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1 园艺学报,2017,44 (4): Acta Horticulturae Sinica 784 doi: /j.issn x ; ahs. ac. cn 太子参芜菁花叶病毒和蚕豆萎蔫病毒的双重 RT-PCR 检测匡云波 1,2, 陈满足 1, 陆伊荣 1, 陈晶 1, 叶祖云 ( 1 宁德师范学院生物系, 福建宁德 ; 2 福建省特色药用植物工程技术研究中心, 福建宁德 ) 1,2,* 摘要 : 针对不同产地栽培的太子参 (Pseudostellaria heterophylla) 中主要存在芜菁花叶病毒 (Turnip mosaic virus,tumv) 和蚕豆萎蔫病毒 (Broad bean wilt virus,bbwv) 侵染且为害严重的情况, 建立能同时检测这 2 种病毒的双重 RT-PCR 快速检测方法根据 GenBank 数据库中的 TuMV BBWV 外壳蛋白 (coat protein,cp) 基因核苷酸序列的保守区域分别设计简并引物, 在单一 RT-PCR 检测体系的基础上, 建立和优化双重 RT-PCR 检测体系双重 RT-PCR 的优化结果显示, 最佳扩增循环数为 35, 最佳引物浓度为 0.4 μmol L -1, 最佳退火温度为 51 其灵敏度测定结果显示,2 种病毒在样品 cdna 稀释至原液的 10-4 倍后仍能扩增出特异条带应用该方法对 7 份栽培太子参样品和 4 份脱毒苗样品进行了检测, 结果表明, 建立的双重 RT-PCR 检测方法可稳定准确灵敏地同时检测 TuMV 和 BBWV 关键词 : 太子参 ; 芜菁花叶病毒 ; 蚕豆萎蔫病毒 ; 双重 RT-PCR 中图分类号 :S ;S 567 文献标志码 :A 文章编号 : X(2017) Detection of Turnip mosaic virus and Broad bean wilt virus in Pseudostellaria heterophylla by Duplex RT-PCR KUANG Yunbo 1,2,CHEN Manzu 1,LU Yirong 1,CHEN Jing 1,and YE Zuyun 1,2,* ( 1 Biology Department,Ningde Normal University,Ningde,Fujian ,China; 2 Engineering Research Center for Medical Plants with Fujian Provincial Characteristics,Ningde,Fujian ,China) Abstract:A high incidence of both Turnip mosaic virus(tumv)and Broad bean wilt virus (BBWV) in cultivated Pseudostellaria heterophylla in different producing areas causes serious damage. A duplex RT-PCR method was developed for simultaneous and rapid detection of those 2 viruses. Degenerate primers were designed according to the conserved sequence regions of coat protein(cp)genes from GenBank. Duplex RT-PCR detection system was established and optimized based on single RT-PCR. The optimal parameters for the duplex RT-PCR were 35 PCR cycles,0.4 μmol L -1 for the concentration of each of the primers,and an annealing temperature at 51. Sensitivity analysis revealed that viruses could be detected from fold dilution of the first strand cdna. Duplex RT-PCR established in this study was used to detect 2 viruses in 7 samples of cultivated P. heterophylla and 4 samples of virus-free test-tube plantlets. The results proved that it could be used for rapid detection of TuMV and BBWV 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 福建省教育厅科技项目 (JA15563); 宁德师范学院引进人才项目 (2014Y004); 福建省区域发展项目 (2015N3014) * 通信作者 Author for correspondence( zyye0593@163.com)

