李冀, 等. 细菌青霉素结合蛋白 419 了解这一大类蛋白质, 以期发现细菌耐药性的分子机理 1 青霉素结合蛋白概述 1.1 青霉素结合蛋白的发现尽管临床上很早就开始使用抗生素, 但直到 20 世纪 50 年代, 人们才发现青霉素是通过干扰细菌细胞表面结构而发挥作用的到了 60 年代, 细

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妃辉白
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1 生命的化学 418, 2013, 33(4): 生命的化学 2013 年 33 卷 4 期综述细菌青霉素结合蛋白李冀, 杨慧 *, 呼延霆, 叶琳洁, 车速, 李琦, 黄庆生, 尹大川 ( 西北工业大学生命学院空间生物实验模拟技术国防重点实验室, 西安 ) 摘要 : 青霉素结合蛋白 (penicillin binding protein, PBP) 是一类在细菌细胞壁肽聚糖生物合成过程中起重要作用的酶类在聚合过程中, 它主要发挥糖基转移酶肽基转移酶和 D- 丙氨酰 -D- 丙氨酸羧肽酶 (D, D- 羧肽酶 ) 活性 PBP 数量和结构的改变是导致细菌产生 β- 内酰胺类抗生素耐药性的重要原因之一本文对青霉素结合蛋白的分类命名结构功能耐药机制等方面进行了综述关键词 : 青霉素结合蛋白 ; 细菌耐药性 ;β- 内酰胺类抗生素 Penicillin binding proteins of bacteria LI Ji, YANG Hui*, HU Yanting, YE Linjie, CHE Su, LI Qi, HUANG Qingsheng, YIN Dachuan (Key Laboratory for Space Bioscience and Biotechnology, Faculty of Life Sciences, Northwestern Polytechnical University, Xi an , China) Abstract: Penicillin binding proteins (PBPs) of bacteria are peripheral membrane enzymes that catalyze the final steps for the biosynthesis of the essential bacterial cell wall peptidoglycan. Three of these enzymes, including glycosylt ransferase, peptidyltransferase, and D-alany-D-alanine carboxypeptidase play key roles in the process. The alteration in quantities and structures of PBPs is one of the most important reasons resulting in drug-resistance to β-lactan antibiotics in bacteria. In this paper, the classification, structure, function, research methods and molecular mechanisms of drug-resistance are summarized. Key words: penicillin binding protein; drug- resistance of bacteria; β-lactan antibiotics 细菌的细胞壁是细菌细胞构造的重要组成部分, 在细菌维持自身正常形态提高机械强度免受渗透压等外力损伤等方面发挥重要作用肽聚糖分子是细菌细胞壁的主要组成成分, 它是由 N- 乙酰葡糖胺和 N- 乙酰胞壁酸通过 β-1,4 糖苷键相连, 并通过短肽尾连接交织而成的网状结构青霉素结合蛋白 (penicillin binding protein, PBP) 是细菌胞浆膜上的一类膜蛋白, 广泛分布于革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌细胞的表面, 最初因为能够与青霉素共价结合而得名它具有糖基转移酶肽基转移酶和羧肽酶活性, 能够催化肽聚糖聚合和交联, 参与细菌肽聚糖生物合成的末端反应形态维持及调整等功能, 在细菌生长繁殖过程中起重要作用 PBP 种类和含量因细菌种类不同而有所不同, 但不同细菌的 PBP 却又有着相似的结构和功能 PBP 是 β- 内酰胺类抗生素的主要作用靶位, 这类抗生素能专一性地与细菌细胞内膜上的 PBP 结合, 干扰 PBP 的正常酶活性, 从而干扰肽聚糖的合成, 使细胞壁合成受阻, 最终导致细菌死亡 PBP 结构和数量的改变是导致细菌产生耐药性的重要机制之一现阶段, 在医疗卫生等领域对于细菌耐药性问题的应对日益棘手近些年对于青霉素结合蛋白的研究工作广泛深入地开展, 试图从分子水平收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( ); 西北工业大学基础研究基金项目 (JC201277) 第一作者 : 李冀 (1989-), 男, 硕士生, Lj @163.com * 通信作者 : 杨慧 (1981-), 女, 博士, 副教授, kittyyh@163.com

