凋亡蛋白 Bad 的表达结论 :VEGF MMP-9 在卵巢癌组织中呈共同高表达状态 ; 贝伐单抗联合顺铂通过对 VEGF 下游信号通路的调控以及 MMP-9 蛋白的影响, 发挥协同抗肿瘤效应 Expressions of VEGF and MMP-9 in ovarian cancer tissue and effects of bevacizumab plus cisplatin on ovarian cancer SKOV3 cells LIU Duan, LI Hongyu, ZANG Xinghui, YU Zhiqi, SUN Wei, LI Yuguang Department of Gynecology and Obstetrics, the Third Affiliated Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou Keywords ovarian cancer;vegf;mmp-9;bevacizumab;cisplatin;skov3 cell Abstract Aim: To detect expressions of VEGF and MMP-9 in ovarian cancer tissue and explore mechanism of bevacizumab plus cisplatin on ovarian cancer SKOV3 cells. Methods: A total of 41 epithelial ovarian malignant tumors, 30 cases of benign ovarian tumor, 30 cases of normal ovarian tissue from ovariectomy were collected. Immunohistochemistry was used to detect the expressions of VEGF and MMP-9 in ovarian tissue. The effect of bevacizumab(2. 5, 5. 0, 10. 0, 20. 0, mg / L) on SKOV3 cells was detected by MTT assay. Flow cytometry was used to detect the apoptosis of ovarian cancer cells which were treated with bevacizumab(5 mg / L) or cisplatin(3 mg / L) alone or in combination,and Western blot was used to detect the expressions of AKT,Bad, and MMP-9,the key downstream proteins of VEGF signal pathway. Results: The positive expression rates of VEGF in ovarian cancer, benign ovarian tumor and normal ovarian tissue were 75. 6%, 40. 0% and 6. 7%, respectively(p < ),and the positive rates of MMP-9 were 70. 7%, 20. 0% and 3. 3%, respectively( P < ). Bevacizumab inhibited the proliferation of ovarian cancer cells in a concentration-dependent manner, and the IC 50 value of bevacizumab was (8. 89 ± 0. 27) mg / L. The interaction between bevacizumab and cisplatin was significant(p < ), the combined use of bevacizumab and cisplatin performed best compared to the use alone, and synergistic induction of apoptosis in ovarian cancer cells. The bevacizumab plus cisplatin significantly reduced the expression of 作者简介李红雨, 通信作者, 女,1964 年 9 月生, 博士, 教授, 主任医师, 研究方向 : 妇科肿瘤, lihongyu99@ qq. com

2 Journal of Zhengzhou University( Medical Sciences) Jul Vol. 53 No phosphorylated AKT and MMP-9 protein, and enhanced the expression of the pro-apoptotic protein Bad when compared with bevacizumab or cisplatin alone. Conclusion: VEGF and MMP-9 are overexpressed in ovarian cancer tissue. Bevacizumab combined with cisplatin exerts a synergistic antitumor effect through the regulation of VEGF signaling pathway and MMP-9 protein. 