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1 基于质谱技术的蛋白 质组研究

2 蛋白质组研究技术发展

3 医学蛋白质组学研究的目的 疾病 Vs 正常 诊断标志物 发病机制 药物处理 Vs 对照 药物作用靶点 药物作用机制 病理状态下蛋白质磷酸化 病理状态下细胞内信号传导 蛋白质相互作用 蛋白质的生物功能

4 生物质谱分类 进样系统 不连续进样 : 适用于固体或高沸点液体 MALDI 离子化方式 连续进样 : 分析样品连续进入 GC/MS,LC/MS 热稳定化合物电子离子化 (EI) 化学离子化 (CI) 质量分析器 热不稳定化合物快原子轰击离子化 (FAB) 基质辅助激光解析离子化 (MALDI) 电喷雾离子化 (ESI) 双聚焦分析器 四级杆质量过滤器 离子阱傅立叶回旋共振 (FT-ICR) (Ion Trap) 飞行时间 (TOF)

5 质谱仪器分类 Nature (2003) 422,

6 质谱技术在蛋白质组研究中的应用 研究目的 表达谱构建蛋白质相互作用研究蛋白质表达差异分析蛋白质翻译后修饰分析 蛋白质组学方法 大规模蛋白质鉴定技术 (shotgun) 大规模蛋白质鉴定技术 (shotgun) 定量蛋白质组学技术磷酸化, 泛素化位点鉴定技术

7 大规模蛋白质混合物鉴定 (Shotgun-MS) 基本原理 : 将蛋白质混合物用酶 (Trypsin) 酶解成肽段混合物, 这些肽段混合物再通过液相色谱分离 ( 如 2DLC( 阳离子柱 SCX 和 C18 反相柱串联 ) 或 1DLC 的 C18 反相柱 ), 再用串联质谱测试, 然后在相应的数据库检索进行鉴定 优点 : 灵敏度要高 ; 所需样品少, 而且损失小 ; 对一些疏水性强, 分子量小或者酸碱性强的蛋白质更适用 实验周期短 缺点 : 重复性有待提高 定量分析能力较弱

8 Shotgun Protein Identification SCX column fractionation Reverse column separation Protein mixture Protein digests Auto MS/MS detection Results BioWorks data base search Tandem MS spectra

9 膜蛋白表达谱分析 实验步骤 : 样品的制备采用 CALBIOCHEM 的 ProteoExtractTM Native Membrane Protein Extraction Kit 膜蛋白质组分,Bradford 法定量, 分装成 100ug 一管, 低温冰箱保存 取 100ug 一个泳道作 12.5%SDS-PAGE, 每个泳道切成 8 份 gel 合并三个泳道内同样位置的 gel 组分, 进行胶内酶解 然后将酶解得到的多肽产物进行 LCQ 分析, 得到的数据进行 SEQUEST 查相应的数据库

10 膜蛋白的电泳与切胶图谱 A B B A 150ug 150ug 150ug 150ug 150ug 150ug 150ug 150ug

11 Basepeak 图谱

12 鉴定结果 最终每个样品都鉴定了 1000 多种蛋白质 其中膜蛋白有 400 种左右

13 质谱技术在蛋白质组研究中的应用 研究目的 表达谱构建 蛋白质相互作用研究 蛋白质表达差异分析 蛋白质翻译后修饰分析 蛋白质组学方法 大规模蛋白质鉴定技术 (shotgun) 大规模蛋白质鉴定技术 (shotgun) 定量蛋白质组学技术 磷酸化, 泛素化位点鉴定技术

14 蛋白质动态相互作用 -- 和谁在一起 蛋白质 - 蛋白质蛋白质 - 小分子蛋白质 - 核酸蛋白质 - 配体 Nature Genetics (2003) 33,

15 蛋白质的相互作用研究 实验步骤 : 利用免疫共沉淀方法得到蛋白复合物 处理与对照分别用 SDS-PAGE 分离 两者相比的差异蛋白带确定为可能的蛋白成分

16 差异蛋白条带分析 SDS 低分子量 marker 对照 处理

17 质谱分析结果 质谱分析差异条带, 得到混合蛋白质列表 分析鉴定结果, 筛选出差异蛋白质 通过 western 验证实验结果

18 大规模蛋白质混合物鉴定 (Shotgun) 的优点 可分析本身性质比较特殊, 不适于做 2D 电泳的样品 ( 如膜蛋白, 分子量较小的蛋白与多肽 ) 蛋白质的相互作用研究 样品中的低丰度蛋白为研究目标, 如分泌蛋白