2 李冀, 等. 细菌青霉素结合蛋白 419 了解这一大类蛋白质, 以期发现细菌耐药性的分子机理 1 青霉素结合蛋白概述 1.1 青霉素结合蛋白的发现尽管临床上很早就开始使用抗生素, 但直到 20 世纪 50 年代, 人们才发现青霉素是通过干扰细菌细胞表面结构而发挥作用的到了 60 年代, 细菌细胞壁结构的完全认识对人们发现青霉素结合蛋白和了解青霉素的作用机理打下了坚实的基 [1] 础 1972 年,Suginaka 等首先报道了青霉素结合蛋白, 通过放射性同位素标记青霉素的方法可以检测到细菌表面的 PBP, 它的存在是细菌维持正常形态结构和功能的必要条件, 青霉素等 β- 内酰胺类抗生素正是通过与 PBP 专一性地结合, 抑制细菌细胞壁的合成而导致细菌死亡, 从而发挥其杀菌作用 1.2 青霉素结合蛋白的命名最初,Spratt 和 Pardee 通过 SDS-PAGE 法分离 PBP, 根据 PBP 的泳动速率不同或相对分子质量大小不同, 将各 PBP 分别命名为 PBP1 PBP2 PBP3 等每个菌种都有这样一组特异性的 PBP, 可以称之为 PBP 谱 [2] 进一步研究同一种细菌中不同基因编码的 PBP, 发现其中部分蛋白质具有相似的相对分子质量大小和生理生化特征, 又可以将他们分别命名为 1a 1b 2a 2b 等例如在甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌中, 最早只发现 PBP1 PBP2 PBP3 PBP4 四种青霉素结合蛋白, 另外在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus,mrsa) 中发现还有 PBP2a, 后来研究证明金黄色葡萄球菌中还含有一种与 PBP2 相对分子质量相近的青霉素结合蛋白, 命名为 PBP2b 1.3 青霉素结合蛋白的分类各种细菌细胞膜上的 PBP 数量相对分子质量结构和对 β- 内酰胺类抗生素的敏感性互不相同, 根据这些不同可将 PBP 进行分类 ( 表 1) 另外, 分类学上相近的细菌, 其 PBP 类型及生理功能也具有一定相似性分类依据对 b- 内酰胺类抗生素敏感性相对分子质量大小及其氨基酸序列相似程度与细菌生理功能的关系表 1 PBP 的分类类型 (1) 对青霉素头孢霉素均敏感的 PBP (2) 对青霉素敏感稍差的 PBP (1)A 型高相对分子质量 PBP (2)B 型高相对分子质量 PBP (3) 低相对分子质量 PBP (1) 细菌生长必需蛋白类 PBP (2) 细菌生长非必需蛋白类 PBP 根据细菌对不同种类 β- 内酰胺类抗生素的敏感性, 可将 PBP 大致分为两类 :(1) 对青霉素和头孢霉素均敏感的 PBP, 其相对分子质量较高 (59 500~ ), 羧基末端为青霉素结合域, 催化青霉素敏感的肽聚糖转肽酶反应, 氨基末端催化青霉素不敏感的肽聚糖转糖基酶反应 (2) 对青霉素敏感性稍差, 但对大多数头孢霉素敏感的 PBP, 相对分子质量较低 (24 800~34 700), 一般为 D- 丙氨酰 -D- 丙氨酸羧肽酶, 如大肠杆菌的 PBP5 PBP6 等根据 PBP 相对分子质量大小及其氨基酸序列相似程度, 可将 PBP 分为 A 型高相对分子质量 PBP B 型高相对分子质量 PBP 和低相对分子质量 PBP 三类 A 型高相对分子质量 PBP 是一类具有双重酶活性的 PBP, 其 N 末端具有糖基转移酶的活性, 而其 C 末端具有肽基转移酶的活性 ;B 型高相对分子质量 PBP 只有肽基转移酶的活性, 可能在维持细胞形态方面发挥作用 ; 低相对分子质量 PBP 普遍有 D- 丙胺酰 -D 丙氨酸羧肽酶的活性, 可催化 D- 丙氨酰 -D- 丙氨酸间的肽链断裂, 在肽聚糖交联过程中起重要作用 [3] 如枯草芽孢杆菌中主要有 16 个 PBP, 按

420 生命的化学 2013 年 33 卷 4 期综述序列相似性划分它们包括 4 个 A 型高相对分子质量 PBP,6 个 B 型高相对分子质量 PBP 和 6 个低相对分子质量 PBP 它们在肽聚糖合成细胞形态芽孢形成和芽孢萌发方面有着各种作用 [4-6] 另外, 根据与细菌生理功能的关系可将 PBP 分为细菌生长必需蛋白和细菌生长非必需蛋白例如目前研究较多的金黄色葡萄球菌,

3 420 生命的化学 2013 年 33 卷 4 期综述序列相似性划分它们包括 4 个 A 型高相对分子质量 PBP,6 个 B 型高相对分子质量 PBP 和 6 个低相对分子质量 PBP 它们在肽聚糖合成细胞形态芽孢形成和芽孢萌发方面有着各种作用 [4-6] 另外, 根据与细菌生理功能的关系可将 PBP 分为细菌生长必需蛋白和细菌生长非必需蛋白例如目前研究较多的金黄色葡萄球菌, 其所含有的 PBP1 PBP2 PBP3 PBP4 为其生长必需蛋白, 对于细菌正常生长发育必不可少而 PBP2a 是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌所特有的蛋白质, 为其生长非必需蛋白 2 青霉素结合蛋白的结构和功能 2.1 青霉素结合蛋白的结构利用现代分子生物学生物物理学和生物化学等方法研究 PBP 分子的结构和基因构成, 逐步弄清楚了数种细菌 PBP 的活性中心研究发现大部分细菌 PBP 的活性中心为丝氨酸,β- 内酰胺类抗生素的作用机理正是通过其 β- 内酰胺环中的羧基和细菌对应的 PBP 的丝氨酸羟基共价结合形成丝氨酸脂, 从而抑制细菌细胞壁的生物合成引起细菌死亡, 以此发挥杀菌作用目前, 对于耐甲氧西林型金黄色葡萄球菌的 PBP2a 晶体结构研究较为清楚 PBP2a 含有 668 个氨基酸残基, 相对分子质量 , 其晶体结构主要由三部分组成 :N- 末端跨膜区非青霉素结合蛋白区和转肽酶区 ( 图 1) 前 23 位氨基酸为 N- 末端跨膜区, 可将 PBP2a 锚定与细胞膜表面 ; 水溶性的 PBP2a 是去除了 N- 末端 23 个氨基酸以后蛋白质, 