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1 第 40 卷 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究 第期 0 年月 Chinese Journal of Analytical Chemistry ~ DOI:0.374/SP.J 基于强阳离子交换色谱与等电聚焦的磷酸化蛋白质组学分离策略比较 隋少卉 董俊军 王京兰 蔡耘 钱小红 * ( 防化指挥工程学院三系, 北京 005) ( 军事医学科学院放射与辐射医学研究所, 蛋白质组学国家重点实验室, 北京蛋白质组研究中心, 北京 006) 摘要比较分析了强阳离子交换 (SCX) 与等电聚焦 (IPG-IEF) 技术在磷酸化蛋白质组学中的应用 采用 3 种标准磷酸化蛋白对 SCX 与 IPG-IEF 两种技术对磷酸化肽段富集的有效性进行考察 以 HepG 细胞为复 杂样本, 考察 SCX 与 IPG-IEF 在实际样本中的应用情况 对 SCX 与 IPG-IEF 技术在 O 标记的磷酸化蛋白质组定量研究中的应用情况进行考察 蛋白鉴定采用高准确度 高灵敏度 高分辨率的 LTQ-FTICṞ MS/MS 质谱仪 实验表明 :SCX 和 IPG-IEF 在大规模磷酸化肽段分离过程中均有效 ; 在复杂样本中,SCX 技术的分离效果优于 IPG-IEF;IPG-IEF 的重复性好于 SCX; 在磷酸化蛋白质组定量分析结果表明,IPG-IEF 技术的稳定性优于 SCX 本研究为根据不同实验目的而选择适当的磷酸化蛋白质组预分离技术提供了有用信息 关键词 磷酸化肽段分离 ; 强阳离子交换 ; 等电聚焦 ; 傅里叶交换离子回旋质谱 引言 磷酸化修饰是调节细胞内蛋白活性和信号传导的重要翻译后修饰之一 [] 因此获得磷酸化蛋白和 磷酸化位点的信息对深入理解细胞的调节过程和信号传导是十分重要的 [,3] 虽然细胞内能发生磷酸 化的蛋白较多, 但磷酸化蛋白的量却很少, 而且蛋白磷酸化的动态性以及特定的磷酸化位点的化学计量 值较低等因素使得磷酸化蛋白的鉴定, 特别是大规模的磷酸化蛋白质组学分析十分困难 [4] 鉴于此, 对 磷酸化肽段进行预分离, 降低样本的复杂性, 从而提高磷酸化肽段的相对浓度, 是十分必要的 目前, 已建立的一些磷酸化肽段富集策略, 如固相金属亲和色谱 (Immobilized metal affinity chromatography, IMAC) [5], 强阳离子交换色谱 (Strong cation exchange, SCX) [6,7], 二氧化钛 (TiO ) [8], 等电聚焦 (isoelectric focusing on an immobilized ph gradient gel, IPG-IEF) 等技术 [9] 其中 IMAC 和 TiO 技术常用 [6] 于大规模磷酸化肽段联合富集路线中的二维富集 自 Gygi 等将 SCX 成功应用到磷酸化肽段的富集 后,SCX 已成为大规模磷酸化蛋白质组联合富集路线中最常用的一维分离技术 近期, 以 IEF 为分离原 理的技术被引进, 用于分离胰蛋白酶酶解肽段混合物, 该技术可能成为大规模磷酸化蛋白质组学分析中 联合富集路线中的一维分离技术 为了考察 IEF 和 SCX 的有效性, 本研究对 SCX 和 IPG-IEF 在磷酸化 蛋白质组学中的应用, 包括定性和定量两方面, 进行了比较研究, 为根据不同实验目的, 从而选择适当的 磷酸化蛋白质组学预分离技术, 提供了有用信息 实验部分. 仪器与试剂 毛细管高效液相色谱 - 电喷雾 - 线性离子阱 - 傅里叶变换离子回旋共振质谱仪 (CapLC-ESI-LTQ-FTI- CR, Thermo Finnigan), 毛细管色谱由安捷伦 00 系统控制, 由自动上样系统 上样泵 ( 含一个十通阀 ) 和 二元洗脱泵组成 (Agillent 00, Agillent 公司 ); ProteomeLab PF D 型两维高效液相色谱系统, 包括双泵 反相色谱仪 自动馏分收集及进样器和 3 Karat 色谱工作站 ( 美国 Beckman 公司 ), 并在反相色谱之后连 接自动馏分收集器 (Gilson 公司 ); IPGphor 水平电泳仪 (Amersham Pharmacia 公司 ) 收稿 ; 接受本文系国家自然科学基金 ((Nos , ), 国家高技术研究发展计划 (863)(Nos. 006AA0A308, 006AA0A3) 资助 * qianxh@ yahoo.com.cn