2 匡云波, 陈满足, 陆伊荣, 陈晶, 叶祖云. 太子参芜菁花叶病毒和蚕豆萎蔫病毒的双重 RT-PCR 检测. 园艺学报,2017,44 (4): simultaneously in P. heterophylla with high stability,accuracy and sensitivity. Keywords:Pseudostellaria heterophylla;tumv;bbwv;duplex RT-PCR 太子参 [Pseudostellaria heterophylla(miq.)pax], 又名孩儿参童参, 为石竹科太子参属多年生草本药用植物, 以块根入药, 是中国著名的滋补类中药材长期以来, 太子参的栽培主要以块根进行营养繁殖, 多种病毒侵染并积累, 致使病毒病普遍发生, 为害严重 ( 宋荣浩和濮祖芹,1991, 1994; 黄勇毅和林丛发,2004; 吴朝峰等,2006) 病毒病导致太子参种质退化产量和品质下降, 已成为太子参产业发展的瓶颈问题如何对太子参病毒进行快速准确地诊断显得尤为迫切据报道, 侵染太子参的病毒主要有 4 种 : 芜菁花叶病毒 (Turnip mosaic virus,tumv) 蚕豆萎蔫病毒 (Broad bean wilt virus,bbwv) 烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,tmv) 和黄瓜花叶病毒 (Cucumber mosaic virus,cmv)( 刘清琪和陈棣华,1983; 宋荣浩和濮祖芹,1991; 黄勇毅和林丛发,2004) 但至今为止, 关于太子参病毒快速检测方面的报道甚少高玮等 (1993) 应用酶联免疫吸附法 (ELISA) 对太子参 TMV 进行了田间检测该方法具有快速准确适合大批量样品检测的优点, 但其灵敏度不高, 不适用于病毒浓度较低的样品检测病毒衣壳蛋白 (coat protein, CP) 基因因其具有较高的序列保守性, 常用于植物病毒的分子检测 ( 金晶等,2015; 沈建国等, 2016; 朱晨熹等,2016) 黄颖桢等(2016) 建立了太子参 TuMV 的单一 RT-PCR 检测体系相比传统的病毒检测方法,RT-PCR 检测方法无放射性危险, 具有快速稳定特异性强灵敏度高等特点, 在含量较低的植物病毒检测中发挥了重要作用 (Dan et al.,2010; 沈建国等,2012a,2012b) 此前, 作者采用 DAS-ELISA 法和单一 RT-PCR 法对不同产地的栽培太子参样品进行了病毒检测, 结果发现近年来各地太子参样品中主要存在 TuMV 和 BBWV 侵染, 并且存在 2 种病毒复合侵染的情况多重 RT-PCR(multiplex RT-PCR) 可同时检测多种植物病毒, 已经在百合 ( 王继华等, 2005; 徐榕雪等,2007) 柑橘( 丁芳等,2006) 烟草(Dai et al.,2012) 甘薯(Li et al.,2012) 菊花 (Song et al.,2013) 茄子(Ge et al.,2013) 桃(Yu et al.,2013) 大蒜( 许蕊等,2013) 葡萄 ( 范旭东等,2012) 和马铃薯 ( 罗文彬等,2015) 等植物上得到了广泛应用特别是在复合诊断中, 多重 RT-PCR 不仅可以大大提高检测效率, 又可以显著降低试验成本, 具有很高的实际应用价值 ( 张威等,2014; 宗晓娟等,2014) 因此, 本研究中根据当前太子参生产中病毒病害的实际情况, 设计简并引物, 在前期单一 RT-PCR 的检测体系基础上, 筛选引物组合, 建立能同时检测出 TuMV 和 BBWV 的双重 RT-PCR 快速检测体系, 为太子参田间病毒病的快速诊断和脱毒检测提供参考 1 材料与方法 1.1 试验材料供试 TuMV 和 BBWV 毒源为 2015 年 3 月取自于不同产地的栽培太子参病叶样品 ( 共 7 份, 其中来自于福建省的病样 3 份, 来自于江苏湖南贵州和山东的病样各 1 份 ) 植株发病初期均呈现出轻花叶, 叶片皱缩等明显的病毒病症状经 DAS-ELISA 单一 RT-PCR 及序列测定后确认, 由作者实验室保存健康太子参样品为经 DAS-ELISA 检测呈阴性的太子参脱毒苗此外, 采用不同方法脱毒后的太子参组培苗样品 ( 共 4 份, 其中种胚脱毒的样品 3 份, 茎尖脱毒的样品 1 份 ) 用于双重 RT-PCR 脱毒检测