卵巢癌是女性生殖器常见的三大恶性肿瘤之一, 早期病变不易发现, 晚期缺乏有效的治疗手段, 致死率位居妇科恶性肿瘤之首 [1] 目前主要采用以手术为主的综合治疗, 包括放疗和化疗等, 但 5 a 生存率仅为 20% ~ 25% [1] 随着对卵巢癌发生发展分子生物学机制的研究, 新的治疗靶点不断出现其中, 血管靶向治疗是目前热点之一, 尤其是血管内皮生长因子 ( vascular endothelial growth factor, VEGF) 单克隆抗体贝伐单抗 [2], 其次与侵袭相关的基质金属蛋白酶 ( matrix metalloproteinases, MMPs) 家族也受到了极大的关注 [3] 本文旨在了解卵巢癌组织中 VEGF MMP-9 的表达情况以及贝伐单抗联合顺铂对卵巢癌细胞的作用机制, 为卵巢癌的临床治疗提供可靠的理论依据 1 材料与方法 1. 1 研究对象选择 2015 年 9 月至 2017 年 6 月在郑州大学第三附属医院妇科住院并经病理检查确诊的 101 例患者其中 : 上皮性卵巢恶性肿瘤患者 41 例 ( 卵巢癌组 ), 年龄 28 ~ 75 岁, 中位年龄 47 岁, 术前未接受放化疗 ; 卵巢良性肿瘤患者 30 例 ( 卵巢良性肿瘤组 ), 年龄 20 ~ 72 岁, 中位年龄 45 岁 ; 因良性子宫病变行卵巢切除的患者 30 例 ( 对照组 ), 年龄 50 ~ 70 岁, 中位年龄 55 岁卵巢癌组卵巢良性肿瘤组与对照组年龄比较, 差异无统计学意义 1. 2 主要试剂免疫组化试剂均购于北京中杉金桥生物技术有限公司 ; 贝伐单抗购于瑞士罗氏公司 ; 顺铂购于齐鲁制药有限公司 ; 兔抗人 VEGF MMP- 9 AKT Bad 单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 / 兔 IgG 抗体购于美国 CST 公司 ;Western blot 化学发光液购于美国 Millipore 公司 ;BCA 蛋白定量试剂盒细胞凋亡检测试剂盒购于江苏碧云天生物技术研究所种卵巢组织中 VEGF MMP-9 蛋白表达的检测采用免疫组化法检测 3 种组织中 VEGF MMP-9 蛋白的表达情况将制备好的石蜡组织切片置于二甲苯中脱蜡, 再经乙醇梯度水化后, 放于枸橼酸钠抗原修复液中加热, 用体积分数为 3% 过氧化氢孵育, 灭活内源性过氧化氢酶然后滴加体积分数为 10% 山羊血清封闭 30 min, 加入鼠源抗 VEGF MMP-9 一抗过夜, 加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG,37 孵育 30 min 滴加 DAB 显色液, 显微镜下控制反应时间, 当阳性部位出现特异性显色而背景无着色时, 终止显色然后用苏木素进行复染, 盐酸乙醇分化液分化, 蓝化液蓝化, 梯度无水乙醇逐级脱水, 二甲苯透明, 最后用中性树胶封片, 在 400 倍光学显微镜下选取 5 个视野拍照免疫组化结果判定标准如下按着色强度评分 : 无着色 0 分, 淡黄色 1 分, 棕黄色 2 分, 棕褐色 3 分 ; 按阳性细胞百分比评分 : 无阳性细胞为 0 分, 阳性细胞 < 25% 为 1 分,25% ~ 为 2 分,50% ~ 为 3 分,75% ~ 为 4 分结果取 2 项评分的乘积,0 ~ 1 分为蛋白阴性表达, 2 分为蛋白阳性表达 1. 4 细胞及培养人卵巢癌细胞系 SKOV3 由第四军医大学病原生物学教研室赵亚教授惠赠细胞在含有体积分数为 10% 胎牛血清 ( 美国 Gibco 公司 ) 100 U / ml 青霉素和 100 mg / L 链霉素 ( 碧云天公司 ) 的 RPMI 1640 培养液中培养, 细胞密度达到 80% ~ 90% 时, 用 2. 5 g / L 胰蛋白酶 -EDTA 消化并传代 1. 5 细胞活性检测取对数生长期的卵巢癌细胞 SKOV3, 用 2. 5 g / L 胰蛋白酶 -EDTA 消化并计数, 按照个 / 孔的密度接种于 96 孔板中, 在 37 体积分数为 5% CO 2 中培养 24 h 后, 将 mg / L 的贝伐单抗加入到 96 孔板中, 每个浓度设置 6 个平行孔, 同时设置无药物处理组及无细胞空白对照组, 药物作用 48 h 每孔加入 20 μl MTT 溶液 (5 g / L) 放于 37 恒温箱中继续孵育 4 h 然后弃上清, 每孔加入 150 μl DMSO 溶液, 用酶标仪检测 570 nm 处的吸光度 ( A) 值存活率 = ( 加药组 A 值 - 空白对照组 A 值 ) / ( 无药物处理组 A 值 - 空白对照组 A 值 ) 100%, 并计算 IC 细胞凋亡率检测采用 Annexin V-FITC 和 PI 双染法结合流式细胞术检测贝伐单抗单独及联合顺铂对 SKOV3 细胞的凋亡诱导作用将对数生长期的 SKOV3 细胞以每孔个细胞的密度接种至 6 孔板中, 置于恒温箱中孵育 24 h 之后分别加入相应的药物 ( 贝伐单抗 5 mg / L 顺铂 3 mg / L 贝伐单抗 5 mg / L + 顺铂 3 mg / L), 对照组加入等体积的 PBS, 48 h 后收集细胞, 用 PBS 洗涤 2 ~ 3 遍根据细胞凋

518 郑州大学学报( 医学版) 2018 年 7 月第 53 卷第4 期亡检测试剂盒说明书,每管加入 500 μl Annexin V- 膜上覆盖适量化学发光显色液并置于 Amersham FITC 10 μl PI, 轻轻混匀, 室温避光孵育 10 min 1.