2 分析化学 第 40 卷 乙腈 (HPLC 级, 美国 J. T. Baker 公司 ); 三氟乙酸 (TFA) 和碘乙酰胺 (Iodoacetamide, 比利时 ACROS 公 司 ); 胰蛋白酶 (Trypsin,Sequencing grade) 和二硫苏糖醇 (Dithiothreithol, DTT) 购于美国 Promega 公司 ; HepG 细胞 ( 北京市人民医院馈赠 ); 牛 α- 酪蛋白 (α-casein) β - 酪蛋白 ( β -Casein) 鸡卵白蛋白 (Ovalbumin) α- 氰基 -4- 羟基肉桂酸 (HCCA) Na VO 3 甲酸 (FA) 和 NaF( 美国 Sigma 公司 ); 蛋白酶抑制剂 ( 德国 Roche 公司 ) H O (97%, 上海化工研究所 ) 超纯水由 Millipore 纯水系统制备 ; 其它试剂均为色谱纯. 实验方法.. 蛋白酶切取 3 种标准磷酸化蛋白 : 牛 α- 酪蛋白 β - 酪蛋白和鸡卵白蛋白各 00 mg 溶于 00 ml 含有尿素 (8 mol/l) DTT(0 mmol/l) NH 4 HCO 3 (50 mmol/l) 的溶液中, 置 37 水浴中还原 4 h, 然后加 入 5 ml 碘乙酰胺 ( mol/l), 放置暗处 h, 进行烷基化, 加 700 ml NH 4 HCO 3 (50 mmol/l) 溶液, 将尿素稀 释到 mol/l 以下, 最后加入 mg 胰蛋白酶, 在 37 保温反应 6 h.. SCX 色谱分离磷酸化肽段实验在 ProteomeLab PF D 型两维高效液相色谱系统 ( 美国 Becḵ man 公司 ) 上进行, 流动相 A(5 mmol/l NH 4 H PO 4-40% ACN, ph.7) 和流动相 B(5 mmol/l NH 4 H PO 4-40% CAN-350 mmol/l NH 4 Cl) 用来形成盐梯度 梯度设置为 0% B 保持 7 min; min 内至 5% B; 5 min 内至 5% B, 并保持 0 min;0 min 内至 60% B; min 内至 00% B, 并保持 0 min; min 内至 00% A 流速为 0.7 ml/min, 检测波长为 4 nm, 用自动化的 Gillson 5 liquid handler (Gillson, Middleton, WI, USA) 每分钟收集一个馏分, 共收集 40 个 SCX 色谱柱为 Hypersil SCX 强阳离子交换柱 (Theṟ mo Keystone, 50 mm 4.6 mm,5 mm,300 Å)..3 IPG-IEF 分离富集磷酸化肽段胶内溶胀上样 : 将蛋白酶切肽段混合物溶于 ml 8 mol/l 尿素中, 然后加入.75 ml 0.5% IPG 缓冲液, 共 350 ml, 胶内溶胀上样 溶胀和 IEF 的操作参数见表 放置 IPG 干胶条 : 选用 cm ph 3~0 的 线性 IPG 干胶条, 从 IPG 干胶条酸性端除去保 护膜, 并且使胶条酸性端靠着持胶槽突起的一 端, 使胶条胶面朝下贴近溶液 为了使胶条被 溶液浸润, 慢慢抬高或放低胶条, 并且沿着液 体表面来回滑动 注意不要使 IPG 胶条底部 表 等电聚焦程序 Table Isoeltectric focusing (IEF)program 再水化 Rehydration 聚焦 Focusing (Vh) 30 V 60 V 500 V 000 V 5000 V 8000 V 8000 V 6 h 6 h h h h h 梯度 Gradient 产生气泡 在 IPG 胶条上铺一层 ml IPG 覆盖液 (IPG Cover Fluid), 以减少蒸发和尿素结晶 按表 设置相应的等电聚焦程序 等电聚焦完成后, 用电极液和超纯水冲洗 IPG 胶条, 然后剪成 33 份, 并用 00 ml 50% CAN-0.