19 质谱技术在蛋白质组研究中的应用 研究目的 表达谱构建 蛋白质相互作用研究 蛋白质表达差异分析 蛋白质翻译后修饰分析 蛋白质组学方法 大规模蛋白质鉴定技术 (shotgun) 大规模蛋白质鉴定技术 (shotgun) 定量蛋白质组学技术 磷酸化, 泛素化位点鉴定技术

20 基于质谱技术的定量蛋白质组学实验方法 当样本量少而且珍贵难得, 难以满足凝胶分析的样品用量时, 基于质谱的定量蛋白质组学技术可以有效解决问题 可以更加有效的检测低丰度蛋白质和极端生化性质的蛋白质 In vivo In vitro Peak area Spectral counts SILAC ICAT itraq DyCyderMS

21 In vivo VS. in vitro

22 Label-free (peak area): DeCyder MS

23 Label-free (peak area): DeCyder MS

24 DeCyder MS pattern of 6 experiments

25 Protein Vs peptides 蛋白质 Cofilin-1 所对应的肽段在 2 个样本间的比值 ratio p-value IPI number protein name peptide sequence IPI:IPI Cofilin-1 R.YALYDATYETK.E IPI:IPI Cofilin-1 K.AVLFCLSEDK.K IPI:IPI Cofilin-1 K.EILVGDVGQTVDDPYATFVK.M IPI:IPI Cofilin-1 K.KEDLVFIFWAPESAPLK.S 蛋白质 translationally-controlled 1 所对应的肽段在 2 个样本间的比值 ratio p-value IPI number protein name peptide sequence E-05 IPI:IPI Tumor protein, translationally-controlled IPI:IPI Tumor protein, translationally-controlled 1 R.DLISHDEMFSDIYK.I R.VKPFMTGAAEQIK.H

26 Label-free (peak area): DeCyder MS

27 DeCyder MS 的优缺点 优点 : 无需标记, 减少实验误差, 接近样品真实状态 费用消耗较小 缺点 : 对质谱的重复性要求比较高 分析复杂样品的能力不如标记定量方法

28 SILAC (Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Cultures) In vivo-silac Light Heavy

29 利用 SILAC 技术研究核仁蛋白质组的动态变化 NATURE 2005,433(6):77-83

30 SILAC 的优缺点 优点 : 活体标记, 更接近样品真实状态 技术成熟 缺点 : 对于生物医学研究中常用的组织样品, 体液样品等无法分析 对于动物模型的标记成本太大, 无法实现

31 itraq(isobaric tagging for relative and absolute quantitation)

32 itraq Principle

33 MS/MS spectrum of itraq labeled peptides

34 itraq 的优缺点 优点 : 体外标记, 适用于更多的样品, 如 : 动物组织 体液 植物组织等 蛋白质标记完全 可标记多种样品 缺点 : 质谱耗时长

35 质谱技术在蛋白质组研究中的应用 研究目的 表达谱构建 蛋白质相互作用研究 蛋白质表达差异分析 蛋白质翻译后修饰分析 蛋白质组学方法 大规模蛋白质鉴定技术 (shotgun) 大规模蛋白质鉴定技术 (shotgun) 定量蛋白质组学技术 磷酸化, 泛素化位点鉴定技术

36 蛋白质翻译后修饰分析 翻译后修饰, 包括磷酸化, 糖基化, 甲基化, 乙酰化, 泛素化等是蛋白质功能调节的重要形式, 特别是磷酸化 很多时候病理变化并不是由蛋白质的表达量变化引起的, 而是有磷酸化修饰的水平和状态的变化引起的 磷酸化的研究对于解释病理变化时细胞内信号传导和机制具有重要作用

37 蛋白质磷酸化研究的意义 蛋白质磷酸化在真核生物中是非常重要, 普遍的现 象. 据估计, 在任一给定时刻, 细胞内约有三分之 一的蛋白质存在磷酸化 磷酸化是生命活动中最重要的一项翻译后修饰, 在信号传导 细胞周期 生长发育以及癌症机理 等等诸多生物学问题有着密切的关系 磷酸化研究可以说是蛋白质组学遇的难题之一, 并且无法回避. 不能好好理解蛋白质磷酸化现象, 就不能理顺蛋白质在生命中的整体意义