其具有两个功能域 :N- 末端非青霉素结合域,C- 末端 TPase 功能域研究表明 N- 末端负责蛋白质的延伸和锚定,C- 末端则具有 TPase 活性和 β- 内酰胺酶的作用, 其空间结构与其他 PBP 的 TPase 和丝氨酸 β- 内酰胺酶十分相似在转肽酶区内含有低亲和力的 β- 内酰胺类抗生素作用的位点, 因此很少与该类抗生素结合, 当 β- 内酰胺类抗生素与其他 PBP 发生高亲和力地结合时,PBP2a 仍能维持细菌的生长与繁殖, 表现出耐药性 [7] 1.2 青霉素结合蛋白的功能细菌细胞是被肽聚糖骨架包被和保护的肽聚糖在细胞膜质中合成, 然后被转运出细胞膜, 在细胞膜外表面发生聚合这个组装过程的完成图 1 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 PBP2a 分子结构需要一种糖基转移酶的作用使多糖链发生聚合, 和另外一种转肽酶的作用使糖链和肽链发生交联, 两种酶的活性是肽聚糖稳定和细胞分裂过程的基础这两种酶的活性是由一类酶发挥作用的, 即青霉素结合蛋白不同细菌 PBP 的生理生化功能具有一定的相似性, 但不同细菌又都有其特异性的 PBP,PBP 的生理生化功能与其结合青霉素的能力密切相关, 其数量结构的变化会直接影响抗生素的杀菌效果虽然对于 PBP 的生理生化功能已开展了相当长时间的研究工作, 但某些机理问题仍不十分清楚目前研究比较多的是金黄色葡萄球菌大肠杆菌肺炎链球菌和枯草芽胞杆菌等 [7] 示意图目前研究较多的对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌存在 5 种 PBP, 即 PBP1(84 300) PBP2(80 400) PBP3(74 400) PBP4(44 600) 以及 PBP2b PBP2b 是由 pbpf 基因编码, 含有 691 个氨基酸残基, 相对分子质量近年来研究表明, 金黄色葡萄球

4 李冀, 等. 细菌青霉素结合蛋白 421 菌的 PBP1 是一种肽酰转移酶, 在金葡菌细胞周期中 PBP1 起双重作用, 它既是细胞分隔中的必需蛋白, 又是一种在细胞分裂末期产生关键信号的肽酰转移酶, 但 PBP1 在肽聚糖交联过程中不起主要作用 [8,9] PBP2 是细菌合成二聚三聚四聚肽聚糖的转肽酶和转糖基酶,PBP3 是与细菌分裂有关的转肽酶,PBP4 是在肽聚糖二级交联过程中发挥作用的转肽酶另外, 在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中还有一种特殊的 PBP2a PBP2a 约含有 668 个氨基酸, 该蛋白由 meca 基因编码,mecA 是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的主要耐药基因 PBP2a 与 β- 内酰胺类青霉素的结合能力较差, 可替代高亲和力的 PBP 行使功能, 维持细菌细胞肽聚糖的稳定, 使细菌正常生长繁殖, 表现出耐药性 [10] 大肠杆菌含有 8 种 PBP, 包括 PBP1~PBP8 [11], 各 PBP 的功能如表 2 所示大肠杆菌 PBP1 的主要功能是维持细胞的形态, 分为 PBP1a 和 PBP1b PBP1 主要分布于细胞内膜, 与抗生素结合可导致细胞裂解 PBP1a 是细菌生长非必需蛋白, 不能独立维持细菌存活 PBP1b 是一种球蛋白, 有两个酶活性区域, 一个是转肽酶活性区, 另一个是转糖基酶活性区 PBP1b 的缺失会损害大肠杆菌生物膜的形成及其运动性 [12] PBP1a 和 PBP1b 与细菌生长有关, 青霉素氨苄西林等与它们有高度的亲和力, 会使细菌生长繁殖受到抑制, 导致细菌死亡 PBP2 能维持大肠杆菌的张力, 使细菌维持杆棒状, 能与美西林棒酸与硫霉素 ( 亚胺培南 ) 选择性结合, 使细胞形成大圆细胞, 在繁殖几代后死亡有实验证明在缺乏 PBP2 基因的菌株中, 细菌依然能够存活并正常分裂繁殖 PBP3 与细菌分裂有关 DNA 复制完成后 PBP3 被激活, 并催化羧基酶反应, 产生细菌分裂必须的肽聚糖合成反应 PBP3 功能与 PBP1a 类似, 但含量较少, 多数青霉素类或头孢霉素类抗生素与 PBP1 或 PBP3 结合, 形成丝状体和球形体, 使细菌发生萎缩, 溶解死亡 PBP4 同时具有羧肽酶和内肽酶活性缺乏 PBP4 的菌株依然可以存活, 说明 PBP4 不是 β- 内酰胺类抗生素的主要作用靶位 PBP5 具有羧肽酶活性, 缺乏 PBP5 的菌株对于一些抗生素极其敏感 [13] PBP5 的羧基末端具有稳定蛋白质的作用 PBP6 不具有羧肽酶活性, 但在细菌静止期有稳定肽聚糖结构的作用 [14] PBP4 PBP5 PBP6 对细菌生存繁殖无重要性, 抗生素与之结合后, 对细菌无影响对于 PBP7 的研究发现, 在将 PBP7 基因敲除后, 细菌无明显的生长缺陷, 证明 PBP7 在正常实验室条件下不是细菌生长的必要条件研究还发现 PBP7 和它的降解产物 PBP8, 都有 D, D- 内肽酶的活性, 可以特异性分解一些细胞质壁间的肽键 [15] 另外, 沙门氏菌铜绿假单胞克雷伯氏菌等的 PBP 类型和大肠杆菌具有很高的相似度表 2 大肠杆菌 PBP 的种类及功能种类主要功能 PBP1 维持细胞的形态 PBP2 维持大肠杆菌的张力, 使细菌维持杆棒状 PBP3 与细菌分裂有关 PBP4 具有羧肽酶和内肽酶活性 PBP5 其羧基末端具有稳定蛋白质的作用 PBP6 在细菌静止期有稳定肽聚糖结构的作用 PBP7 有 D,D- 内肽酶的活性, 不是细菌生长必须条件 PBP8 PBP7 降解产物, 也具有 D, D- 内肽酶的活性有研究发现肺炎链球菌共有 6 种 