% TFA 溶液提取..4 O 稳定同位素标记磷酸化肽段酶切后 O 标记方法 : 取两等份酶切肽段混合物分别放于两 支管中, 进行平行标记实验 真空冷冻干燥后, 分别加入.75 ml 50 mmol/l KH PO 4 (ph 4~5), 并真空冷 冻干燥 ; 各加 0 ml H 6 O 和 H O (97% ), 放于 37 水浴锅中 9~4 h; 将上述两等份标记完全的肽段 混合物放于微波炉中加热 0 min, 使胰蛋白酶变性 ; 分别转移到两管充分干燥后的等量胰蛋白酶变性液 ( mmol/l ph 7.0 TCEP, tris(-carboxyethyl)-phosphine) 中, 放置于 37 水浴锅中 h, 使胰蛋白酶充分变 性 ; 分别转移到两管充分干燥后的等量烷基化试剂 ( mmol/l 碘乙酰胺,3 mol/l 盐酸胍 ) 中, 在 37 水 浴中继续孵育 90 min..5 液相色谱 - 质谱联用分析 () 液相色谱条件分析柱为 PicoFrit TM 反相柱 (BioBasic C, 5 mm, 75 mm i.d. x 0 cm, 5 mm i.d. spray tip, New Objective, Woburn, MA, USA) 流动相 A:98% 水溶液 /0.% FA; 流动相 B:80% ACN-0.% FA 洗脱条件 :0~ 80 min, 0% ~ 40% B;80~ 95 min,40% ~ 00% B; 00% B;95~5 min,00% B;5~ 0 min,00% ~ 0% B, 以 00% A 平衡色谱柱 0 min, 流速为 0.7 ml/min; () 质谱条件从反相柱流出的洗脱组分由纳升级电喷雾接口喷出 电喷雾电压.8 kv; 离 子传输毛细管温度为 00 ; 质谱采用全扫描 (Mass range, m/z 400~000) 一级质谱的数据依赖的二级 质谱扫描模式 (Data dependent MS/MS scan), 依次选取一级质谱中离子强度最强的 3 个离子进行 CID 串 联质谱, 动态排除归一化碰撞能量为 35% ; 采用串联质谱扫描的动态排除功能, 设置排除时间为 5 s..6 质谱数据的检索所有串联质谱数据均用 Thermo Finnigan Bioworks 3.SR 整合的 Sequest 检 V.h

3 第期隋少卉等 : 基于强阳离子交换色谱与等电聚焦的磷酸化蛋白质组学分离策略比较 索软件对 IPI(Ver.3.) 人蛋白质数据库检索 所用蛋白酶选择 Trypsin, 允许所酶切的肽段有 个漏切位点, 固定修饰为 Carbamidomethyl (C), 可变修饰为 Oxidation (M),Phospho (ST) 和 Phospho (Y), 一级质谱质量误差设为 为了考察所得结果的可信度, 建立了反转数据库, 将每个蛋白质的氨基酸顺序倒转 所有的二级图谱对构建的 IPI(Ver.3.) 正反混合数据库进行检索 O 标记的肽段的检索鉴定还需加上修饰 (C-terminal) (+4Da) 用 BuildSummary 软件对得到的 Sequest 检索结果进行整合 数据过滤参数设置为 : 6 O 标记的肽段 :Xcorr.9,+;Xcorr.6,+;Xcorr 3.0,3+;Rsp 4 O 标记的肽段 :Xcorr.9,+;Xcorr.7,+;Xcorr 3.3,3+;Rsp 4 假阳性率都控制在 % 以内 3 结果与讨论 3. SCX-LTQ-FT 和 IPG-IEF-LTQ-FT 两条磷酸化肽段富集路线的建立及有效性比较 SCX 分离磷酸化肽段策略是基于磷酸化肽段与非磷酸化肽段在酸性溶液中所带电荷的不同达到分离的目的 在溶液 ph=.7 时, 胰蛋白酶的酶切产物大部分肽段带 + 电荷, 而磷酸化肽段由于含有磷酸基团, 带一个负电荷, 磷酸化肽段在酸性溶液中带 + 电荷 在强阳离子交换色谱中, 单电荷肽段 [0] 比多电荷肽段流出时间早, 因此磷酸化肽段便能从多电荷复杂的非磷酸肽段中分离富集 基于肽段等电点的不同而发展的等点聚焦技术已成熟地应用于二维凝胶电泳中分离复杂蛋白混合物 近年, 该技术又被用于分离胰蛋白酶酶解肽段混合物 该策略的机理是由于磷酸化肽段磷酸基团的负电性, 其等电点会比非磷酸化肽段低, 从而分布在低 ph 的酸性端 该策略包括自由流电泳 (FFE) 毛细管电泳和基于 IPG 胶条的等电聚焦 (IPG-IEF) [] 等 其中,IPG-IEF 操作方便, 且所需样本量少, 较 [] 受关注 本研究采用 IPG-IEF 技术对磷酸化肽段分离 为了考察 SCX 和 IPG-IEF 的有效性, 建立了 SCX-LTQ-FT 和 IPG-IEF-LTQ-FT 两条技术路线 采用 3 种标准磷酸化蛋白对 SCX 与 IPG-IEF 两个技术对磷酸化肽段富集的有效性进行考察 以 HepG 细胞 为复杂样本, 考察 SCX 与 IPG-IEF 在实际样本中的应用情况 对 SCX 与 IPG-IEF 技术在 O 标记的磷酸化蛋白质组定量研究中的应用情况进行考察 蛋白鉴定采用高准确度 高灵敏度 高分辨率的 LTQ- FTICṞ MS/MS 质谱仪 本研究技术路线见图 图 Fig. 