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1 手性分析条件的建立和优化 手性分析中的注意事项 北京金欧亚科技发展有限公司 北京崇文区左安门内大街 8 号伟图大厦 301 室 PC: Tel : / Fax : / china.hplc@163.com 1/79

2 Daicel 手性色谱柱一览表 正相 直链淀粉衍生物 CHIRALPAK AD / AD-H CHIRALPAK AS / AS-H 纤维素衍生物 CHIRALCEL D / D-H CHIRALCEL J / J -H CHIRALCEL A, B, C CHIRALCEL F, G, K CHIRALCEL CA-1 反相 CHIRALPAK AD -RH CHIRALPAK AS -RH CHIRALCEL D-RH CHIRALCEL J -RH 共价键合型 - 新产品 CHIRALPAK IA CHIRALPAK IB 其它 CRWNPAK CR (+), (-) CHIRALPAK CHIRALPAK T(+), P (+) WH, MA (+) CHIRALPAK QD-AX CHIRALPAK QN-AX 2/79

3 2) H 系列手性柱 第二代手性色谱柱 --H 系列 CHIRALPAK AD-H CHIRALPAK AS-H CHIRALCEL D-H CHIRALCEL J-H 3/79 < 特性 > 1) 5 微米硅胶用于获得高的理论塔板数 2) 适用于痕量分析 3) 采用 15cm 长的手性柱可节省分析时间 9 / 47

4 2) H 系列手性柱 AS vs. AS-H H ( 中性组分 ) mv mv AS AS-H 柱尺寸 : 0.46cmI.D. x 25cmL 样品 : trans-stilbene oxide 条件流动相 : 正已烷 / 异丙醇 = 90 / 10 流量 : 1.0 ml/min. 温度 : 25 C 检测波长 : UV 254nm α N1 AS AS-H times 10 / 47

5 2) H 系列手性柱 AS vs. AS-H H ( 碱性组分 ) mv AS 柱尺寸 : 0.46cmI.D. x 25cmL 样品 : 1-[5-Chloro-2-(methylamino)phenyl]- 条件 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline 流动相 : 正已烷 / 异丙醇 / 二乙胺 = 90 / 10 / 0.1 流量 : 1.0 ml/min. 温度 : 25 C 检测波长 : UV 254nm mv α N1 AS AS-H AS-H Cl NH H N 3.4 times 11 / 47

6 2) H series columns AS vs. AS-H ( 酸性组分 ) mv 20 mv AS 柱尺寸 : 0.46cmI.D. x 25cmL 样品 : 2-(4-Hydroxyphenoxy) 丙酸 条件 流动相 : 正已烷 / 异丙醇 / 三氟乙酸 = 90 / 10 / 0.1 流量 : 1.0 ml/min. 温度 : 25 C 检测波长 : UV 254nm α N1 AS AS-H AS-H H H 2.1 times 12 / 47

7 2) H 系列手性柱 J mv J vs.j-h H ( 痕量分析 ) J-H mv 柱尺寸 : 0.46cmI.D. x 25cmL 样品 : 1-Phenyl ethanol 条件流动相 : 正已烷 / 异丙醇 = 90 / 10 温度 : 25 C 流量 : 1.0 ml/min. 检测波长 : UV 254nm 痕量分析 0.5% 手性化合物 H H 13 / 47

8 2) H 系列手性柱 AD AD vs. AD-H H ( 痕量分析 ) AD-H mv mv 柱尺寸 : 0.46cmI.D. 25cmL 样品 : 2-Phenyl 丙酸 条件流动相 : 正已烷 / 异丙醇 / TFA = 80 / 20 / 0.1 H CH 温度 : 25 C 流量 : 1.0 ml/min. 检测波长 : UV 254nm 痕量分析 0.5% 手性化合物 14 / 47

9 CRWNPAK CR(+) 冠醚性手性色谱柱 9/79 * Chiral Crown Ether coated on silica * For amino acids (primary amino group near the chiral center) * Dipeptides