3 Kuang Yunbo,Chen Manzu,Lu Yirong,Chen Jing,Ye Zuyun. Detection of Turnip mosaic virus and Broad bean wilt virus in Pseudostellaria heterophylla by duplex RT-PCR. 786 Acta Horticulturae Sinica,2017,44 (4): DAS-ELISA TuMV 和 BBWV 的 DAS-ELISA 检测试剂盒均购自 Agdia 公司具体操作步骤参照试剂盒说明书, 试验设置阴性对照阳性对照和空白对照 1.3 引物设计根据 GenBank 数据库中的 TuMV BBWV cp 核苷酸序列的保守区域, 采用 Primer 5.0 软件分别设计 2 种病毒的简并引物各 1 对引物设计时尽可能保证各检测引物退火温度一致, 不同病毒的扩增片段长度相差 200 bp 以上引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成引物名称序列长度和预期目的片段大小见表 1 引物名称 Primer name TuMV-F TuMV-R BBWV-F BBWV-R 表 1 引物名称序列长度和预期目的片段大小 Table 1 Primer name,sequence,length and predicted product size 引物序列 (5 3 ) Primer sequence AGGTGAAAYGCTTGATGCAGGTY GTTHCCATCCARKCCGAACAAAT TTGGGHTCWAGYYTGGGACGYTTRT TTRTARAACTTCTTGCTCCCACGM 引物长度 /bp Primer length 预期目的片段大小 /bp Predicted target fragment size 总 RNA 的提取按照说明书, 采用 Trizol 试剂 (Invitrogen) 提取太子参叶片总 RNA 采用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整性, 采用核酸测定仪测定其纯度和浓度, 用于 cdna 第 1 链的合成 1.5 单一 RT-PCR 取病叶总 RNA 5 μg, 采用 RevertAid First Strand cdna Synthesis Kit(Fermentas) 进行 cdna 第一链的合成以反转录产物为模板, 分别采用 TuMV 和 BBWV 的相应简并引物进行 PCR 扩增, 并观察不同循环次数不同退火温度对扩增效果的影响 PCR 反应体系为 :cdna 模板 1 μl; 上下游引物各 1 μl(10 μmol L -1 );2 Taq PCR Master Mix 12.5 μl; 加 H 2 O 至总体积 25 μl PCR 扩增条件为 :94 预变性 4 min;94 变性 30 s, 不同温度退火 30 s,72 延伸 1 kb min -1 ; 共 30 ~ 35 个循环 ; 最后 72 延伸 10 min PCR 扩增所采用的试剂为 2 Taq PCR Master Mix(TianGen) 取 3 μl PCR 扩增产物进行琼脂糖 (1%) 电泳检测, 在紫外灯下观察条带亮度以确定最佳循环数和最佳退火温度采用 DNA 快速纯化回收试剂盒 (Solarbio) 回收目的片段, 以 pmd-18t(takara) 连接载体, 转化大肠杆菌 (DH5α) 感受态 (TianGen), 阳性克隆子送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序 1.6 双重 RT-PCR 在单一 RT-PCR 体系的基础上, 以复合感染 TuMV 和 BBWV 的太子参病叶样品 cdna 原液适量稀释后作为模板, 进行双重 RT-PCR 扩增, 并对 PCR 反应的退火温度和引物浓度 ( 终浓度 ) 进行优化设置退火温度和 57, 设置引物浓度和 0.6 μmol L -1 PCR 扩增产物于 1% 琼脂糖凝胶中进行电泳, 凝胶成像仪下观察并记录结果 1.7 灵敏度测定与供试样品检测将复合感染 TuMV 和 BBWV 的太子参病叶样品 cdna 原液按 10 倍梯度进行稀释, 依次稀释为

匡云波, 陈满足, 陆伊荣, 陈晶, 叶祖云. 太子参芜菁花叶病毒和蚕豆萎蔫病毒的双重 RT-PCR 检测. 园艺学报,2017,44 (4):784 791.