技术路线示意图 Technique route of this report SCX: Strong cation exchange; IPG: Immobilized ph gradient gel; LTQ-FTICR: Linear ion trap-fourier transform ion cyclotron resonance. 采用 SCX 和 IPG-IEF 分别富集 3 种标准磷酸化蛋白的酶切肽段混合物中的磷酸化肽段 从表 可见,SCX 技术富集鉴定到 3 个磷酸化肽段, 其中 8 个磷酸化肽段在没有 SCX 富集时是看不到的,SCX

4 分析化学 第 40 卷 使富集有效性提高了 6.5% 从表 3 可见,IPG-IEF 技术富集鉴定到 个磷酸化肽段, 其中 6 个磷酸化 肽段在没有 IPG-IEF 富集时是看不到的,IPG-IEF 使富集有效性提高了 54.5% 上述实验重复 3 次, 结 果基本一致, 表明 SCX 和 IPG-IEF 对磷酸化肽段富集都是有效的, 而且二者在分离富集标准磷酸化蛋 白的磷酸化肽段的能力上是基本等效的 表 SCX 分离富集到的标准磷酸化肽段 Table Standard phosphopeptides enriched by SCX 馏分 Fraction SCX 蛋白名称 Protein descriptions 分子量 M W 肽段序列 Peptides sequence 7, 牛 β- 酪蛋白 ( β -casein) 06 FQS* EEQQQTEDELQDK 9, 0 鸡卵白蛋白 (Ovalbumin) 088 EVVGS* AEAGVDAASVSEEFR 0 牛 αs 酪蛋白 (caseiṉ αs) 466 TVDMES* TEVFTK,, 3 牛 αs 酪蛋白 (caseiṉ αs) 660 VPQLEIVPNS* AEER 7, 8 牛 αs 酪蛋白 (caseiṉ αs) 95 YKVPQLEIVPNS* AEER 6, 7, 8 牛 αs 酪蛋白 (caseiṉ αs) 97 DIGS* ES* TEDQAMEDIK 0 牛 αs 酪蛋白 (caseiṉ αs) 943 DIGS* ES* TEDQAM^EDIK 5 牛 αs 酪蛋白 (caseiṉ αs) 47 DIGS* ESTEDQAMEDIK 0 牛 αs 酪蛋白 (caseiṉ αs) 48 TVDM^ES* TEVFTK 0 牛 αs 酪蛋白 (caseiṉ αs) 75 NAVPITPT# LNR 7 牛 αs 酪蛋白 (caseiṉ αs) 594 KTVDMES* TEVFTK 7, 8 牛 αs 酪蛋白 (caseiṉ αs) 60 TVDM^ES* TEVFTKK 39 牛 αs 酪蛋白 (caseiṉ αs) 539 EQLS* T # SEENSKK 备注 Note 无富集 Without 富集 With 备注 (Note):*, # 分别表示肽段序列中的氨基酸 S T 和 Y 被磷酸化,M^ 表示 M 被氧化 (Phosphorylation sites identified are marked by a residue followed by *, # indicates phosphorylation for S, T and Y respectively. M^ indicates oxidation) 表 3 IPG-IEF 分离富集到的标准磷酸化肽段 Table 3 Standard phosphopeptides enriched by IPG-IEF 馏分 Fraction SCX 蛋白名称 Protein descriptions 分子量 M W 肽段序列 Peptides sequence 鸡卵白蛋白 (Ovalbumin) 088 EVVGS* AEAGVDAASVSEEFR 牛 αs 酪蛋白 (caseiṉ αs) 466 TVDMES* TEVFTK 3, 4 牛 αs 酪蛋白 (caseiṉ αs) 660 VPQLEIVPNS* AEER 3, 4, 5 牛 β 酪蛋白 ( β -casein) 06 FQS* EEQQQTEDELQDK 5, 6, 7 牛 αs 酪蛋白 (caseiṉ αs) 95 YKVPQLEIVPNS* AEER 5, 6 牛 αs 酪蛋白 (caseiṉ αs) 48 TVDM^ES* TEVFTK 4 牛 αs 酪蛋白 (caseiṉ αs) 60 