10 CRWNPAK CR(+) 的拆分实例 Resolution of Amino acids on CRWNPAK CR(+) Amino acids K D Rs ph Flow rate (ml/min.) Temp. Amino acids K D Rs ph Flow rate (ml/min.) Temp. Alanine Cysteine Valine Tyrosine Norvaline Asparagine Leucine Glutamine Norleucine Asparadic acid Isoleucine Gultamic acid tert-leucine rnithine Phenylalanine Lysine DPA Arginine Methionine Citruline Ethionine Proline Phenylglycine Histidine Serine Tryptophan Threonine /79

11 第三代手性色谱柱 CHIRALPAK IA, IB 11/79

12 CHIRALPAK IA 与 IB 研发背景 涂敷型 正相 : 正己烷, 异丙醇, 乙醇反相 : 水, 乙腈, 甲醇, 乙醇, 异丙醇 键合型 CHIRALPAK IA, CHIRALPAK IB 在广泛的流动相条件下具有很强的手性分离能力 色谱试验过程中, 用于溶解样品的溶剂没有任何限制 在各种溶剂中柱性能异常稳定 12/79

13 CHIRALPAK IA, IB 的基本特征 CHIRALPAK IA 载体 : 硅胶手性选择剂 : 直链淀粉 - 三 (3,5- 二甲基苯基氨基甲酸酯 ) R R R n R= N H CHIRALPAK IB 载体 : 硅胶手性选择剂 : 纤维素 - 三 (3,5- 二甲基苯基氨基甲酸酯 ) R R R n R= N H 13/79 规格 : 150 或 250 X 4.6 mmid, 250 X 10 或 20 mmid 柱温 : 0 to 40 ºC 柱压 : 10 MPa

14 CHIRALPAK IA 柱应用实例 不同流动相体系下手性分离 = 2.81 MtBE/EtH 95: n-hexane/ch 2 Cl 2 75: toluene/n-hexane/eth :25: = = = n-hexane/chcl 3 50: = 1.70 n-hexane/methyl acetate 80: = methaqualone n-hexane/2-prh 80:20 n-hexane/thf 85:15 n-hexane/acetone 85: N N CH CH 3 3 = /79 = /21

15 IA,IB 柱的修复再生 样品 新色谱柱 柱性能受损 ( 如受强吸附杂质的影响 ) 修复再生后 ( 可使用各种强极性溶剂 ) F H H 15/79 流动相 : n-hexane/eth 90/10 1 ml/min, 25 C 20/21

16 CHIRALPAK IA 分离实例 --- 中性样品 -- Hexobarbital N H N Cl Lorazepam N Cl H Glutethimide N H 4-Benzoyloxy- 2-azetidinone N H 甲基叔丁基醚 =100 k 1 =0.31, = /79 正己烷 / 丙酮 =60/40 k 1 =1.75, =1.47 正己烷 /1,4- 二氧环乙烷 =70/30 k 1 =1.65, =2.19 正己烷 / 二氯甲烷 =25/75 k 1 =3.93, =1.52

17 CHIRALPAK IA 分离实例 --- 碱性样品 --- Bupivacaine Hydroxyzine Disopyramide Indapamide Cl N H N N H 0.20 N 0.4 H 2 N N N N NH S Cl NH / Hex/THF/DEA =90/10/0.1 k 1 =3.94, = Hex/EtAc/DEA =40/60/0.1 k 1 =2.90, = Hex/Acetone/DEA =80/20/0.1 k 1 =3.36, = MTBE/EtH/DEA =80/20/0.1 k 1 =0.67, =1.75

18 CHIRALPAK IA 分离实例 --- 酸性样品 --- Suprofen Flurbiprofen Sulindac Tropic acid H F H H S S 0.6 F 0.30 H H /79 Hex/EtAc/TFA =70/30/0.1 k 1 =2.83, = Hex/EtH/TFA =85/15/0.1 k 1 =0.74, = MeH/EtH/TFA =50/50/0.1 k 1 =0.59, =1.45 Hex/THF/TFA =65/35/0.1 k 1 =1.01, =1.14

19 CHIRALPAK IB 分离实例 --- 中性样品 -- Mephobarbital trans-stilbene oxide 2,2,2-Trifluoro-1- (9-anthryl)ethanol NH CH 3 F 3 C H N CH 正己烷 / 三氯甲烷 =50/50 =1.12 正己烷 / 二氯甲烷 =80/20 k 1 =0.69, =1.62 正己烷 / 四氢呋喃 =90/10 k 1 =2.28, = /79