38 磷酸化蛋白的富集 由于磷酸化蛋白丰度较低, 所以成功的富集磷酸化蛋白 是磷酸化位点鉴定的关键 富集的方法分为两种 : 富集磷酸化蛋白质和富集磷酸化 肽段 富集磷酸化肽段的方法 : 1. 固定金属螯合亲和层析 (IMAC) 2. 强阳离子交换色谱 (SCX) 3. TiO2 亲和层析

39 富集磷酸化蛋白质的方法 通过磷酸化蛋白质的抗体来富集. 抗体主要为 : 丝氨酸与苏氨酸磷酸化蛋白质抗体 ; 酪氨酸磷酸化蛋白质抗体 Kit 操作步骤

40 蛋白质磷酸化位点分析技术 随着蛋白组学的崛起, 生物质谱技术由于它的快速 灵敏和精确等特征, 已经成为鉴定蛋白磷酸化位点的主要手段. 1) MALDI 离子源的磷酸化分析 : 通过串联质谱如 :TOF/TOF 等技术分析磷酸化肽段 缺点 : 由于 MALDI 源没有分离作用, 磷酸化肽段的信号会被非磷酸化肽段的信号抑制 a) 只能分析相对较纯的样品 b) 需对分析样品的磷酸化肽段进行富集 2) ESI 离子源的磷酸化分析 : ( 更为普遍 ) 优点 : 一般有 HPLC 作为进样系统, 所以可分析较为复杂的系统 与各种色谱技术联用, 提高了检测灵敏度 可进行磷酸化蛋白的定量分析

41 磷酸化肽段分析 Strategy: Automated LC/MS/MS Neutral loss profile P Protein Identification Phosphate Location

42 Neutral Loss of H 3 PO 4 from a Ser-Phosphorylated Tryptic Peptide + + S P + K + b1 b2 b3 b4 S K MS/MS da K y4 y3 P y2 y1 Dm/z = 49

43 Relative Abundance Relative Abundance Neutral Loss of Phosphate MS spectrum MS/MS spectrum Dr. M. Ward Proteome Sciences, UK m/z Dm/z = * m/ z

44 Phosphor-site identification of single protein

45

46 Phosphor-proteomics analysis of oesophagus carcinoma MHEGDEGDGHHHKPGLGEGTpP 食管癌样品 正常样品 食管癌 磷酸化蛋白质的富集 磷酸化蛋白质分级和酶解 MHEGDEGDGHHHKPGLGEGTP 正常 磷酸化位点鉴定 139 个磷酸化位点

47 Wnt3a 介导的经典 Wnt 信号网络磷酸化蛋白质组定量研究 Liu-Ya Tang, Ning Deng, Lian-Shui Wang, Jie Dai, Zheng-Long Wang, Xiao- Sheng Jiang, Su-Jun Li1, Long Li, Quan-Hu Sheng, Dian-Qing Wu, Lin Li, Rong Zeng Mol Cell Proteomics,2007,

48 实验流程

49 磷酸化蛋白质富集效果的验证

50 SILAC 定量结果的免疫印迹验证

51 信号蛋白质在 Wnt3a 刺激下的动态变化

52 经典 Wnt 信号通路中蛋白质 - 蛋白质相互作用的复杂网络 Striatin nucleophosmin MLH1 -adducin MEK1 TFIIF CDK2 HMGA2 PP2Ac PHKA1 LCP1 RSK-2 Fra-1 c-myc PKA SIN3A IRF3 PPAR c-jun STAT3 PBP CBP EP300 NLK TAK1 LEF Rbx1 CK CyclinD1 PIAS1 GSK3β GBP PS1 TCF Dvl APC SMAD -catenin Axin Pontin52 SOX17 CK CK CtBP1 Occludin Idax PKC Known Wnt protein Candidate protein RanBP3 Not Identified SGN7a SkiP Cul1 SKP1A ICAT EBP50 TBL1X SIAH1 Axam LRP5/6 Frizzled Identified, but not quantitated Protein from Cluster 1 Protein from Cluster 2 Protein from Cluster 3 Protein from Cluster 4 Direct protein-protein interaction Pr-pr interaction in a protein complex SKP2 SIP DKK

53 质谱技术应用总结 质谱技术发展非常迅速, 应用越来越广, 是目前蛋白质组学研究最强有力的工具 主要应用有 : 1. 细胞 组织 体液或某些特定蛋白质组的表达谱构建 2. 蛋白质相互作用研究 3. 定量 / 差异蛋白质组学研究 4. 蛋白质翻译后修饰位点研究, 特别是磷酸化位点分析

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