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附耶羊
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1 第 41 卷摇 2013 年 11 月摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇分析化学 (FENXI HUAXUE) 摇研究报告摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇 Chinese Journal of Analytical Chemistry 第 11 期 1653 ~ 1658 DOI: / SP. J 鄄 3 鄄 3 着蛋白磷酸化修饰的生物质谱分析 1 李子健摇 2 何鑫摇 3 潘晨宇摇 *3 刘宁 1 ( 北京大学第三医院血管医学研究所, 卫生部心血管分子生物学与调节肽重点实验室, 分子心血管学教育部重点实验室, 心血管受体研究北京市重点实验室, 北京 ) 2 ( 吉林大学化学学院, 长春 ) 摇摇 3 ( 吉林大学第二医院, 长春 ) 摘摇要摇本研究在 HEK293 细胞中过表达带有 6 个组氨酸标签的 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白, 经镍离子亲和树脂富集和凝胶电泳等生物化学方法分离并富集目标 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白利用特异性胰蛋白酶对 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白进行胶内水解后, 采用 TiO 2 亲和层析法, 对蛋白水解混合物中的磷酸化修饰肽段进行富集, 并利用生物质谱技术分析鉴定了 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白中的磷酸化修饰位点结果表明, 利用生物质谱技术, 结合人工解谱的方法, 能够高效准确地鉴定 HEK293 细胞中过表达的 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白中的磷酸化修饰肽段的结构信息, 确定了 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白中的 12 个磷酸化修饰位点, 其中多个位点的磷酸化修饰为首次发现关键词摇质谱 ; 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白 ; 磷酸化修饰 1 摇引摇言 14 鄄 3 鄄 3 蛋白是 Moore 等于 20 世纪 60 年代在研究脑蛋白质系统分类时发现的, 根据这类蛋白质在 DEAE 纤维素膜层析中的片段数以及它在淀粉凝胶电泳上的迁移位置而命名 [1] 14 鄄 3 鄄 3 蛋白为酸性蛋白质, 分子量约 28 ~ 33 kda, pi 4 ~ 5 在哺乳动物中存在 7 种异构体 ( 茁, 着, 酌, 浊, 滓, 子, 灼 ; 原命名的琢和啄实际是茁和灼的磷酸化形式 ), 主要以同源 / 异源二聚体形式存在 14 鄄 3 鄄 3 蛋白是广泛表达的蛋白家族, 主要存在于神经组织内, 在心肝肾小肠和睾丸等几乎所有组织中表达 14 鄄 3 鄄 3 蛋白的主要功能是作为接头蛋白与其它蛋白质结合, 进而通过多种机制调节它们的生物学功能 [2 ~ 7] 有证据显示, 14 鄄 3 鄄 3 蛋白的许多重要的生物学功能是通过其本身的磷酸化修饰来介导调节和完成的例如, 鞘氨醇依赖性蛋白激酶 1(SDK1) 可使 14 鄄 3 鄄 3 蛋白发生磷酸化修饰, 进而调节细胞信号转导 [8] PKC 灼激酶能够磷酸化 14 鄄 3 鄄 3 茁, 磷酸化的 14 鄄 3 鄄 3 茁进而负调控 PKC 灼和 Raf 鄄 1 相互作用, 调节细胞信号转导 [9] PKC 啄激酶能够磷酸化 14 鄄 3 鄄 3 灼, 从而诱导神经细胞凋亡, 