20 CHIRALPAK IB 分离实例 --- 碱性样品 -- Laudanosine Terfenadine xprenolol N H H H N H N min 20/79 正己烷 /THF/EDA =70/30/0.1 k 1 =0.67, =2.68 正己烷 /CHCl 3 /EtNA =65/35/0.1 k 1 =1.20, =1.33 MTBE/EtH/EDA =95/5/0.1 k 1 =0.45, =2.98

21 CHIRALPAK IB 分离实例 --- 酸性样品 -- Warfarin H N-Benzyloxycarbonylvaline H N H 正己烷 / 乙酸乙酯 /TFA =70/30/0.1 k 1 =2.69, =1.59 正己烷 /CHCl 3 / 甲醇 /TFA =70/30/1/0.1 k 1 =1.52, = /79

22 离子交换型新手型色谱柱 维也纳大学 W.Lindner 教授研究开发的离子交换型手性色谱柱 H 3R S silica H N H 9 8 4S N 1S + H XŌ CH3 N 不对称炭原子临近的胺正离子和酸性官能基 (X - 手性化合物分离的基本作用力 ) 所形成的不对称环境是 手性识别剂 Quinine 衍生物 CHIRALPAK R QN-AX:(8S, 9R) Quinidine 衍生物 CHIRALPAK R QD-AX:(8R, 9S) 22/79

23 N- 保护氨基酸的分析实例 30 N H C 2 H N-Ac-Ala CHIRALPAK R QD-AX MeH/AcH=100/1(v/v) N H N-Boc-Leu C 2 H CHIRALPAK R QN-AX MeH/AcH=100/1(v/v) 23/79 N H H N-Ac-Ser C 2 H CHIRALPAK R QD-AX MeH/AcH=97/3(v/v)

24 内容提纲 1. 手性 HPLC 分析条件的建立和优化 1-1 正相色谱 2-2 反相色谱 2. 手性色谱柱的自动筛选 3. 手性分析中的注意事项 24/79

25 4 种主要的正相柱和反相柱 普通 正相 H 系列 反相 CHIRALCEL 系列 R R= N H D D-H D-RH R R n R= J J-H J-RH CHIRALPAK 系列 R R R n R= N H R= N H AD AD-H AD-RH AS AS-H AS-RH 柱长 25cm 25cm N.A. (I.D. : 0.46cm) N.A. 15cm 15cm 25/79 15/21

26 分析条件优化流程图 (1) 1. 流动相中添加物的必要性 酸性 中性 样品 碱性 Hex/IPA/TFA =90/10/0.1 Hex/IPA =90/10 Hex/IPA/DEA =90/10/0.1 26/79 配制流动相

27 添加物在分离中的作用 35 酸性样品 mv ( 没出峰 ) mv F CH 流量 :1.0mi/min. 温度 :40 检测波长 :UV(254nm) 流动相 Hex/IPA=90/10 Hex/IPA/AcH=90/10/0.1 碱性样品 N H 2 N N 流动相 mv Hex/IPA=90/10 ( 无法分离 ) 流量 :1.0mi/min. 温度 :25 检测波长 :UV(254nm) mv Hex/IPA/DEA=90/10/0.1 27/79

28 添加物的种类和用量 样品酸碱性 中性 碱性 酸性 添加物种类 不需要 二乙胺 (DEA) (n- 丁胺 * 1 ) ( 乙醇胺 * 2 ) 三氟乙酸 (TFA) 醋酸 添加量 0.5% 通常 0.1% 0.5% 通常 0.1% *1 主要用于 1 级胺 *2 主要用于 1 级氨基醇 28/79

29 分析条件优化流程图 (2) 2. 配制好流动相 分析 增加异丙醇 长 保留时间? 短 增加正已烷 适宜的分析时间 (10-30 min.) 选择合适的手性柱 29/79