3 518 郑州大学学报( 医学版) 2018 年 7 月第 53 卷第4 期亡检测试剂盒说明书,每管加入 500 μl Annexin V- 膜上覆盖适量化学发光显色液并置于 Amersham FITC 10 μl PI, 轻轻混匀, 室温避光孵育 10 min 次率的比较采用 χ2 检验;卵巢癌组织中 VEGF MMP- FITC 结合液重悬细胞,然后加入 5 μl Annexin V- Imager 600 凝胶成像系统中成像拍照统计学处理采用 SPSS 进行统计学分于冰浴中用流式细胞仪检测细胞凋亡率实验重复析 3 种卵巢组织中 VEGF MMP-9 蛋白阳性表达 MMP-9 及 VEGF 信号通路中关键蛋白 AKT 9 蛋白表达的关系采用 Pearson 相关进行分析;贝伐伐单抗 5 mg / L 顺铂 3 mg / L 单独及联合使用处理亡率的比较采用 2 2 析因设计的方差分析检验 1. 7 和 Bad 蛋白表达的检测采用 Western blot 法贝 SKOV3 细胞 48 h,提取细胞中的总蛋白用 BCA 蛋单抗单独及联合顺铂使用时卵巢癌细胞 SKOV3 凋水准 α = 白定量试剂盒定量,取 30 μg 蛋白,配制体积分数 2 电泳,之后将蛋白电转至 PVDF 膜上经过封闭( 体稀释,4 孵育过夜) 洗涤( TBST 洗涤 3 次, VEGF MMP-9 蛋白阳性表达率升高 ( 图 1 表 1 ) 5% 浓缩胶体积分数 15% 分离胶进行 SDS-PAGE 积分数为 5% BSA 室温封闭 2 h) 与一抗孵育(1 每次 10 min) 与二抗孵育( 稀释,室温孵育 1 h) 洗涤( TBST 洗涤 3 次,每次 10 min) 后,在结果表达不同类型卵巢组织中 VEGF MMP-9 蛋白的与对照组卵巢良性肿瘤组比较,卵巢癌组卵巢癌组织中 VEGF MMP-9 蛋白的表达呈正相关 ( 表 2) A:正常卵巢组织;B:卵巢良性肿瘤组织;C:卵巢癌组织;1:VEGF 蛋白;2:MMP-9 蛋白图1 表1 3 种卵巢组织中 VEGF MMP-9 蛋白的表达( SP, 400) 3 种卵巢组织中 VEGF MMP-9 蛋白表达的比较组别对照组 n 30 卵巢良性肿瘤组 30 卵巢癌组 χ2 P 41 VEGF 蛋白阳性表达例数( % ) 2( 6. 7) 12(40. 0) MMP-9 蛋白阳性表达例数( % ) 阳性 6(20. 0) 29(70. 7) < < :与卵巢癌组相比,P < MMP-9 1( 3. 3) 31(75. 6) 表卵巢癌组织中 VEGF MMP-9 蛋白表达相关性分析阴性合计 VEGF 2. 2 合计阳性阴性 χ = ,P = ,r p = 例 6 12 贝伐单抗对卵巢癌细胞 SKOV3 的体外增殖抑制作用贝伐单抗对卵巢癌细胞 SKOV3 的增殖抑制作用随着浓度的增加而增强, 呈剂量依赖性

Journal of Zhengzhou University( Medical Sciences) Jul. 2018 Vol. 53 No. 4 519 ( 图 2),IC 50 为 (8. 89 ± 0. 27) mg / L 图 2 贝伐单抗对卵巢癌细胞 SKOV3 的体外增殖抑制作用 2.