调控癫痫疾病的发生发展 [7] 关于 14 鄄 3 鄄 3 蛋白翻译后修饰 ( 特别是磷酸化修饰 ) 的种类和位点的研究鲜有报道因此, 研究 14 鄄 3 鄄 3 蛋白的翻译后修饰, 特别是其磷酸化状态, 对于深入认识 14 鄄 3 鄄 3 蛋白在信号转导过程中的精细调控作用机制具有重要意义蛋白质结构分析中最具挑战性的应属对各种翻译后修饰的分析, 这主要是由于蛋白质翻译后修饰的丰度低动态范围大等因素造成的并且, 各种修饰会随机体所处的生理环境的变化, 呈现出较大差别现代质谱技术以其高分辨率和高灵敏度等优势成为了生物大分子, 特别是蛋白质分子结构分析中最重要的技术手段之一 [10,11] 当前的质谱技术可以对蛋白质的许多种类的翻译后修饰如磷酸化修饰进行定性半定量甚至定量分析 14 鄄 3 鄄 3 蛋白具有多个亚型, 各个亚型在不同组织细胞类型中的分布不尽相同而蛋白质各个亚型之间不但氨基酸序列互有差异, 而且翻译后修饰状态在同一的生理环境下也差别很大本研究利用分子生物学手段, 在特定的细胞中过量表达某一特定亚型的 14 鄄 3 鄄 3 蛋白, 进一步通过高特异性的镍离子亲和树脂富集, 获得纯度较高氨基酸序列均一的特定亚型 14 鄄 3 鄄 3 目标蛋白, 建立了 14 鄄 3 鄄 3 蛋白磷酸化修饰的质谱分析方法不仅消除了其它种类亚型蛋白对实验结果的干扰, 还可通过放大细胞培养的规模, 获得足量的目标蛋白, 从而检测到一些低丰度的磷酸化修饰状态本研究在 HEK293 细胞中过表达带有 6 个组氨酸标签的 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白, 经镍离子亲和树脂和凝胶电摇 2013 鄄 06 鄄 03 收稿 ;2013 鄄 07 鄄 22 接受本文系国家重点基础研究项目 (No. 2011CB503903) 国家自然科学基金 (Nos , , ) 北京市自然科学基金 (No ) 吉林省科技发展计划 (No ) 和吉林大学白求恩计划 (No ) 资助 * E 鄄 mail: liu_ning@ jlu. edu. cn

2 1 摇 654 摇分析化学第 41 卷泳等生物化学方法分离并富集目标 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白, 进一步经胰酶水解获得其肽段混合物采用 TiO 2 亲和层析法, 对磷酸化修饰肽段进行了富集, 并利用毛细管反向高效液相色谱和质谱联用技术分析鉴定了 14 鄄 3 鄄 3 蛋白中的磷酸化修饰位点, 其中多个位点的磷酸化修饰为首次发现 2 摇实验部分 2. 1 摇仪器与试剂 LTQ Orbitrap 电场轨道阱回旋共振组合质谱仪 (Thermo 公司 ); 测序级 TPCK 修饰的胰蛋白酶 (Pro 鄄 mega 公司 );Bradford 蛋白定量试剂盒 NH 4 二硫苏糖醇碘乙酰胺(Bio 鄄 Rad 公司 ); 镍离子亲和树脂 (GE healthcare 公司 );TiO 2 亲和吸头甲酸乙腈茁鄄巯基乙醇 (Sigma 公司 ); 其它试剂均为国产分析纯 His 鄄 14 鄄 3 鄄 3 着表达质粒由美国 Emory 大学 Haian Fu 教授惠赠 2. 2 摇镍离子亲和树脂富集 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白及 SDS 鄄 PAGE 电泳将 His 鄄 14 鄄 3 鄄 3 着质粒转染 HEK293 细胞 36 h 后裂解细胞, 将裂解上清液与镍离子亲和树脂柱孵育 2 h 利用清洗缓冲液清洗镍离子亲和树脂柱 3 次, 加入 6X 上样缓冲液 (2% SDS, 20% 甘油, 20 mmol / L Tris 鄄 HCl, ph 6. 8, 6 mmol / L 茁鄄巯基乙醇, 微量溴酚兰 ) 沸煮 5 min, 使 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白从镍离子亲和树脂柱上分离,12% SDS 鄄 PAGE 进行分离, 电泳后凝胶应用考马斯亮蓝 R250 染色, 扫描仪进行扫描成像 2. 