30 分析条件优化流程图 (3) 3. 选择合适的手性柱 基线分离 分离? 没有分离 K! 部分分离 尝试别的手性柱 继续优化分析条件 30/79

31 筛选结果 色谱条件 流动相 : Hex./IPA/ AcH = 90/10/0.1 流量 :1.0ml/min. 温度 :40 检测波长 :UV254nm 样品 : F mv mv AD J mv mv D AS mv mv B C CH F G mv mv 先择效果最好的手性柱, 然后继续优化分析条件 31/79

32 分析条件优化流程图 (4-A) 4. 分析条件继续优化 部分分离 C. 更换醇类 B. 调整温度 A. 降低异丙醇浓度 32/79

33 醇浓度的影响 mv Hex./IPA/ AcH =90/10/0.1 Hex./IPA/ AcH =100/1/0.1 Column:AD, Temp.:40, Flow rate:1.0ml/min. mv Sample:Flurbiprofen F CH 在多数情况下, 降低醇的浓度可延长保持时间, 改善分离度 33/79

34 分析条件优化流程图 (4-B) 4. 分析条件继续优化 部分分离 C. 更换醇类 B. 调整温度 A. 降低异丙醇浓度 34/79

35 温度的影响 α: α:1.32 α: mv mv Temp.: Column:CHIRALPAK AD Mobile phase: Hex./IPA/ AcH =90/10/0.1, Flow rate:1.0ml/min. F CH 降低柱温可增大 α 值, 但会使峰形变宽 35/79 升高柱温会减少 α 值, 但会使峰形尖锋

36 分析条件优化流程图 (4-C) 4. 分析条件继续优化 部分分离 C. 更换醇类 B. 调整温度 A. 降低异丙醇浓度 36/79

37 醇种类的影响 = = mv mv Hex./IPA/AcH=90/10/0.1 Column:CHIRALPAK AD Temp.:40, Flow rate:1.0ml/min Hex./EtH/AcH=95/5/0.1 Sample:Flurbiprofen F CH IPA 和 EtH 有时会使峰形和 α 值发生明显变化 37/79

38 正相柱分析条件优化的总结 1. 根据样品性质判断是否需要往流动相中加添加物 2. 调整正己烷 / 醇的比例, 从而选择适当的保留时间 3. 其它优化方法 a. 流动相的醇浓度 降低醇的浓度能改善分离度, 但会延长分析时间 b. 色谱柱温度 降低柱温能增加 α 值, 但会使峰形变宽 c. 流动相中醇的种类 改换醇的种类 (IPA EtH), 有时会使选择性发生一些变化 38/79

39 内容提纲 1. 手性色谱柱分析条件的建立和优化 2-1 正相色谱 2-2 反相色谱 2. 手性色谱柱的自动筛选 3. 手性分析中的有关注意事项 39/79

40 RH 系列 ( 反相用 ) 的规格 流动相 耐压 (MPa) 温度范围 ( ) ph 范围 D-RH J-RH AS-RH AD-RH 水溶液 / 有机溶剂 * 1 =90/10~0/ ~40 2~7 5~40* 2 2~9* 2,3 *1 有机溶液 : 醇 ( 甲醇, 乙醇, 异丙醇 ) 或乙腈 *22 ph>7 使用时, 温度在 5~25 *3 ph 超过 8 时, 使用硼酸缓冲液 40/79

41 根据样品性质选择流动相 样品性质 D-RH J-RH AD-RH AS-RH 中性 酸性 水 / 乙腈 磷酸水溶液 (ph2)/ 乙腈 0.1M 磷酸缓冲液 (ph2)/ 乙腈 碱性 0.1M KPF 6 水溶液 / 乙腈 0.1M NaPF 6 水溶液 / 乙腈 20mM 硼酸缓冲液 (ph9)/ 乙腈 20mM 磷酸缓冲液 (ph8)/ 乙腈 41/79

42 反相流动相的 ph 值对分离度的影响 (AS-RH) 中性化合物 Benzoin 酸性化合物 N-CBZ-Norvaline 碱性化合物 floxacin ethyl ester F CEt N H CH H N N N 水溶液 水溶液 /CH 3 CN=60/40 流速 :1.0ml/min. 水溶液 /CH 3 CN=60/40 流速 :1.0ml/min. 水溶液 /CH 3 CN=80/20 流速 :0.5ml/min. 水 mv mv mv 磷酸水溶液 (ph2) mv mv mv 硼酸缓冲液 (ph9) mv mv /