TVDM^ES* TEVFTKK 牛 αs 酪蛋白 (caseiṉ αs) 943 DIGS* ES* TEDQAM^EDIK 牛 αs 酪蛋白 (caseiṉ αs) 97 DIGS* ES* TEDQAMEDIK 牛 αs 酪蛋白 (caseiṉ αs) 47 DIGS* ESTEDQAMEDIK 5 牛 αs 酪蛋白 (caseiṉ αs) 093 K.NMAINPS* KENLCSTFCK.E 备注 Note 无富集 Without 富集 With 考虑到对 SCX 和 IPG-IEF 的比较结果, 仅用简单的标准磷酸化蛋白样本有时并不能完全说明问题, 因此进一步将 SCX-LTQ-FT 和 IPG-IEF-LTQ-FT 两条技术路线分别应用到复杂样本 HepG 细胞中, 对其磷酸化肽段的富集能力进行比较, 重复实验 3 次, 得到基本一致的实验结果 ( 表 4) SCX-LTQ-FT 路线从 HepG 细胞中鉴定到 347 个磷酸化蛋白 350 个磷酸化肽段和 57 个磷酸化位点,IPG-IEF-LTQ- FT 路线从 HepG 细胞中鉴定到 6 个磷酸化蛋白 8 个磷酸化肽段和 35 个磷酸化位点 以上结果表明, 在复杂样本中,SCX 对磷酸化肽段的富集能力明显优于 IPG-IEF 原因可能是, 肽段序列中含有 [] Asp/Glu 酸性氨基酸的非磷酸化肽段对 IPG-IEF 的富集有一定的干扰 但不管怎样,IPG-IEF 仍然能够有效地降低肽段混合物的复杂性, 最终得到磷酸化肽段含量较高的肽段混合物, 起到有效富集作用 此外,IPG-IEF 对磷酸化肽段富集的的重复性 ( 约 50% ) 优于 SCX( 约 30% )

5 第期隋少卉等 : 基于强阳离子交换色谱与等电聚焦的磷酸化蛋白质组学分离策略比较 表 4 IPG-IEF 和 SCX 对 HepG 细胞中磷酸化肽段富集能力比较 Table 4 Comparison of the phosphopeptides capability on HepG cells of IPG-IEF and SCX 磷酸化位点 UniquePhosphosites 磷酸化肽段 Unique Phosphopeptides 磷酸化蛋白 Unique Phosphoproteins SCX SCX SCX SCX( 总 total) IPG-IEF 6 3 IPG-IEF IPG-IEF IPG-IEF( 总 total) SCX( 总 ) 与 IPG-IEF( 总 ) 交叉 SCX(total) and IPG-IEF(total) overlap 备注 :SCX,SCX,SCX3 表示 3 次重复的 SCX 实验 ;IPG-IEF,IPG-IEF,IPG-IEF3 表示 3 次重复的 IPG-IEF 实验 NOTE: SCX, SCX and SCX3 indicate the three repeated experiments, which is the same for IPG-IEF,IPG-IEF and IPG-IEF3. 3. SCX-LTQ-FT 和 IPG-IEF-LTQ-FT 两条磷酸化肽段富集路线在定量分析中的比较 将 SCX 和 IPG-IEF 路线应用到 O 标记的磷酸化肽段中, 研究二者在磷酸化蛋白质组学定量分析 中的稳定性 结果表明, O 标记的磷酸化肽段在 IPG-IEF 路线中稳定性非常好, 大部分磷酸化肽段标 记误差小于 5% ; 而 O 6 O= 标记的磷酸化肽段在 SCX 富集路线中稳定性却较差 ( 图, 表 5) 图 O 标记磷酸化肽段在 IPG-IEF 与 SCX 分离富集路线中稳定性 (A 和 A) 磷酸化肽段 VPQLEIVPNS* AEER(m/z=830.90);(B 和 B) 磷酸化肽段 K.YKVPQLEIVPNS* AEER.L(m/z ); ( C 和 C) 磷酸化肽段 R.EVVGS* AEAGVDAASVSEEFR.A (m/z ) Fig. Investigation of the stability of O labeling phosphopeptides under IPG-IEF and SCX for VPQLEIVPNS* AEER (m/z= 830.9) (A and A), K.YKVPQLEIVPNS* AEER.L (m/z ) (B and B) and R.EVVGS* AEAGVDAASVSEEFR.A(m/z ) (C and C)