3 摇蛋白质样品的胰蛋白酶水解及磷酸化肽段富集将位于 30 kda 处的蛋白染色条带切下, 在脱色缓冲液 (25mmol / L NH 4,50% (V / V) 乙腈 ) 中脱色直至蓝色消失将脱色后的凝胶条带在 2% (w / V) 二硫苏糖醇溶液中还原 30 min, 再加到 2. 5% (w / V) 碘乙酰胺溶液中反应 60 min, 使游离的巯基全部烷基化将胶条用乙腈脱水后, 加入新配制的含测序级 TPCK 修饰的胰蛋白酶的 50 mmol / L NH 4 溶液, 在 37 益反应过夜次日加入适量 10% 甲酸终止反应, 离心取上清液再用含有 10% 乙腈的 25 mmol / L NH 4 溶液从胶条中反复抽提 3 次合并 3 次抽提液, 并与初始的上清液混合, 即得到 14 鄄 3 鄄 3 蛋白的酶解多肽混合物, 冻干后 -20 益保存按照使用说明书, 将 TiO 2 亲和吸头依次用乙腈 200 mmol / L 磷酸盐缓冲液 (ph 7) 反复清洗后, 再用平衡液 (0. 1% 甲酸 50% 乙腈 ) 平衡将蛋白酶解多肽混合物溶于 0. 1% 甲酸溶液中, 用平衡后的 TiO 2 亲和吸头反复吸取样品再用清洗液 (0. 1% 甲酸 50% 乙腈 100 mmol / L KCl) 清洗, 最后用 1% 氨水将吸附的磷酸化多肽洗脱下来, 冻干后 -20 益保存 2. 4 摇液相色谱鄄质谱质联用分析所有干燥的多肽样品均溶解在缓冲液 A(0. 1% 甲酸 99% 水 +1% 乙腈 +0. 1% 甲酸 ) 中, 再经 C 18 反相毛细管色谱柱 (100 mm 伊 mm) 分离以 0. 1% 甲酸和乙腈为流动相进行梯度洗脱, 洗脱梯度为 5% ~ 40% 缓冲液 B(B: 99% 乙腈 +1% 水 +0. 1% 甲酸 ), 洗脱时间为 180 min, 流速为滋 L / min 经毛细管反相色谱洗脱出的多肽应用 LTQ Orbitrap 质谱分析, 质核比检测范围为 400 ~ 2000 amu 应用数据依赖方式进行二级质谱扫描, 每个全扫描后进行 5 个二级扫描, 碰撞能量为 35%, 动态排除时间为 2 min 2. 5 摇质谱数据处理将质谱数据传输到数据处理工作站, 使用 Thermo Proteome Discoverer 1. 1 软件进行分析采用 SEQUEST 模式, 在国际蛋白质索引中的人类数据库 (International Protein Index) 进行蛋白质检索检索参数 : 所使用蛋白酶为胰蛋白酶 (Trypsin), 允许最多 2 个漏切位点, 母离子和子离子允许最大误差分别为 50 ppm 和 0. 8 Da 半胱氨酸 (Cys) 烷基化为固定修饰, 丝氨酸 ( Ser) 苏氨酸( Thr) 酪氨酸( Tyr) 的磷酸化以及甲硫氨酸 ( Met) 的氧化为可变修饰 SEQUEST 检索后将肽段可信度参数 ( Peptide Confi 鄄 dence) 设为高 (High), 对所得结果进行筛选采用人工解析结合软件从头测序的方法, 对没有匹配结果的质谱数据进行分析 3 摇结果与讨论 3. 1 摇 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白的分离富集将带有 6 伊 His 标签的 14 鄄 3 鄄 3 着全长序列的质粒转染 HEK293 细胞, 在含有 10% 胎牛血清的 DMEM

第 11 期李子健等 : 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白磷酸化修饰的生物质谱分析摇 1655 摇培养基中 37 益培养 36 h 后, 弃去培养液, 经 PBS 缓冲液洗涤 3 次, 收集并裂解细胞通过镍离子亲和树脂富集 SDS 鄄 PAGE 电泳分离, 在分子量 30 kda 处获得高纯度 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白, 结果如图 1 3.