PBP, 它们分别是 PBP1a PBP1b PBP2a PBP2x PBP2b 和 PBP3 对抗生素敏感的肺炎链球菌 PBP-1a/1b PBP-2a/2x/2b 都很容易与 β- 内酰胺类抗生素结合而达到杀菌的目的 [16] 而肺炎链球菌耐药株 4 个相对分子质量较大的 PBP1a PBP2x PBP2a 和 PBP2b 与青霉素的亲和力明显降低, 这 4 个 PBP 是 β- 内酰胺类抗生素作用的致命靶点 [17,18] 肺炎链球菌对青霉素耐药是多基因逐步变异累加的结果, 其中 PBP1a PBP2x 和 PBP2b 起主要作用,PBP2x 和 PBP2b 为原耐药抗性决定簇, 它们的变异可导致低水平耐药, 而当 PBP1a 发生变异时通常导致高水平耐药 [19] 研究显示由镶嵌基因导致的低亲和力 PBP2x 和 PBP1a 是产生高水平头孢噻肟耐药的主要原因 [20] 在枯草芽孢杆菌中主要有 16 种 PBP, 按相对分子质量和序列相似性可划分为 :4 种 A 型高相对分子质量 PBP,6 种 B 型高相对分子质量 PBP 和 6 种低相对分子质量 PBP 它们在肽聚糖合成细胞形

5 422 生命的化学 2013 年 33 卷 4 期综述态芽孢形成和芽孢萌发等方面起各种作用 4 种 A 型 PBP 分别是 PBP1 PBP2c PBP4 和 PBP2d 其中 PBP1 的缺失将引起细菌繁殖体生长率下降和芽孢生长量减少 [4] 有研究表明 PBP2d 在细菌繁殖体肽聚糖合成中无明显作用, 其编码的蛋白只在前芽孢中存在 PBP2c 在繁殖体和芽孢中均有发现 B 型 PBP 在维持细胞形态方面发挥特殊作用, 与大肠杆菌 PBP3( 由 ftsi 编码 ) 基因序列的相似性使它具有与其相似的功能与大肠杆菌的 PBP2 类似, 枯草芽孢杆菌 PBP2a( 由 pbpa 编码 ) 也具有维持细菌杆状形态的功能, 它在芽孢生长时从椭圆形孢子形成杆状细胞的过程中发挥重要作用 spovd 的产物是 B 型 PBP, 它在芽孢肽聚糖合成方面有重要作用另外两个 B 型 PBP 的编码基因 ykua 和 yrrr 的作用尚未确定低分子质量 PBP 为 D- 丙氨酰 -D- 丙氨酸羧肽酶, 转肽时有催化 D- 丙氨酰 -D- 丙氨酸间的肽链断裂的作用 [6] 3 青霉素结合蛋白作用机制及其与细菌耐药性的关系 3.1 抗生素与 PBP 的作用 β- 内酰胺类抗生素能专一性与细菌细胞膜上的 PBP 结合, 干扰 PBP 合成肽聚糖, 使细胞壁形成受阻不同的 β- 内酰胺类抗生素与不同的 PBP 结合, 会引起细菌自溶, 形成球形体, 最终使细菌停止分裂后来研究发现 PBP 也能与非 β- 内酰胺类抗生素结合 [21] PBP 的主要功能是利用糖基转移酶肽基转移酶和羧肽酶活性, 催化肽聚糖聚合和交联, 参与细菌肽聚糖生物合成的末端反应形态维持及调整等如图 2 所示,β- 内酰胺类抗生素的 β- 内酰胺环与细菌 D- 丙氨酰 -D- 丙氨酸末端有相似结构, 能与 D- 丙氨酰 -D- 丙氨酸竞争 PBP 的活性位点, 且比 D- 丙氨酰 -D- 丙氨酸与 PBP 的亲和性更高, 它通过 β- 内酰胺环的羧基和细菌相应的 PBP 中的丝氨酸羟基共价结合形成丝氨酸脂, 干扰 PBP 的正常酶活性, 从而干扰肽聚糖的合成, 使细胞壁合成受阻, 最终导致细菌死亡, 从而达到杀菌的目的 [22] 3.2 不同 PBP 与各类抗生素的结合能力不同的抗生素可与不同的 PBP 结合, 即使是同一抗生素对于不同细菌也是作用于不同的 PBP 上作用于同一 PBP 靶位的抗生素联合使用会产生相互拮抗作用, 作用于不同 PBP 的 β- 内酰胺类抗生素在联用时可产生协同作用 [23] 不同抗生素与 PBP 的亲和力可以用 I 50 来表示, I 50 指使 14 C- 青霉素 G 结合减少 50% 时该抗生素浓度, 其值越高, 表示亲和力越小不同 PBP 对青霉素的敏感性用最小抑 [22] 图 2 青霉素阻碍 PBP 正常合成肽聚糖

6 李冀, 等. 细菌青霉素结合蛋白 423 菌浓度 (minimum inhibitory concentration, MIC) 表示,MIC 指能够抑制细菌生长繁殖的最低药物浓度通过比较大肠杆菌各 PBP 与美西林头孢氨苄头孢拉定三种抗生素的结合能力 ( 表 3), 我们可以发现美西林可 PBP2 特异性结合, 而头孢氨苄头孢拉定与 PBP1a 亲和力较高, 如果美西林与头孢氨苄和头孢拉定中其中一种抗生素联用, 将起到很好的协同作用 [23] 比较金黄色葡萄球菌各 PBP 与青霉素 G 美洛西林美西林头孢噻吩头孢噻肟氨曲南六种抗生素的结合能力 ( 表 4), 我们可以发现氨曲南与各 PBP 亲和力均较小, 青霉素 G 美洛西林头孢噻吩头孢噻肟与 PBP1 PBP2 PBP3 亲和力较好, 而美西林只与 PBP3 有很好的亲和力 [24] 3.3 细菌对 β- 内酰胺类抗生素的耐药机制关于细菌耐药基因的来源不同科学家分歧较大, 有人赞同基因突变, 有人赞同通过不同菌株之间的基因转移 [23] 表 3 不同抗生素与大肠杆菌 PBP 的结合能力 PBP I50 (μg/ml) 美西林头孢氨苄头孢拉定 1a > b > >500 >300 3 > > >300 5 >500 >500 >300 6 >500 >500 >300 MIC (μg/ml) 目前关于细菌对 β- 内酰胺类抗生素耐药机制的观点主要有四种, 可概括为 :(1) 细菌细胞壁或外膜通透性改变, 使抗生素不能够进入菌体, 到达作用靶位研究表明, 大肠杆菌外膜有亲水性的非特异性孔道蛋白, 为三聚体结构, 有两个孔道蛋白, 即 OmpF 和 OmpC, 很多重要的 β- 内酰胺类抗生素是通过 OmpF 