6 分析化学 第 40 卷 这表明相同比例混合的 O 与 6 O 标记的磷酸化肽段, 其标记误差经 SCX 富集路线分离后比 IPG-IEF 路 线明显偏大, 有的肽段标记误差甚至高达 79% ( 图 A, 表 5) 所以, O 标记的磷酸化肽段经 IPG-IEF 路线富集后, 定量结果比 SCX 更接近真实值, 也就是说 IPG-IEF 更适合用于 O 标记的磷酸化肽段的分 离富集 因此, 在 O 标记磷酸化蛋白质组学定量分析研究中, 一般选择 IPG-IEF 作为预分离技术 表 5 O 标记磷酸化肽段在 IPG-IEF 与 SCX 分离富集路线中稳定性的考察 Table 5 Investigation of the stability of O labeling phosphopeptides under IPG-IEF and SCX 理论值 Expected ratio 观测值 Observed ratio 相对误差 Relative erro (% ) 理论值 Expected ratio 观测值 Observed ratio 相对误差 Relative erro (% ) A 0.99 B.0 A B. C C. 备注 :A,A,B,B,C,C 同图 Note: A,A,B,B,C,C are as same as those in the Fig. 4 结论 建立了 SCX-LTQ-FT 和 IPG-IEF-LTQ-FT 两条技术路线, 并将其应用到标准磷酸化蛋白和 HepG 细胞中, 对其在磷酸化蛋白质组学定性和定量分析中的应用情况进行了比较分析 实验表明,SCX 和 IPG-IEF 技术在磷酸化肽段分离富集中都是有效的,SCX 在复杂样本的大规模分析中优于 IPG-IEF 的富 集效果 然而, O 标记磷酸化肽段在 SCX 路线中的稳定性却不如 IPG-IEF, 即磷酸化蛋白定量分析时, 应优选 IPG-IEF 技术 因此, 本研究为根据不同实验目的选择适当的磷酸化蛋白质组学预分离技术提供 了有用信息 References KumarG K,PrabhakarN R.Respir.Physiol.Neurobio.,008,64(-):7~76 HarshaH C,PandeyA.Mol.Onc.,00,4(6):48~495 3 BAIZhao-Fang,WANG Hong-Xia.ChineseJ.Anal.Chem.,009,37(9):38~389 柏兆方, 王红霞. 分析化学,009,37(9):38~389 4 BlackburnK,GosheM B.BriefFunct.GenomicProteomic,009,8():90~03 5 Thingholm TE,JensenO N,Larsen M R.MethodsMol.Biol.,009,57:67~78 6 BeausoleilSA,JedrychowskiM,SchwartzD,EliasJE,VilenJ,LiJ,CohnM A,CantleyLC,GygiSP.Proc. Natl.Acad.Sci.,004,0(33):30~35 7 ParkerJL,Jones A M,SerazetdinovaL,Saalbach G,Bibb M J,Naldret M J.Proteomics,00,0(3): 486~497 8 Thingholm TE,Larsen M R.MethodsMol.Biol.,009,57:57~66 9 RogersLD,FangY,FosterLJ.Mol.Biosyst.,00,6(5):8~89 0 SuiShao-Hui,WangJing-Lan,LuZhuang,CaiYun,ZhangYang-Jun,Yu WeṉFeng,QianXiao-Hong.ChinJ. Chromatogr.,008,6():95~99 隋少卉, 王京兰, 卢庄, 蔡耘, 张养军, 蔚文峰, 钱小红. 色谱,008,6():95~99 CargileBJ,TaleyDL,StephensonJLJr.Electrophoresis,004,5(6):936~945 SuiShao-Hui,WangJing-Lan,JiaWei,LuZhuang,LiuJiṉFeng,SongLi-Na,CaiYun,QianXiao-Hong.ChinJ. Anal.Chem.,008,36(8):07~03 隋少卉, 王京兰, 贾伟, 卢庄, 刘金凤, 宋丽娜, 蔡耘, 钱小红. 分析化学,008,36(8):07~03 3 XuCF,WangH,LiD,KongXP,NeubertTA.Anal.Chem.,007,79(5):007~04