2% 值得注意的是, 尽管已将丝氨酸 ( Ser ) 苏氨酸摇图 1 摇镍离子亲和树脂富集纯化的 14 鄄 3 鄄 3 着 (Thr) 酪氨酸(Tyr) 的磷酸化修饰加入到数据库检索参数中, 蛋白的十二烷基硫酸钠鄄聚丙烯酰胺凝胶最终还是没有得到可信的磷酸化修饰的肽段的结果图 2 列电泳 (SDS 鄄 PAGE) 图谱出了 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白鉴定结果的肽段分布情况 Fig.

3 第 11 期李子健等 : 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白磷酸化修饰的生物质谱分析摇 1655 摇培养基中 37 益培养 36 h 后, 弃去培养液, 经 PBS 缓冲液洗涤 3 次, 收集并裂解细胞通过镍离子亲和树脂富集 SDS 鄄 PAGE 电泳分离, 在分子量 30 kda 处获得高纯度 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白, 结果如图摇 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白的质谱鉴定摇切取 30 kda 处的一条主要电泳条带, 经过脱色胶内水解肽段反复抽提, 得到蛋白酶解肽段混合物在进行磷酸化修饰分析之前, 先将酶解肽段混合物直接经液质分析, 将所得质谱数据在蛋白数据库中进行检索结果显示, 共有 22 个特异的水解肽段在 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白中得到很好的匹配 ( 不包括重复鉴定的肽段 ), 覆盖率达到 52. 2% 值得注意的是, 尽管已将丝氨酸 ( Ser ) 苏氨酸摇图 1 摇镍离子亲和树脂富集纯化的 14 鄄 3 鄄 3 着 (Thr) 酪氨酸(Tyr) 的磷酸化修饰加入到数据库检索参数中, 蛋白的十二烷基硫酸钠鄄聚丙烯酰胺凝胶最终还是没有得到可信的磷酸化修饰的肽段的结果图 2 列电泳 (SDS 鄄 PAGE) 图谱出了 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白鉴定结果的肽段分布情况 Fig. 1 摇 SDS 鄄 PAGE of 14 鄄 3 鄄 3 着 protein purified 3. 3 摇 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白磷酸化位点的质谱分析 by nickel 鄄 charged hexahistidine resin 在质谱的正离子分析模式下, 当磷酸化修饰肽段与未磷图 2 摇 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白的一级结构方框内部分为质谱分析得到的匹配肽段 Fig. 2 摇 Primary structure of 14 鄄 3 鄄 3 着 protein. The tryptic peptides identified by LC 鄄 MS / MS analysis are highlighted 酸化修饰肽段进样进行检测时, 由于磷酸基团带负电荷, 使得磷酸化修饰肽段在离子源中的离子化效率远低于未磷酸化修饰肽段此外, 在多数情况下, 在特定蛋白中的磷酸化修饰肽段的化学计量丰度较低这些因素使得磷酸化修饰的肽段在常规蛋白质质谱分析中不容易被检测到因此, 通常利用各种方法将磷酸化肽段进行预分离和富集, 尽量减少高背景的非磷酸化肽段的离子化竞争, 从而达到提高磷酸化肽段的质谱检测灵敏度的目的目前较成熟的磷酸化肽段富集方法主要有固定化的金属离子亲和树脂富集和金属氧化物亲和层析其中, 金属氧化物亲和层析是利用具有两性表面特性的 TiO 2 ZrO 2 和 Fe 3 O 4 等金属氧化物, 其表面的 Lewis 酸位点与磷酸根具有很强的亲和作用, 因此能够被用于富集磷酸化肽段有报道指出, 该方法对磷酸化肽段的选择特异性优于固定化金属离子亲和层析技术 [12,13] 在磷酸化修饰多肽的 MS / MS 分析中, 由于含有丝氨酸 ( Ser) 或苏氨酸 ( Thr) 的磷酸化多肽容易发生茁鄄消除反应 ( 茁鄄 Elimination reaction), 造成磷酸基团的中性丢失这样得到的 MS / MS 谱图中通常能观察到中性丢失后的分子离子峰, 同时还混有中性丢失后的分子离子发生二次碎裂产生的离子这些二次碎裂的离子会干扰数据库检索的结果, 使得某些磷酸化修饰的多肽的得分较低而不能被检测出来因此需要对相关谱图进行仔细分析, 并参考数据库检索的结果, 解析出谱图所对应的的磷酸化修饰多肽的序列信息以 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白中第 216 ~ 225 位的 DSTLIMQLLR 