1 单一 RT-PCR 扩增当循环次数设为 35 时, 电泳观察到 PCR 扩增所得到的目的条带特异性强, 且明显比 30 个循环时更亮 ( 图 1) TuMV 在退火温度为 51 ~ 60 的 PCR 扩增效果差异不大, 均能扩增得到 1 条明亮清晰约为 775 bp 的特异性条带, 符合预期目的条带大小 ( 图 2) 而 BBWV 在退火温度为 51 ~ 57 的 PCR 扩增条带明亮清晰

4 匡云波, 陈满足, 陆伊荣, 陈晶, 叶祖云. 太子参芜菁花叶病毒和蚕豆萎蔫病毒的双重 RT-PCR 检测. 园艺学报,2017,44 (4): 原液的 10-1 ~ 10-5 倍, 进行双重 RT-PCR 扩增, 用于灵敏度测定应用建立的双重 RT-PCR 方法, 对不同产地的太子参病叶样品和采用不同方法脱毒后的太子参组培苗样品进行病毒检测以健康太子参样品的 cdna 作为阴性对照 2 结果与分析 2.1 单一 RT-PCR 扩增当循环次数设为 35 时, 电泳观察到 PCR 扩增所得到的目的条带特异性强, 且明显比 30 个循环时更亮 ( 图 1) TuMV 在退火温度为 51 ~ 60 的 PCR 扩增效果差异不大, 均能扩增得到 1 条明亮清晰约为 775 bp 的特异性条带, 符合预期目的条带大小 ( 图 2) 而 BBWV 在退火温度为 51 ~ 57 的 PCR 扩增条带明亮清晰特异, 扩增片段长度约为 bp, 与预期目的片段大小一致 ( 图 3) 将测序得到的 cdna 片段的核苷酸序列及其推导的氨基酸图 1 30 和 35 次循环条件下 TuMV 的单一 RT-PCR 扩增 Fig. 1 Amplification of TuMV by single RT-PCR using 30 and 35 cycles 序列在 NCBI 的 GenBank 数据库中在线进行 Blast, 结果显示与其他植物 TuMV 和 BBWV cp 基因在核苷酸序列和氨基酸序列上均具有很高的同一性, 表明所得片段为太子参 TuMV 和 BBWV 的部分序列 ( 匡云波等,2016,2017) 图 2 不同退火温度下 TuMV 的单一 RT-PCR 扩增 Fig. 2 Amplification of TuMV by single RT-PCR using different annealing temperatures 图 3 不同退火温度下 BBWV 的单一 RT-PCR 扩增 Fig. 3 Amplification of BBWV by single RT-PCR using different annealing temperatures 2.2 双重 RT-PCR 扩增体系的优化从图 4 中可以看出, 双重 PCR 在 3 种不同的引物终浓度下, 均能扩增到目的条带, 但在 0.2 μmol L -1 条件下条带较暗, 而在 0.4 和 0.6 μmol L -1 条件下扩增效果良好, 且无明显差异从图 5 中可以看出, 双重 PCR 在退火温度为 51 ~ 57 之间的扩增效果较好, 差异不明显, 均能扩增得到 2 条明亮清晰的目的条带, 大小分别为和 775 bp, 且未出现非特异扩增产物选取 51 为最佳退火温度,0.4 μmol L -1 为最佳引物终浓度

Kuang Yunbo,Chen Manzu,Lu Yirong,Chen Jing,Ye Zuyun. Detection of Turnip mosaic virus and Broad bean wilt virus in Pseudostellaria heterophylla by duplex RT-PCR.

4 Amplification of TuMV and BBWV by duplex RT-PCR using different concentrations of primers 图 5 不同退火温度下 TuMV BBWV 的双重 RT-PCR 扩增 Fig.

2.2 灵敏度检测分析以健康太子参样品的 cdna 为阴性对照, 将复合感染 TuMV 和 BBWV 的太子参病叶样品 cdna 原液适量稀释后作为模板, 采用双重 RT-PCR 法进行 TuMV 和 BBWV 灵敏度检测试验由图 6 可知,2 种病毒在 cdna 稀释至原液的 10-4 倍后仍能扩增出特异条带, 但稀释至 10-3 倍后条带已较弱 2.