4 Journal of Zhengzhou University( Medical Sciences) Jul Vol. 53 No ( 图 2),IC 50 为 (8. 89 ± 0. 27) mg / L 图 2 贝伐单抗对卵巢癌细胞 SKOV3 的体外增殖抑制作用组 SKOV3 细胞凋亡率的比较结果见表 3 表 3 4 组 SKOV3 细胞凋亡率的比较 % 顺铂 n 贝伐单抗 ± ± ± ± 1. 2 F 贝伐单抗 = ,F 顺铂 = ,F 交互 = ,P 均 < 贝伐单抗联合顺铂对 MMP-9 及 VEGF 信号通路中 AKT Bad 蛋白表达的影响结果见图 3 1 ~ 4: 分别为对照组贝伐单抗组顺铂组贝伐单抗 + 顺铂组图 3 贝伐单抗联合顺铂对 VEGF MMP-9 p-akt AKT Bad 蛋白表达的影响 3 讨论 VEGF 在肿瘤的发生发展过程中促进新生血管的生成 [4], 为肿瘤提供必需的氧气和营养物质 [5-7] MMP-9 能够降解细胞外基质和基底膜, 帮助肿瘤细胞进入血液循环, 也可以支持肿瘤细胞外渗和转移 [8-9],MMP-9 与血管生成及肿瘤侵袭能力密切相关, 这对肿瘤的生长和转移起到非常重要的作用 [10-12] 在本研究中作者发现, 卵巢癌组织中 VEGF MMP-9 蛋白的阳性表达率比卵巢良性肿瘤组及对照组高, 且二者呈正相关, 提示二者可能成为卵巢癌治疗的联合作用靶点贝伐单抗是重组的人源化单克隆抗体, 主要与 VEGF-A 结合, 抑制 VEGF 与其受体的结合, 从而抑制肿瘤血管的生成 [13] 目前,FDA 已批准贝伐单抗用于转移性结直肠癌转移性乳腺癌晚期非小细胞肺癌的一线治疗除此之外, 贝伐单抗在肝癌胃癌卵巢癌等恶性肿瘤的应用也取得较好的临床疗效, 尤其是和化疗药物联合使用时 [14-16] [17-18] 研究发现, 贝伐单抗在单独使用时随着其浓度的递增, U87 胶质瘤细胞所分泌的 MMPs 逐渐增多, 增强了 [17] 细胞的迁移和侵袭能力在动物实验中, 相比贝伐单抗的短期治疗, 其长期治疗使肿瘤细胞表现出更强的迁移和侵袭能力在本研究中 Western blot 结果显示, 贝伐单抗单独作用于 SKOV3 细胞时并未减弱与侵袭相关的 MMP-9 蛋白的表达, 但也没有表现出增强的趋势, 贝伐单抗长期作用于卵巢癌细胞之后,MMP-9 蛋白的表达水平是否有增加, 还有待 [17] 进一步的研究另外, 有学者通过贝伐单抗和 MMP 抑制剂的联合干预, 成功降低了胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力在本实验中作者采用贝伐单抗联合顺铂对卵巢癌细胞进行处理, 凋亡结果显示, 贝伐单抗的单独使用并未引起细胞的明显凋亡, 顺铂单独使用时引起细胞的凋亡率也仅有 13 % 左右, 但是两者联合使用后细胞的凋亡率明显增加, 说明二者的联合使用在诱导卵巢癌细胞凋亡方面起到了良好的协同效应同时 Western blot 结果也证实, 贝伐单抗和顺铂单独处理组与对照组相比促凋亡蛋白 Bad 的表达增强, 在联合用药组中 Bad 表达增强更明显接下来作者对 VEGF 下游信号通路中的关键蛋白 AKT 进行了检测, 结果显示, 贝伐单抗单独作用于卵巢癌细胞时可减弱 AKT 的磷酸化水平, 这说明贝伐单抗抑制了 VEGF 与其受体的结合, 并抑制了下游信号通路的传导, 在联合用药组中效果更加明显 Bad 是一种促凋亡蛋白, 其过表达可促进细胞凋亡

5 520 郑州大学学报 ( 医学版 ) 2018 年 7 月第 53 卷第 4 期 Western blot 结果显示, 贝伐单抗单独使用组可增强凋亡蛋白 Bad 的表达, 与顺铂联合使用后效果更明显, 而此时更值得注意的是 MMP-9 蛋白的表达有了明显的减弱由此作者推断, 贝伐单抗联合顺铂可协同抑制 VEGF 下游信号通路的传导, 进而影响 MMP-9 蛋白的表达这充分说明贝伐单抗的单独使用虽可影响 VEGF 下游信号通路的传导, 进而诱导细胞凋亡, 但并不能减弱细胞的侵袭能力, 而和化疗药物顺铂的联合使用可减弱 MMP-9 蛋白的表达水平因此, 贝伐单抗联合顺铂有可能成为治疗卵巢癌的一种有效方案参考文献 [1] SIEGEL RL,MILLER KD,JEMAL A. Cancer statistics[ J]. JAMA,2013,310(9):982 [2] LOIZZI V,DEL VECCHIO V,GARGANO G,et al. Biological pathways involved in tumor angiogenesis and bevacizumab based anti-angiogenic therapy with special references to ovarian cancer[ J]. Int J Mol Sci,2017,18(9): E1967 [3] ALASSEM A,ALHAZZANI K,DONDAPATI P,et al. Matrix metalloproteinases: a challenging paradigm of cancer management[ J]. Semin Cancer Biol,2017. doi: / j. semcancer [4] BOWER NI,VOGRIN AJ,LE GUEN L,et al. Vegfd modulates both angiogenesis and lymphangiogenesis during zebrafish embryonic development [ J ]. Development, 2017, 144(3):507 [5] CARMELIET P. Angiogenesis in life, disease