的质谱分析为例, 说明其中第 217 位的丝氨酸 (S) 的磷酸化修饰的分析过程图 3a 是 m / z = 的双电荷分子离子的 MS / MS 质谱图, 经数据库检索得知此谱图所对应肽段应为 DSTLIMQLLR 各种碎片离子, 如大部分 b 和 y 系列碎片离子都能得到归属图 3b 为另一双电荷分子离子的 MS / MS 质谱图, 具有与图 3a 类似但不完全相同的碎片离子其 m / z = , 与图 3a 的 m / z = 相差 8, 所以二者的表观分子量相差 16, 提示图 3b 所对应肽段可能为图 3a 所对应肽段的氧化形式 ( +16) 将图 3a 和 3b 谱图进行仔细比对, 最终确认图 3b 所对应肽段为 DSTLImQLLR, 其中 221 位的甲硫氨酸 (M) 发生了氧化修饰图 3c 为 m / z = 的双电荷分子离子的 MS / MS 质谱图, 可见 m / z = 的双电荷分子离子基峰, 应为母离子中性丢失 98( 拽 2 妆庄 4) 后

4 1 摇 656 摇分析化学第 41 卷的产物, 因此母离子很可能是磷酸化修饰肽段进一步对图中其它碎片离子进行分析, 证实此谱图所对应的肽段序列为 DS * TLImQLLR, 即在 217 位的丝氨酸 (S) 发生磷酸化修饰从图 3c 可见, 除了部分的 b 和 y 系列碎片离子外, 还发现一些母离子中性丢失后的二次碎裂产物这些二次碎裂离子尽管在蛋白数据库检索时会干扰磷酸化修饰位点的定位, 但在人工解谱的过程中却能帮助提供所分析肽段的一级序列信息图 3 摇 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白中第 217 位的丝氨酸 (S) 的磷酸化修饰的的质谱分析 (a)m / z 的双电荷分子离子峰的串联质谱图, 对应序列为 DSTLIMQLLR(216 ~ 225) ( b) m / z 的双电荷分子离子峰的串联质谱图, 对应序列为 DSTLImQLLR(216 ~ 225), 其中甲硫氨酸 (M) 被氧化修饰 (c) m / z 的双电荷分子离子峰的串联质谱图, 对应序列为 DS * TLImQLLR(216 ~ 225), 其中甲硫氨酸 (M) 被氧化修饰丝氨酸 (S) 被磷酸化修饰 Fig. 3 摇 MS / MS analysis of phosphorylation modification at Serine 217 in 14 鄄 3 鄄 3 着 protein. ( a) MS / MS spectrum of a doubly 鄄 charged peak at m/ z , which is identified as DSTLIMQLLR( ). (b)ms / MS spectrum of a doubly 鄄 charged peak at m/ z The corresponding peptide is identified as DSTLImQLLR ( ), of which the Methionine residue is oxidized. (c)ms / MS spectrum of a doubly 鄄 charged peak at m / z , which is identified as DS * TLImQLLR( ). Besides the Methionine residue is oxidized, the Serine 217 is identified to be phosphorylated 本研究利用 TiO 2 亲和层析对 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白中的磷酸化肽段进行富集, 再进行液相色谱鄄质谱分析, 通过数据库检索结合人工解析谱图的方法, 鉴定出了 12 个磷酸化修饰位点 ( 表 1) 对于 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白而言, 第 59 位的丝氨酸的磷酸化修饰已经有文献报道 [8], 在本研究中也得到验证 ( 见表 1 中第 58 ~ 69 位置的肽段 AS * WRIISSIEQK) 其它位置的磷酸化修饰位点均未见报道表 1 摇在 HEK293 细胞中过表达的 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白所含磷酸化修饰肽的鉴定 Table 1 摇 Identification of phosphopeptides within 14 鄄 3 鄄 3 着 protein over 鄄 expressed in HEK293 cells 磷酸化修饰肽 Phosphopeptides 实验 m / z ( 单同位素峰 ) Experimental m / z (mono) 理论 m / z ( 单同位素峰 ) Theoretical