43 有机溶剂种类对分离的影响 2-Methyl-1-tetralone 2-Phenyl-2-butanol H 水 / 乙腈 =50/ 水 / 乙醇 =35/65 水 / 甲醇 =25/75 手性柱 :CHIRALPAK AD-RH 流速 :0.5ml/min 温度 :25 43/79

44 反相柱分析条件优化的总结 1. 根据样品性质选择流动相 中性, 酸性样品对 4 种反相柱的流动相是一致的 但是, 碱性样品对 D-RH J-RH 的流动相和 AD-RH AS-RH 的流动相是不同的 2. 探索适当的保留时间和流动相组成 3. 其它优化条件 a. 水溶液和有机溶液比例 多数情况下降低有机溶液的浓度能改善分离, 但会延长分析时间 b. 色谱柱温度 降低柱温能增加 α 值, 但会使峰形变宽峰形变宽 c. 有机溶剂的种类 有机溶剂的种类不同, 其洗脱强度也不同 有时其分离效果也发生一些变化 44/79

45 内容提纲 1. 手性色谱柱分析条件的建立和优化 2-1 正相色谱 2-2 反相色谱 2. 手性色谱柱的自动筛选 3. 手性分析中的注意事项 45/79

46 手性色谱柱组合筛选 手性色谱柱组合 CHIRALPAK AD-H CHIRALPAK AS-H CHIRALCEL D-H CHIRALCEL J -H 手性色谱柱尺寸 : 0.46cmI.D. 15cmL 46/79

47 为何选用 AD-H,AS H,AS-H,D-H,J-H 这 4 种柱子? 2000~2004 年客户样品分析 660 个样品的分析结果 部分分离 10% (63) 不分离 10% (73) 基线分离 80% (524) 达到基线分离的手性柱比例 : 其他 8% (42 样品 ) AD 系列 D 系列 AS 系列 J 系列 92% (482 样品 ) 47/79

48 为何选用 15cm 长度手性色谱柱呢? N N 标准条件 柱长 ( 15/25) 流速 (1/3)= 分析时间短缩为 (1/5) 48/79

49 组合筛选设备 ヘキサン IPA エタノール 49/79

50 组合筛选设备示意图 紫外检测器 泵 旋光检测器 溶剂切换阀 色谱柱自动切换阀 自动进样器 流动相 1 流动相 2 50/79

51 串联旋光检测器的好处 1 1. 用 UV 检测器只出现 1 峰 的时候 应用旋光检测器可确认其分离状况 51/79

52 串联旋光检测器的好处 2 2. 可确认洗脱顺序 52/79

53 筛选结果示例 样品 : 53/79

54 54/79 信息 1: 判别具有分离可能性的色谱柱

55 信息 2: 色谱柱和洗脱顺序 AD-H vs D-H J-H 的洗脱顺序相反 55/79

56 信息 3: 醇的种类对分离的影响 D-H 和 J-H, 用每种流动相均可分离 AD-H, 只有用乙醇才可分离 56/79

57 分析条件的选择 选择条件的要点 1. 分离度 2. 洗脱时间 3. 峰形 4. 对映体的洗脱顺序 57/79

58 若筛选没得到理想的分析条件时 1. 选择最接近基线分离的条件 2. 调整流动相中醇的比例 3. 调整流速 4. 调整温度 5. 变更为同种类长度为 25cm 的色谱柱 6. 尝试其他的色谱柱 58/79

59 应用组合筛选设备探索分析条件总结 1. 使用具有广普分离能力的的 4 种手性色谱柱 2. 使用适合高流速的 15cm 的手性色谱柱 3. 组合应用 2 种醇, 考察其分离情况 4. 和旋光检测器并用, 可一次性获得更多的判断信息 59/79

60 内容提纲 1. 手性 HPLC 分析条件的建立和优化 2-1 正相色谱 2-2 反相色谱 2. 手性色谱柱的自动筛选 3. 手性分析中的注意事项 60/79