进入菌体内的大肠杆菌的突变株,OmpF 和 OmfC 含量明显减少, 对头孢唑啉头孢噻吩的投入也较野生株成倍降低,MIC 也明显增高, 出现耐药绿脓杆菌耐亚胺培南的突变株已证明是由于外膜缺失一种特异性通道蛋白 OprD, 如果将 OprD 重组于缺陷菌株外膜蛋白中, 又可使亚胺培南通透性大大增加, 于是耐药性消除 (2) 细菌产生 β- 内酰胺酶, 如青霉素酶头孢霉素酶等, 作用于 β- 内酰胺类抗生素, 使其水解失活, 从而产生耐药性另外,β- 内酰胺酶有另外一种非水解机制牵制机制, 即抗生素不是被 β- 内酰胺酶水解, 而是由于抗生素与大量的 β- 内酰胺酶结合牢固, 使其留在细胞膜间隙中, 不能进入 PBP 靶位, 产生耐药性 (3)PBP 的含量变化或与青霉素亲和力降低, 都会使抗生素失去抗菌作用 (4) 由于细菌缺少自溶酶, 对抗生素有天然的抵制作用, 从而产生耐药性, 但效果较差 3.4 PBP 的改变使细菌产生耐药性 PBP 的改变是细菌对 β- 内酰胺类抗生素产生耐药性的重要原因之一, 可分为以下几种类型 :(1) PBP 含量会发生变化 ;(2)PBP 与 β- 内酰胺类抗生素的亲和力降低 ;(3) 细菌产生缓慢结合的 PBP;(4) 产生不依赖 β- 内酰胺酶存在而对 β- 内酰胺类抗生素耐药的诱导性 PBP 的出现常见的 PBP 介导的耐药性细菌有 : 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐青霉表 4 不同抗生素与金黄色葡萄球菌 PBP 的结合能力 PBP I50 (μg/ml) 青霉素 G 美洛西林美西林头孢噻吩头孢噻肟氨曲南 > > > >100 4 >100 >100 > >100 >100 MIC(μg/ml) >100

7 424 生命的化学 2013 年 33 卷 4 期综述素肺炎球菌 (penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae, PRSP) 等现在对 PBP 耐药机制研究得比较多的是金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌有 5 种 PBP, 即 PBP1 PBP2 PBP3 PBP4 以及 PBP2b 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是一种具有多重耐药性的细菌, 其耐药机制是其 PBP 的改变高度耐药性是由于原有的 PBP2 与 PBP3 之间产生一种新的 PBP2a, 低中度耐药性是由于 PBP 的产量增多或与甲氧西林等的亲和力下降所致近些年来的研究表明, 由 meca 基因编码的 PBP2a 是耐甲氧西林型金黄色葡萄球菌产生耐药性的主要原因在无抗生素存在情况下, PBP2 和 PBP4 的转肽酶共同参与细胞壁的合成, PBP2 的转肽酶负责合成二聚三聚四聚肽聚糖,PBP4 的转肽酶负责将他们进行交联, 最终形成高度交联的肽聚糖在 β- 内酰胺类抗生素存在的情况下, 抗生素会抑制 PBP2 的转肽酶活性, 而 meca 基因编码的 PBP2a 与青霉素结合能力较差, 不受影响, 其转肽酶可代替 PBP2 的转肽酶行使功能, 合成肽聚糖, 维持耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的正常繁殖, 从而使细胞产生了耐药性 [25] 金黄色葡萄球菌的耐药主要决定基因为 meca meca 编码的 PBP2a 对 β- 内酰胺类抗生素亲和力很低, 当其他 PBP 蛋白与 β- 内酰胺类抗生素紧密结合时,PBP2a 可以代替这些 PBP 行使功能, 催化细胞壁合成 MecA 基因全长约 2.1 kb, 其序列在不同的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株和其他耐药菌株中相当保守在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株中,mecA 的表达主要受其调控系统 mecr1 和 meci 控制 [26] 在没有抗生素存在的情况下, 由 meci 编码的抑制子结合到 meca 的启动子区, 阻止 meca 的转录和翻译, 因此在正常情况下 PBP2a 的表达量很低 ; 在 β- 内酰胺类抗生素的压力下,mecR1 在跨膜信号的刺激下, 自身活化, 活化的 mecr1 具有金属蛋白酶的作用, 从而对结合在 meca 启动子区的 MecI 抑制子发挥剪切作用, 使 MecI 失活, 而促进 meca 的表达敏感菌株转变为耐药菌株可以通过 MecI 的失活或丢失, 以及 meca 操纵子区发生突变等机制实现 [27] MecA 基因并非金黄色葡萄球菌的固有基因, 而是一个外源的基因, 来源有很多假说, 目前认为是从松鼠葡萄球菌中获得 meca 在细菌间传播由转座子介导, 除金黄色葡萄球菌外, 溶血葡萄球菌表皮葡萄球菌也可获得 meca 基因而耐受 β- 内酰胺类药物由于针对肺炎双球菌的感染使用抗生素的历史较长, 使得一些菌株产生了较高的耐药性 [18] Contreras-Martel 等通过对 PBP1a 的序列和晶体结构的分析发现, 在肺炎双球菌的 PBP1a 存在突变热点, 此突变可导致 PBP1a 活性位点的极性和可达性改变这个发现将是研制用于治疗耐药性肺炎双球菌感染的新型抗生素的关键在没有药物作用的时候, 抗生素的耐药基因会产生一种适应性缺失, 这种缺失可以通过补偿性突变得以恢复例如引起肺炎链球菌对 β- 内酰胺类抗生素产生耐药性的 PBP1a 和 PBP2x 可以通过突变的方式使细菌的适应性缺失和细胞分裂障碍得以恢复 [28] 