m / z (mono) 电荷 Charge 在蛋白中的位置 Position in protein NLLS * VAYKNVIGAR ~ 56 NLLS * VAY * KNVIGAR ~ 56 NLLS * VAY * K * NVIGAR ~ 56 AS * WRIISSIEQK ~ 69 HLIPAANT * GES * K ~ 118 GDY * HRY * LAEFAT * GNDRK ~ 142 GDY * HRY * LAEFAT * GNDR ~ 141 AASDIAmT * ELPPT * HPIR ~ 170 DS * TLImQLLR ~ 225 EY * RQMVETELK ~ 94 EY * RQmVETELK ~ 94 表注 : T * S * Y * 分别为苏氨酸 (Thr,T) 丝氨酸(Ser,S) 酪氨酸(Tyr,Y) 的磷酸化形式 ;K * 为赖氨酸 (Lys,K) 的乙酰化形式 ;m 为甲硫氨酸 (Met,S) 的氧化形式 Note: T *, S *, Y * refer to the phosphorylated form of threonine (Thr, T), serine (Ser, S) and tyrosine (Tyr, Y), respectively; K * refers to acetylatedlysine (Lys, K); m refers to the oxidize from of methionine (Met, S). 摇摇除磷酸化修饰外, 还发现了在第 50 位的赖氨酸 ( K) 的乙酰化修饰图 4a 为双电荷 m / z = 的 MS / MS 谱图经数据库检索, 辅助以人工解谱和验证, 证实此谱图所对应肽段为 NLLS * VAY * KNVI 鄄 GAR, 其中第 46 位的丝氨酸 (S) 和 49 位的酪氨酸 (Y) 发生磷酸化修饰在图 4a 中观察到母离子中性丢失 98 的分子离子峰 m / z 图 4b 为一双电荷 m / z = 的 MS / MS 谱图仔细分析其碎片

5 第 11 期李子健等 : 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白磷酸化修饰的生物质谱分析摇 1657 摇信息, 发现在低质量区有 m / z 175 离子, 所以推断此谱图所对应肽段的羧基末端应为精氨酸 ( R) 同样, 在图 4b 中可观察到母离子中性丢失 98 的分子离子峰 m / z , 所以此肽段极有可能是磷酸化修饰肽在低质量区的系列碎片离子表明, 该肽段可能含有 VIGAR 序列, 具有与图 4a 所对应肽段相同的氨基酸序列综合考虑以上分析得出的结构信息, 再参照 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白的理论序列, 确定图 4a 和 4b 所对应肽段具有完全相同的一级氨基酸序列, 并且都在第 46 和 49 位发生磷酸化修饰所不同的是, 图 4b 所对应的肽段在第 50 位的赖氨酸 (K) 发生乙酰化修饰, 导致这两个肽段分子量相差 42 Da 图 4 摇 (a)m / z 的双电荷分子离子峰的串联质谱图, 对应序列为 NLLS * VAY * KNVIGAR(43 ~ 56), 其中丝氨酸 (S) 和酪氨酸 (Y) 被磷酸化修饰 (b)m / z 的双电荷分子离子峰的串联质谱图, 对应序列为 NLLS * VAY * K * NVIGAR(43 ~ 56), 其中除丝氨酸 (S) 和酪氨酸 (Y) 被磷酸化修饰外, 第 50 位的赖氨酸 ( K) 发生乙酰化修饰 Fig. 4 摇 (a)ms / MS spectrum of a doubly 鄄 charged peak at m / z , which is identified as NLLS * VAY * KNVI 鄄 GAR(43-56), of which both Serine 46 and Tyrosine 49 are identified to be phosphorylated. ( b) MS / MS spectrum of a doubly 鄄 charged peak at m / z The corresponding peptide is identified as NLLS * VAY * K * NVIGAR (43-56). Besides both Serine 46 and Tyrosine 49 are phosphorylated, Lysine 50 is identified to be acetylated 摇摇蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的作用它使蛋白质的结构更为复杂, 功能更为完善, 调节更为精细, 作用更为专一为研究蛋白质翻译后修饰的功能和作用, 