61 常见使用故障 = 溶剂错误 1 Daicel 大部分手性柱是涂敷型产品, 在市场上具有独特性 若导入错误的溶剂 (CH 2 Cl 2 乙酸乙酯 甲苯等 ), 柱子会马上被破坏 当流动相或样品溶液导入错误的溶剂时, 柱压剧增, 分离突然变差 一旦错误地使用了溶剂, 重新恢复柱子性能的可能性很低 若您遇到此类分析故障, 请对照出厂报告重新确认柱子的性能或与大赛璐联系 61/79

62 常见使用故障 = 溶剂错误 2 Daicel 正相手性柱的流动相和样品溶液不能使用水溶液 若不小心导入水, 柱子不会彻底受损 只需要使用色谱级无水乙醇低流速将水置换出来 62/79

63 使用前彻底清洗管路 将手性柱接入液相色谱仪之前 1. 用异丙醇将 HPLC 所有管路彻底清洗 2. 用流动相将 HPLC 所有管路彻底清洗 所有溶剂入口 泵与进样阀之间 定量环 进样阀清洗液 进样阀与柱子之间 检测器 泵 柱子与检测器之间 63/79

64 压力 后果 : 长期超压会引起柱头塌陷, 反压上升, 柱效下降 原因 : 流动相或样品溶液过滤不彻底, 固体颗粒堵塞管路或柱头, 会引起柱压过高 样品中成分在柱头析出或强烈吸附, 会引起柱压升高 流速过快, 会引起柱压过高解决方法 : 每种柱子有特定的承压范围, 请仔细参照相应的 色谱柱说明书 彻底过滤流动相及样品溶液 样品预处理 更换流动相时, 或者刚把柱子刚接上仪器的时候, 逐步增加流速 64/79

65 流动相中水含量的影响 mg/l mg/l 65/79

66 流动相中水含量的影响 mg/l 66/79

67 峰变形 ( 消旋化 ) Ar Y X Y Ar Ar X CHIRALCEL J 正己烷 / 乙醇 =90/ ml/min,275 nm /79

68 68/79 1 添加物残留效应

69 如何避免 残留效应 残留物在普通流动相中可长时间地稳定保留 用醇洗涤可除去大部分的碱性残留物 用酸洗涤也可除去碱性残留物 用碱洗涤可除去酸性残留物 或者分开使用酸性条件手性柱和碱性条件手性柱 69/79

70 大赛璐 ( 中国 ) 手性技术服务中心 位于上海有机化学研究所内 1. 开发手性分析方法 2. 为用户制备手性化合物 3. 大赛璐手性柱售前售后服务 70/79

71 大赛璐 ( 中国 ) 手性技术服务中心 1. 开发手性分析方法 如果您想买一根手性柱来分析某个样品, 但是吃不准买哪个型号 免费筛选, 优化 最佳手性柱, 最佳分析条件 用户放心购买合适的手性柱 71/79

72 大赛璐 ( 中国 ) 手性技术服务中心 2. 为用户制备手性化合物 如果您想得到光学纯的手性化合物, 手头没有手性制备柱 免费评估, 可行性实验, 成本核算 用户请大赛璐制备手性化合物或者购买制备柱 72/79

73 大赛璐 ( 中国 ) 手性技术服务中心 2. 大赛璐手性柱售前售后服务 如果您想购买或者购买了大赛璐的手性柱 免费技术咨询, 疑问解答 用户放心使用大赛璐手性柱 73/79

74 北京金欧亚科技发展有限公司 北京崇文区左安门内大街 8 号伟图大厦 301 室 PC: Tel : / Fax : / china.hplc@163.com 74/79

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PowerPoint Presentation 大赛璐 手性分析的近期进展 北京金欧亚科技发展有限公司 北京崇文区左安门内大街 8 号伟图大厦 31 室 PC:161 Tel :1-67136152/67178 Fax :1-6711416/67113925 http://www.jinouya.cn E-mail:china.hplc@163.com 1 手性色谱技术的研发动向 更加广泛 对 1% 的责任和挑战 新型固定相 AY,Z,AZ,IC

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