and medicine [ J]. Nature,2005,438(770):932 [6] POTENTE M,GERHARDT H,CARMELIET P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis [ J ]. Cell, 2011, 146 (6):873 [7] ZHAO Q,LI Z. Angiogenesis[ J]. Biomed Res Int,2015, 2015: [8] DERYUGINA EI,QUIGLEY JP. Matrix metalloproteinases and tumor metastasis[ J]. Cancer Metastasis Rev,2006,25 (1):9 [9] BERGERS G,BREKKEN R, MCMAHON G, et al. Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis[ J]. Nat Cell Biol,2000,2(10):737 [10] 魏萍, 盛修贵. 整合素 αvβ6 MMP-9 在 46 例卵巢上皮癌表达及意义 [J]. 肿瘤学杂志,2010,16(4):305 [11 ] GUPTA MK, QIN RY. Mechanism and its regulation of tumor-induced angiogenesis [ J ]. World J Gastroenterol, 2003,9(6):1144 [12] HUANG S,HE P,PENG X,et al. Pristimerin inhibits prostate cancer bone metastasis by targeting PC-3 stem cell characteristics and VEGF-induced vasculogenesis of BM- EPCs[ J]. Cell Physiol Biochem,2015,37(1):253 [13] OKAMOTO S, NITTA M, MARUYAMA T, et al. Bevacizumab changes vascular structure and modulates the expression of angiogenic factors in recurrent malignant gliomas[ J]. Brain Tumor Pathol,2016,33(2):129 [14] FLEMING ND,COLEMAN RL,TUNG CA,et al. Phase Ⅱ trial of bevacizumab with dose-dense paclitaxel as first-line treatment in patients with advanced ovarian cancer[ J]. Gynecol Oncol,2017,147(1):41 [15] GOEY KK,ELIAS SG,HINKE A,et al. Clinicopathological factors influencing outcome in metastatic colorectal cancer patients treated with fluoropyrimidine and bevacizumab maintenance treatment vs observation: an individual patient data meta-analysis of two phase 3 trials[ J]. Br J Cancer, 2017,117(12):1768 [16] TAKAYOSHI K,KUSABA H,UENOMACHI M,et al. Suggestion of added value by bevacizumab to chemotherapy in patients with unresectable or recurrent small bowel cancer [ J]. Cancer Chemother Pharmacol,2017,80(2):333 [17] MENG X,ZHAO R,SHEN G,et al. Efficacy and safety of bevacizumab treatment for refractory brain edema: case report[ J]. Medicine ( Baltimore),2017,96(44):e8280 [18] AL-ALEM L, CURRY J. Ovarian cancer: involvement of the matrix metalloproteinases[ J]. Reproduction,2015,150 (2):R55 ( 收稿责任编辑姜春霞 )

马丽媛, 等. 油茶皂苷体外诱导人白血病 Jurkat 细胞凋亡及其可能机制 1073 力争将茶油作为食用油的主流品种 [5] 茶麸系油茶果实榨除茶油后的废弃残渣, 药用名为茶子饼,

马丽媛, 等. 油茶皂苷体外诱导人白血病 Jurkat 细胞凋亡及其可能机制 1073 力争将茶油作为食用油的主流品种 [5] 茶麸系油茶果实榨除茶油后的废弃残渣, 药用名为茶子饼, 1072 基础研究 Basic Research www.tumorsci.org 肿瘤 2011 年 12 月第 31 卷第 12 期 TUMOR Vol. 31, December, 2011 DOI: 10.3781/j.issn.1000-7431.2011.12. 004 Copyright 2011 by TUMOR 油茶皂苷体外诱导人白血病 Jurkat