在真核细胞内过表达相 [14 ~ 应的蛋白质及其修饰位点的突变体 ( 突变后不能够被修饰 ) 已被大量研究应用 16] 真核细胞过表达蛋白质是利用携带编码该蛋白质的 cdna 质粒转染进入真核细胞, 利用真核细胞作为蛋白质合成器进行蛋白质合成 [17,18] 所以, 过表达蛋白质在氨基酸的一级序列及空间结构上与内源性蛋白质是完全一致的, 其在真核细胞内的翻译后修饰与内源性蛋白质也完全相同但值得注意的是, 利用原核细胞过表达的蛋白质, 尽管其在氨基酸的一级序列与内源性蛋白质是一致的, 但在空间结构和翻译后修饰上则与真核内源性蛋白质有很大不同因此, 应特别注意同一蛋白质在真核细胞和原核细胞中表达过程中的翻译后修饰的差别 3. 4 摇小结本研究在 HEK293 细胞中过量表达了人 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白, 并通过镍离子亲和树脂富集和凝胶电泳得到高纯度的目标蛋白利用 TiO 2 亲和层析结合生物质谱技术对 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白中磷酸化修饰进行分析, 借助人工图谱解析, 找到 14 鄄 3 鄄 3 着蛋白分子中的 12 个磷酸化修饰位点, 其中多数位点的磷酸化修饰为首次报道研究结果为进一步研究不同亚型的 14 鄄 3 鄄 3 蛋白的磷酸化修饰状态与其生物学活性关系的研究提供了方法学的参照和基础的质谱数据致谢摇感谢美国 Emory 大学医学院药理学系 Haian Fu 教授提供 14 鄄 3 鄄 3 着质粒 References 1 摇 Moore B W, Perez V J. Physiological and Biochemical Aspects of Nervous Integration, New Jersey: Prentice Hall, 1967:

6 1 摇 658 摇分析化学第 41 卷 2 摇 Bustos D M. Mol Biosyst., 2012: 摇 Porter G W, Khuri F R, Fu H. Semin Cancer Biol., 2006, 16(3): 摇 Gardino A K, Yaffe M B. Semin Cell Dev. Biol., 2011, 22(7): 摇 Zhao J, Meyerkord C L, Du Y, Khuri F R, Fu H. Semin Cell Dev. Biol., 2011, 22(7): 摇 Kleppe R, Martinez A, D 覬 skeland S O, Haavik J. Semin Cell Dev. Biol., 2011, 22(7): 摇 Kim Y S, Choi M Y, Kim Y H, Jeon B T, Lee D H, Roh G S, Kang S S, Kim H J, Cho G J, Choi W S. Epilepsy Res., 2010, 92(1): 摇 Megidish T, Cooper J, Zhang L, Fu H, Hakomori S. J. Biol. Chem., 1998, 273(34): 摇 van der Hoeven P C, van der Wal J C, Ruurs P, van Dijk M C, van Blitterswijk J. Biochem. J., 2000, 15 (345): 摇 WANG Zhi 鄄 Wu, SUN Wan 鄄 Chun, ZHOU Yue, CONG Zhong 鄄 Yi, ZHOU Qing 鄄 Wei, LIU Ning. Chinese J. Anal. Chem., 2012, 40 (3): 王志武, 孙万春, 周悦, 丛中一, 周庆伟, 刘宁. 分析化学, 2012, 40 (3): 摇 Liu N, Wang G, Lee KC, Guan Y, Chen H, Cai Z. Faseb J., 2009, 23(10): 摇 SUN Li, ZHAO Hai 鄄 Feng,YANG Guang 鄄 Yuan, HE Cheng 鄄 Yan, SHI Qing 鄄 Hong,SONG Li 鄄 Na,WEN Xue, WANG Xiao 鄄 Ting, ZHAO Li 鄄 Chun. Chinese J. Anal Chem., 2012, 40 (3): 孙莉, 赵海丰, 扬光远, 何成彦, 师庆红, 宋丽娜, 文雪, 王小婷, 赵丽纯. 