5 Kuang Yunbo,Chen Manzu,Lu Yirong,Chen Jing,Ye Zuyun. Detection of Turnip mosaic virus and Broad bean wilt virus in Pseudostellaria heterophylla by duplex RT-PCR. 788 Acta Horticulturae Sinica,2017,44 (4): 图 4 不同引物浓度下 TuMV BBWV 的双重 RT-PCR 扩增 Fig. 4 Amplification of TuMV and BBWV by duplex RT-PCR using different concentrations of primers 图 5 不同退火温度下 TuMV BBWV 的双重 RT-PCR 扩增 Fig. 5 Amplification of TuMV and BBWV by duplex RT-PCR using different annealing temperatures 灵敏度检测分析以健康太子参样品的 cdna 为阴性对照, 将复合感染 TuMV 和 BBWV 的太子参病叶样品 cdna 原液适量稀释后作为模板, 采用双重 RT-PCR 法进行 TuMV 和 BBWV 灵敏度检测试验由图 6 可知,2 种病毒在 cdna 稀释至原液的 10-4 倍后仍能扩增出特异条带, 但稀释至 10-3 倍后条带已较弱 2.3 双重 RT-PCR 方法在太子参样品病毒检测中的应用图 6 双重 RT-PCR 扩增的灵敏度分析 M:Marker;1 ~ 5:cDNA 浓度分别为原液的和 10-5 倍 ;6: 阴性对照 Fig. 6 Sensitivity analysis of duplex RT-PCR M:Marker;1 5:10-1,10-2,10-3,10-4 and 10-5 serial dilutions of the first strand cdna respectively;6:negative control. 从图 7 中可见, 在 7 份来自于不同产地的栽培太子参样品中, 有 5 份样品复合感染了 TuMV 和 BBWV,1 份感染了 TuMV,1 份感染了 BBWV; 而采用 2 种方法进行脱毒处理的 4 份太子参组培苗均未检测出病毒, 与单一 RT-PCR 的扩增结果一致结果表明, 应用建立的双重 RT-PCR 检测方法可稳定准确地同时检测单一或复合侵染的 2 种太子参病毒 ; 显示了采用种胚脱毒和茎尖脱毒这 2 种方法对太子参进行脱毒处理效果良好图 7 太子参样品的双重 RT-PCR 病毒检测结果 1: 阴性对照 ;2 ~ 4: 福建病样 ;5 ~ 8: 依次为江苏湖南贵州和山东病样 ;M:Marker; 9 ~ 11: 种胚脱毒的组培苗 ;12: 茎尖脱毒的组培苗 Fig. 7 Detection of TuMV and BBWV simultaneously in P. heterophylla samples by duplex RT-PCR 1:Negative control;2 4:Samples from Fujian;5 8:Samples from Jiangsu,Hunan,Guizhou,Shandong respectively; M:Marker;9 11:Virus-free test-tube plantlets from embryo culture;12:virus-free test-tube plantlets from shoot-tip culture.

6 匡云波, 陈满足, 陆伊荣, 陈晶, 叶祖云. 太子参芜菁花叶病毒和蚕豆萎蔫病毒的双重 RT-PCR 检测. 园艺学报,2017,44 (4): 讨论目前对于太子参病毒病尚无有效的防治措施应用现代生物技术开展太子参的脱毒快繁及工厂化育苗可有效减少病毒病带来的经济损失 ( 朱艳等,2005; 吴朝峰等,2006) 然而采用各种方法获得的脱毒苗均必须经过严格的检测确定脱毒后才能推广应用因此, 建立简便快速高效的太子参病毒检测方法, 是进行太子参无病毒种苗的产业化标准化规模化生产的首要条件目前已报道的用于太子参病毒的传统检测方法有指示植物法 ELISA 法和电子显微镜观察法 ( 刘清琪和陈棣华,1983; 宋荣浩和濮祖芹,1991; 陆家云,1995; 黄勇毅和林丛发,2004) 这些方法在一定程度上均具有各自的局限性特别是, 近年来各太子参产地存在 TuMV 和 BBWV 复合侵染的情况, 而现有的检测方法 1 次只能检测 1 种病毒 ( 黄颖桢等,2016) 本研究中建立了能同时检测 TuMV 和 BBWV 的高灵敏度的双重 RT-PCR 快速分子检测体系,cDNA 稀释至原液的 10-4 倍时仍能扩增出特异性条带, 应用其对不同产地栽培太子参病样和脱毒苗样品进行病毒检测, 与单一 RT-PCR 的扩增结果一致这为田间太子参病毒病的早期监测预警及有效防控提供重要的技术支持多重 RT-PCR 是在同一反应体系中对多个病毒进行特异性扩增, 并非单一 RT-PCR 简单混合, 需要针对引物反应体系反应程序进行综合优化和反复试验, 才能使多重 RT-PCR 检测体系达到稳定状态 ( 张威等,2014) 引物设计是关键( 郑轩等,2011; 沈建国等,2016), 既要使引物具有特异性, 又要避免引物之间的相互作用而影响扩增效率本研究中根据 TuMV 和 BBWV cp 基因的保守序列各设计了 2 对引物, 可以配置成 4 种引物组合, 通过多重 RT-PCR 最终筛选得到 1 个引物组合, 其 DNA 熔解温度相近目的条带特异且能明显区分循环数和退火温度是影响多重 RT-PCR 