3.5 β- 内酰胺类抗生素耐药性的克服针对细菌对 β- 内酰胺类抗生素产生的耐药性, 主要有三种措施 :(1) 新药的研发 : 利用细菌功能基因组学和蛋白质组学发现作用于细菌新靶位的新抗生素 ;(2) 对现有的新药进行改造 : 保留原有的细菌靶位的作用, 增强其作用机制, 避免其耐药机制 ;(3) 联合用药 : 作用于不同 PBP 的 β- 内酰胺类抗生素联用是可以产生协同作用的, 对 β- 内酰胺类抗生素进行联用, 药效有比单独用药有明显的提升作用通常青霉素和链霉素联用可以达到很好的抗菌作用针对 β- 内酰胺类抗生素耐药性的克服, 相关研究虽然已取得了很大进展, 但仍有很多耐药菌的机理有待进一步研究近年来, 由于耐药基因的传播和抗菌药物的选择压力使耐药菌大量繁殖, 致病菌的耐药性急剧上升, 高度耐药的菌株不断增多开发药物抑制耐药菌的方法中, 最成功的应该是 β- 内酰胺酶抑制剂与 β- 内酰胺抗生素的联合应用在联合应用的过程中,β- 内酰胺酶抑制剂可以与细菌 β- 内酰胺酶相结合, 使 β- 内酰胺酶无法水解抗生素, 抗生素通过和青霉素结合蛋白的结合, 而继续发挥抗菌作用 PBP 的改变与细菌对 β- 内酰胺类抗生素以及万古霉素等糖肽类抗生素耐药有密切关系, 影响药物作用的靶位, 阻止抗生素的杀菌作用在细菌产生的青霉素酶得到抑制的情况下, 包括青霉素

8 李冀, 等. 细菌青霉素结合蛋白 425 G 阿莫西林氨苄青霉素与 PBP2a 都具有相对较好的亲和力, 可以用于治疗由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌引起的心内膜炎等疾病在此基础上, 瑞典科学家发明了新型的抗 PBP2a β- 内酰胺类抗生素, 可以提供比普通抗生素 10 倍以上的与 PBP2a 的亲和力和较低的最低抑菌浓度, 而且具有一定的青霉素酶抗性 [29] 万古霉素是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的最后一道防线但是, 临床试验表明金黄色葡萄球菌对万古霉素也产生了一定的耐药性所以, 国内外科学家都在积极寻找新的治疗方法, 目前研究较多的策略有对头孢菌素进行结构改造从而直接抗菌还可以细菌耐药基因为靶点, 利用 DNA 疫苗的手段防治耐药菌的感染另外还有科学家通过阻断 mecr1-mecimeca 信号通路中 MecR1 mrna 表达, 使 PBP2a 表达下降的方法, 恢复耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对抗生素的敏感 [30] 科学家发现对于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌引起的感染, 临床耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株中分离的噬菌体可以特异性杀死病原体并展现出很强的活性, 而且对哺乳细胞没有表现出任何细胞毒性影响, 噬菌体治疗被认为是一种未来针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌皮肤感染可行的治疗方法 [31] 另外, 对于噬菌体针对细菌的高效的捕捉能力, 可用于抗生素耐药微生物的快速检测, 这对科学实验和临床诊断有重要意义 [32] 4 结语 PBP 作为细菌肽聚糖合成过程中的主要酶类, 虽然在不同细菌菌株中其种类结构功能略有不同, 但都在细菌细胞壁合成过程中起着至关重要的作用, 其数量结构以及与抗生素亲和力的改变也是细菌 β- 内酰胺类抗生素耐药性的重要机制之一 PBP 单独发挥作用或与 β- 内酰胺酶产生外膜通透性降低等协同发挥作用将导致临床感染治疗的失败因此, 进一步研究 PBP 的结构功能及其相关耐药性机理, 对新药的研制人类疾病的治疗均有重要意义参考文献 [1] Suginaka H, Blumberg PM, Strominger JL. Multiple penicillin-binding components in Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, and Escherichia coli. J Biol Chem, 1972, 247: [2] Spartt BG, Pardee AB. Penicillin-binding proteins and cell shape in E. coli. Nature, 254: [3] Sauvage E, Kerff F, Terrak M, et al. The penicillinbinding proteins: structure and role in peptidoglycan biosynthesis. FEMS Microbiol Rev, 2008, 32: [4] Popham DL, Setlow P. Phenotypes of Bacillus subtilis mutants lacking multiple class A high-molecular-weight penicillin-binding proteins. J Bacteriol, 1996, 178: [5] Pedersen LB, Ragkousi K, Cammett TJ, et al. Characterization of ywhe, which encodes a putative high-molecular weight class A penicillin-binding protein in Bacillus subtilis. Gene, 2000, 246: [6] Popham DL, Setlow P. Cloning, nucleotide sequence, and regulation of the Bacillus subtilis pbpf gene, which codes for a putative class A high-molecular-weight penicillin-binding protein. J Bacteriol, 1993, 175: [7] Lim D, Strynadka NC. Structural basis for the b lactam resistance of PBP2a from methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Nat Struct Biol, 2002, 9: [8] Pereira SF, Henriques AO, Pinho MG, et al. Role of PBP1 in cell division of Staphylococcus aureus. Bacteriology, 2007, 189: [9] Pereira SF, Henriques AO, Pinho MG, et al. Evidence for a dual role of PBP1 in the cell division and cell separation of Staphylococcus aureus. Mol Microbiol, 2009, 72: [10] Gordon RJ, Lowry FD. Pathogenesis of methicillinresistant Staphylococcus aureus infection. Clin Infect Dis, 2008, 46: [11] Denome SA, Elf PK, Henderson TA, et al. Escherichia coli mutants lacking all possible combinations of eight penicillin-binding proteins: viability characteristics, and implications for peptidoglycan synthesis. J Bacteriol, 1999, 181: [12] Kumar A, Sarkar SK, Ghosh D, et al. Deletion of penicillin-binding protein 1b impairs biofilm formation and motility in Escherichia coli. Res Microbiol, 2012, 163: [13] Sarkar SK, Chowdhury C, Ghosh AS. Deletion of penicillin-binding protein 5 (PBP5) sensitizes Escherichia coli cells to β-lactam agents. Int J Antimicrob Ag, 2010, 35: [14] Buchanan CE, Sowell MO. Synthesis of penicillinbinding protein 6 by stationary-phase Escherichia coli. J Bacteriol, 1982, 151:

9 426 生命的化学 2013 年 33 卷 4 期综述 [15] Henderson TA, Templin M, Young KD. Identification and cloning of the gene encoding penicillin-binding protein 7 of Escherichia coli. J Bacteriol, 1995, 177: [16] Reinert RR. The antimicrobial resistance profile of Streptococcus pneumonia. Clin Microbiol Infect, 2009, 15: 7-11 [17] Kearns AM, Graham C, Burdess D, et al. Rapid realtime PCR for determination of penicillin susceptibility in pneumococcal meningitis, including culture-negative cases. J Clin Microbiol, 2002, 40: [18] Contreras-Martel C, Job V, Di Guilmi AM, et al. Crystal structure of penicillin-binding protein 1a (PBP 1a) reveals a mutational hotspot implicated in β-lactam resistance in Streptococcus pneumonia. J Mol Biol, 2006, 355: [19] Izdebski R, Rutschmann J, Fiett J, et al. Highly variable penicillin-resistance determinants PBP 2x, PBP 2b, and PBP 1a in isolates of two Streptococcus pneumoniae clonal groups, poland 23F-16 and poland 