分析化学, 2012, 40 (3): 摇 Schlosser A, Vanselow J T, Kramer A. Anal. Chem., 2005, 77: 摇 Bai Y, Zhou T, Fu H, Sun H, Huang B. FEBS Lett., 2012, 586(8): 摇 Jang S W, Liu X, Fu H, Rees H, Yepes M, Levey A, Ye K. J. Biol Chem., 2009, 284(36): 摇 Puckett M C, Goldman E H, Cockrell L M, Huang B, Kasinski A L, Du Y, Wang C Y, Lin A, Ichijo H, Khuri F, Fu H. Mol Cell Biol., 2013, 33(11): 摇 Nakayama N, Yokota T, Arai K. Curr. Opin. Biotechnol., 1992, 3(5): 摇 Cohen S, Velan B, Grosfeld H, Shalita Z, Leitner M, Shafferman A. Dev. Biol. Stand., 1985, 60: Mass Spectrometric Analysis of Phosphorylation Modification in 14 鄄 3 鄄 3 着 Protein LI Zi 鄄 Jian 1, HE Xin 2, PAN Chen 鄄 Yu 3, LIU Ning *3 1 (Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, Key Laboratory of Cardiovascular Molecular Biology and Regulatory Peptides, Ministry of Health, Key Laboratory of Molecular Cardiovascular Sciences, Ministry of Education and Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, Beijing , China) 2 (Department of Chemistry, Jilin University, Changchun , China) 3 (The Second Hospital, Jilin University, Changchun , China) Abstract 摇 In the present study, 14 鄄 3 鄄 3 着 protein was over 鄄 expressed in HEK293 cells, which was genetically attached with 6 伊 His tag. The protein was purified by nickel 鄄 charged hexahistidine resin as well as gel electrophoresis, and then was subject to tryptic digestion. The phosphorylated peptides within 14 鄄 3 鄄 3 着 protein were enriched by TiO 2 affinity chromatography, followed by mass spectrometry analysis. 12 phosphorylation sites along the primary structure of 14 鄄 3 鄄 3 着 protein were identified, most of which had not been reported previously. Our results indicate that bio 鄄 mass spectrometry coupled with manual interpretation can be used to successfully identify the phosphorylation modification in 14 鄄 3 鄄 3 着 protein over 鄄 expressed in HEK293 cells. Keywords 摇 Mass spectrometry; 14 鄄 3 鄄 3 着 protein; Phosphorylation (Received 3 June 2013; accepted 22 July 2013)

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Mixtions Pin Yin Homepage an tai yin 安胎饮 775 ba wei dai xia fang 八味带下方 756 ba zhen tang 八珍汤 600 ba zheng san 八正散 601 bai he gu jin tang 百合固金汤 680 bai hu jia ren shen tang 白虎加人参汤 755 bai hu tang 白虎汤 660 bai