的重要因素 ( 沈建国等,2016) 本研究中先利用单一 RT-PCR 对循环数和退火温度进行初步优化, 然后再进一步建立和优化 2 种病毒的双重 RT-PCR 体系, 效果良好 References Dai J,Cheng J,Huang T,Zheng X,Wu Y A multiplex reverse transcription PCR assay for simultaneous detection of five tobacco viruses in tobacco plants. J Virol Methods,183 (1): Dan M,Li S,Yu K X,Liu L M,Liu H J,Dai Y M Detection of ratoon stunting disease in virus-free seedcane of Saccharum officinarum by PCR. Agricultural Science & Technology,11 (11 12): Ding Fang,Cao Qing,Wang Guo-ping,Yi Gan-jun,Zhong Yun Studies on the simultaneous detection of Citrus Huanglongbing Pathogen, Citrus exocortis viroid,citrus tristeza virus by multiplex RT-PCR. Acta Horticulturae Sinica,33 (5): (in Chinese) 丁芳, 曹庆, 王国平, 易干军, 钟云柑橘黄龙病裂皮病和衰退病病原的多重 RT-PCR 检测. 园艺学报,33 (5): Fan Xu-dong,Dong Ya-feng,Zhang Zun-ping,Ren Fang,Li Ya-hui Multiplex RT-PCR for simultaneous detection of four grapevine viruses. Acta Horticulturae Sinica,39 (5): (in Chinese) 范旭东, 董雅凤, 张尊平, 任芳, 李亚惠葡萄 4 种病毒多重 RT-PCR 检测体系的建立. 园艺学报,39 (5): Gao Wei,Zhang Jing-shui,Zhang Jian-hong,Zhang Li-ren Detection and control of Taizishen mosaic virus. Virologica Sinica,8 (4): (in Chinese) 高玮, 张敬水, 张建红, 张立人太子参花叶病毒的检测与防治. 中国病毒学,8 (4): Ge B,Li Q,Liu G,Lu M,Li S,Wang H Simultaneous detection and identification of four viruses infecting pepino by multiplex RT-PCR. Arch Virol,158 (6):

7 Kuang Yunbo,Chen Manzu,Lu Yirong,Chen Jing,Ye Zuyun. Detection of Turnip mosaic virus and Broad bean wilt virus in Pseudostellaria heterophylla by duplex RT-PCR. 790 Acta Horticulturae Sinica,2017,44 (4): Huang Ying-zhen,Chen Jing-ying,Zhu Jing-hua,Liu Bao-cai,Zhao Yun-qing RT-PCR detection of Turnip mosaic virus on Pseudostellaria heterophylla. Fujian Journal of Agricultural Sciences,31 (6): (in Chinese) 黄颖桢, 陈菁瑛, 朱景花, 刘保财, 赵云青太子参中芜菁花叶病毒的 RT-PCR 检测. 福建农业学报,31 (6): Huang Yong-yi,Lin Cong-fa Occurrence and control of Taizisheng(Pseudostellaria heterophylla)virus diseases in Mindong. Journal of Ningde Teachers College(Natural Science),16 (1): (in Chinese) 黄勇毅, 林丛发闽东太子参花叶病发病规律调查及防治途径研究. 宁德师专学报 ( 自然科学版 ),16 (1): Jin Jing,Fu Xiang,Shen Jian-guo,Cai Wei,Mei Chen,Gao Fang-luan,Wu Zu-jian Simultaneous detection of Narcissus yellow stripe virus, Narcissus degeneration virus and Narcissus mosaic virus by multiplex RT-PCR. Journal of Fujian Agriculture and Forestry University(Natural Science Edition),44 (5): (in Chinese) 金晶, 付翔, 沈建国, 蔡伟, 梅晨, 高芳銮, 吴祖建利用多重 RT-PCR 检测水仙黄条病毒水仙退化病毒和水仙花叶病毒. 