6B-20. Antimicrob Agents Chemother, 2008, 52: [20] Zerfass I, Hakenbeck R, Denapaite D. An important site in PBP2x of penicillin-resistant clinical isolates of Streptococcus pneumoniae: mutational analysis of Thr338. Antimicrob Agents Chemother, 2009, 53: [21] Deka RK, Machius M, Norgard MV, et al. Crystal structure of the 47-kDa lipoprotein of Treponema pallidum reveals a novel penicillin-binding protein. J Biol Chem, 2002, 277: [22] Guignard B, Entenza JM, Moreillon P. β-lactams against methicillin-resistance in Staphylococcus aureus. Curr Opin Phamacol, 2005, 5: [23] 吴本权, 唐英春, 张扣兴, 等. 头孢拉定头孢噻肟对 MRSA PBP2a 的诱导作用以及形态耐药性的影响. 中国抗生素杂志, 1999, 24: 440 [24] 周坚芬. 青霉素结合蛋白研究进展. 国外医药抗生素分册, 1996, 17: [25] Katayama Y, Zhang HZ, Chambers HF. PBP 2a mutations producing very-high-level resistance to b-lactams. Antimicrob Agents Chemother, 2004, 48: [26] Wu SW, de Lencastre H, Tomasz A. Recruitment of the meca gene homologue of Staphylococcus sciuri into a resistance determinant and expression of the resistant phenotype in Stahylococcus aureus. J Bacteriol, 2001, 183: [27] Shittu A, Lin J, Morrison D, et al. Isolation and molecular characterization of multiresistant Staphylococcus sciuri and Staphylococcus haemolyticus associated with skin and soft-tissue infections. J Med Microbiol, 2004, 53: [28] Albarracín Orio AG, Piñas GE, Cortes PR, et al. Compensatory evolution of pbp mutations restores the fitness cost imposed by β-lactam resistance in Streptococcus pneumonia. Plos Pathog, 2011, 7: el [29] Komatsuzawa H, Choi GH, Ohta K, et al. Cloning and characterization of a gene, pbpf, encoding a new penicillin-binding protein, PBP2B, in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother, 1999, 43: [30] Meng J, Hu B, Liu J, et al. Restoration of oxacillin susceptibility in methicilin-resistant Staphylococcus aureus by blocking the MecR1-mediated signaling pathway. J Chemother, 2006, 18: [31] Sahin F, Karasartova D, Ozsan Tm, et al. Identification of a novel lytic bacteriophage obtained from clinical MRSA isolates and evaluation of its antibacterial activity. Mikrobiyol Bul, 2013, 47: [32] Guntupalli R, Sorokulova I, Olsen E, et al. Biosensor for detection of antibiotic resistant Staphylococcus bacteria. J Vis Exp, 2013, doi: /50474

材料方法

材料方法生物技术通报陆敏许黎明吴宏宇张继恩李国栋黄青山溶葡萄球菌酶是一种能高效裂解葡萄球菌细胞壁的肽链内切酶已有研究表明其能够有效预防和去除奶牛乳腺中葡萄球菌的感染但该酶在牛奶中的性质研究还缺少详细的研究数据现对重组溶葡萄球菌酶在牛奶中的一些性质进行研究检测了加入溶葡萄球菌酶后牛奶性状的变化和重组溶葡萄球菌酶在牛奶中的酶活的稳定性以及溶葡萄球菌酶在牛奶中的抑杀菌活性结果显示重组溶葡萄球菌酶未改变牛奶的外观性状