7 第期隋少卉等 : 基于强阳离子交换色谱与等电聚焦的磷酸化蛋白质组学分离策略比较 ComparisonofPhosphoproteomicSeparationStrategiesBasedon StrongCationExchangeChromatographȳIsoelectricFocusingTechniques ( 题目被编辑按中文题目修改过, 请核实确认 ) SUIShao-Hui,DONGJuṉJun,WANGJing-Lan,CAIYun,QIAN Xiao-Hong (TheNo.3Department,InstituteofChemicalDefence,Beijing005) (StateKeyLaboratoryofProteomics-BeijingProteomeResearchCenter-BeijingInstituteof RadiationMedicine,Beijing006) Abstract Eficientpre-purificationstepsfortheofphosphorylated proteinsorphosphopeptidesarenecessaryforbeterdetectionofphosphorylationsitesinphosphoproteomicanalysis. Currently,the mostcommonfirsṯdimensionalseparationtechniqueusedisstrongcationexchange (SCX).ApotentialalternativetoSCX-basedseparationistouseisoelectricfocusing(IEF)asafirsṯ dimensionalseparationtechnique,whichhasbeendemonstratedrecently.inthisstudy,wepresenta directcomparisonbetweenscxandiefbasedonipgstrips (IPG-IEF)forthephosphoproteomic separation.thecomparisonexperimentsdiscussedinthisstudyutilizedstandardphosphoproteinsand arealsampleofhepgcel.thenthecomparisonof Olabelingphosphopeptides stabilityunder immobilizedph gradientgel(ipg)-ief withunderscx was made.fractionsfrom bothtechnique (SCXandIPG-IEF)wereanalyzedusingtheHigh MassAccuracyLTQ-FTICR-MS/MS.Theresults demonstratethatscx-ltq-ftandipg-ief-ltq-ftareusefulinthephosphopeptides analysisonalargescale.andscx-ltq-ftisrelativesuperiortoipg-ief-ltq-ft,whereasthe Olabelingphosphopeptides stabilityunderscx-ltq-ftisrelativelypoorwiththatunderipg-ief- LTQ-FT. Keywords Phosphopeptideseparation;Strongcationexchange;Isoelectricfocusing;Lineariontrap- Fouriertransformioncyclotronresonancemassspectrometry-massspectrometry (Received0March0;accepted3June0)

2 2.4 数据库检索数据采用 Proteome Discoverer1.3 进行检索, 检索使用的蛋白质数据库为 swissprot mouse 数据库, 采用如下图 1 模板 3 结果与讨论 3.1 典型 TIC 谱图和典型一级和二级质谱图图 2 到图 4 为三个 raw data 对应的 TI

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