福建农林大学学报 ( 自然科学版 ),44 (5): Kuang Yun-bo,Ye Wei,Li Jin-hui,Yu Jing-jing,Ye Zu-yun Genetic polymorphism and phylogenetic analysis of Broad bean wilt virus 2 cp genes isolated from Pseudostellaria heterophylla. Acta Phytopathologica Sinica,47 (4):1 13. (in Chinese) 匡云波, 叶炜, 李金辉, 于静静, 叶祖云太子参蚕豆萎蔫病毒 2 号 cp 基因的遗传多样性及分子进化分析. 植物病理学报,47 (4):1 13. Kuang Yun-bo,Ye Wei,Li Jin-hui,Yu Jing-jing,Ye Zu-yun,Lai Zhong-xiong Cloning and sequence difference analysis of coat protein genes of Turnip mosaic virus isolates from Pseudostellaria heterophylla. Chinese Journal of Tropical Crops,37 (10): (in Chinese) 匡云波, 叶炜, 李金辉, 于静静, 叶祖云, 赖钟雄不同产地太子参芜菁花叶病毒 cp 基因的分离与序列差异性分析. 热带作物学报,37 (10): Li F,Zuo R,Abad J,Xu D,Bao G,Li R Simultaneous detection and differentiation of four closely related sweet potato potyviruses by a multiplex one-step RT-PCR. J Virol Methods,186 (1 2): Liu Qing-qi,Chen Di-hua Studies on the identification and control of Taizishen mosaic virus. Journal of Chinese Medicinal Materials, (2): (in Chinese) 刘清琪, 陈棣华太子参花叶病病原及其防治的初步研究. 中药材科技,(2): Lu Jia-yun Medicinal plant diseases. Beijing:China Agriculture Press. (in Chinese) 陆家云药用植物病害. 北京 : 中国农业出版社. Luo Wen-bin,Li Hua-wei,Tang Hao,Qiu Si-xin,Ji Rong-chang,Xu Yong-qing,Liu Zhong-hua,Qiu Yong-xiang Establishment and application of multiplex PCR rapid detection of potato viruses. Acta Horticulturae Sinica,42 (2): (in Chinese) 罗文彬, 李华伟, 汤浩, 邱思鑫, 纪荣昌, 许泳清, 刘中华, 邱永祥马铃薯 5 种病毒多重 PCR 检测技术的建立及应用. 园艺学报,42 (2): Shen Jian-guo,Gao Fang-luan,Cai Wei,Jin Jing,Liao Fu-rong,Wu Zu-jian Multiplex RT-PCR for simultaneous detection of Bean pod mottle virus and Soy bean mosaic virus in imported soybean seeds. Scientia Agricultura Sinica,49 (4): (in Chinese) 沈建国, 高芳銮, 蔡伟, 金晶, 廖富荣, 吴祖建进境大豆种子上菜豆荚斑驳病毒和大豆花叶病毒的多重 RT-PCR 检测. 中国农业科学,49 (4): Shen Jian-guo,Gao Fang-luan,Cai Wei,Yu Wen-tao,Yu Yun,Li Min,Yan Cheng. 2012b. Establishment and application of RT-PCR for detection of Narcissus mosaic virus. Chinese Agricultural Science Bulletin,28 (31): (in Chinese) 沈建国, 高芳銮, 蔡伟, 于文涛, 虞赟, 李敏, 闫诚. 2012b. 水仙花叶病毒 RT-PCR 检测方法的建立及应用. 中国农学通报, 28 (31): Shen Jian-guo,Gao Fang-luan,Yu Yun,Cai Wei,Li Min,Yu Wen-tao,Liao Fu-rong. 2012a. Detection of Narcissus latent virus by RT-PCR. Chinese Journal of Tropical Crops,33 (10): (in Chinese) 沈建国, 高芳銮, 虞赟, 蔡伟, 李敏, 于文涛, 廖富荣. 2012a. 应用 RT-PCR 检测水仙潜隐病毒. 热带作物学报,33 (10): Song A,You Y,Chen F,Li P,Jiang J,Chen S A multiplex RT-PCR for rapid and simultaneous detection of viruses and viroids in

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