22 卷王川等 225 的产品, 会使农民错过采摘期和上市期, 或者农药残留依然较高. 杀扑磷毒性大, 环境中残留的杀扑磷对生态会造成破坏. 本研究通过筛选杀扑磷高效降解菌并优化降解条件, 可为进一步研究杀扑磷污染地区环境修复杀扑磷污水处理菌种优化相关基因克隆表达和使农产品在采摘前尽快使杀扑磷

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梧学黎
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1 DOI: /SP.J 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 2016,22 ( 2 ) : 一株杀扑磷高效降解菌的分离鉴定及降解条件的响应面法优化 * 王川冯灵玉曹瑜吴茜张玮佳付佳琪曹毅乔代蓉 ** 四川大学生命科学学院微生物与代谢工程四川省重点实验室成都 664 摘要有机磷杀虫剂杀扑磷对防治蚧壳虫有特效, 常用于柑橘类果树防治但其残留有毒有害, 自然界降解速度比较缓慢. 本研究分离并分类鉴定了能高效降解杀扑磷的菌株, 进一步采用 Box-Benhnken 法设计 3 因素 3 水平的响应面试验优化降解条件. 结果显示, 从富集培养基中分离到了一株杀扑磷高效降解细菌 MS1-2, 经鉴定为膝形假单胞菌 (Pseudomonas geniculata); 单因素选择温度 NaCl 浓度和 ph, 通过检测杀扑磷残留量对杀扑磷降解条件进行响应面优化, 转速设置为 r/min, 接种量为 0.4% 时, 温度和 NaCl 浓度为主要影响因素,pH 为次要因素, 最佳降解条件为温度 29.74,pH 6.48,NaCl 浓度 0.63%. 在此条件下培养 24 h, 杀扑磷从 mg/l 降解到 mg/l, 降解率为 42.27%, 比优化前提高了 6 个百分点. 因此菌株 MS1-2 能有效降解杀扑磷, 优化降解条件后降解率有所提高. ( 图 5 表 5 参 11) 关键词杀扑磷 ; 降解 ; 膝形假单胞菌 ; 响应面优化 CLC X172 An effective methidathion-degrading bacterial strain and its degrading condition optimization with the response surface method* WANG Chuan, FENG Lingyu, CAO Yu, WU Qian, ZHANG Weijia, FU Jiaqi, CAO Yi & QIAO Dairong ** Microbiology and Metabolic Engineering Key Laboratory of Sichuan Province, College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 664, China Abstract Organophosphorus pesticides including methidathion are generally highly toxic with residues harmful to health but slow in degradation in nature. This research aimed to isolate a bacterium which can degrade methidathion efficiently, and optimize its conditions of degradation by the response surface method. The strain MS1-1 was enriched with enrichment culture and purified by the streaked plate, and determined based on the 16S rdna sequence analysis. Degradation of methidathion was determined by high performance liquid chromatography at 24 hours after inoculation. A bacterial strain MS1-2 that could effectively degrade methidathion was isolated from soil and identified as Pseudomonas geniculata. A 3-factor, 3-level Box-Benhnken experiment was designed to select the temperature, ph and NaCl concentration. The optimal conditions for methidathion degeneration were found to be rotational speed of shaking incubator of r/min, inoculation amount of 0.4%, inoculum OD600 of 0.53, culture temperature of C, ph of 6.48 and NaCl concentration of 0.63%. The degradation rate was 42.27% after culture for 24 h under these conditions, 6% higher than that in previous optimization. Keywords methidathion; degradation; Pseudomonas geniculata; response surface optimization 由于人口日益增长, 越来越多的化肥和农药被用来提高粮食的生产. 有机磷农药是我国使用量最大的杀虫剂, 一般属于高毒, 每年因为有机磷农药造成的中毒事件时有发生. 有机磷农药通常通过皮肤粘膜呼吸道和消化道进入体内, 随即扩散到全身脏器, 一般通过抑制乙酰胆碱酯酶活性引起中毒症状, 是一类典型的神经性毒物. 收稿日期 Received: 接受日期 Accepted: * 十二五支撑计划项目 (2014BAD02B02) 和四川省科技厅项目 (2012GZ0008,2014GZX0005,2013GZ0058,2013GZX0161-3, 2015JPT0032, ) 资助 Supported by the Sci-tech Pillar Project of the Twelfth Five-year Plan of China (2014BAD02B02), and the Project of the Science and Technology Department of Sichuan Province (2012GZ0008, 2014GZX0005, 2013GZ0058,2013GZX0161-3, 2015JPT0032, ) ** 通讯作者 Corresponding author ( scuqiaodr@163.com) 杀扑磷 (Methidathion)( S-2,3- 二氢 -5- 甲氧基 -2- 氧代 -1,3,4- 噻二唑 -3- 基甲基 -O,O- 二甲基二硫代磷酸酯 ) 又称速扑杀甲噻硫磷麦达西磷等, 是一种高毒的非内吸性广谱有机磷农药, 市售 40% 乳油产品属于中等毒性, 一般用于柑橘类果树, 对蚧壳虫具有良好的杀灭作用 [1], 对其他害虫也有一定的效果, 目前杀扑磷还是效果最好的杀蚧壳虫农药. 随着国家对甲胺磷对硫磷甲基对硫磷久效磷和磷胺 5 种高毒有机磷农药的禁用, 杀扑磷作为杀蚧壳虫的特效药剂已越来越多地被人们所使用. 但正常环境下杀扑磷降解很慢 [2], 容易对环境形成持续毒害. 目前, 有机磷农药的使用正被慢慢取代, 但还将使用较长时间. 甚至在某些地区, 还能检测到已被禁用多年的有机磷农药. 目前国内研究杀扑磷微生物降解的很少, 因此研究杀扑磷降解微生物很有必要. 农作物有一定的保质期, 如果使用农药降解效果不好

22 卷王川等 225 的产品, 会使农民错过采摘期和上市期, 或者农药残留依然较高. 杀扑磷毒性大, 环境中残留的杀扑磷对生态会造成破坏. 本研究通过筛选杀扑磷高效降解菌并优化降解条件, 可为进一步研究杀扑磷污染地区环境修复杀扑磷污水处理菌种优化相关基因克隆表达和使农产品在采摘前尽快使杀扑磷残留降低到许可标准提供应用基础. 1 材料与方法 1.

2 22 卷王川等 225 的产品, 会使农民错过采摘期和上市期, 或者农药残留依然较高. 杀扑磷毒性大, 环境中残留的杀扑磷对生态会造成破坏. 本研究通过筛选杀扑磷高效降解菌并优化降解条件, 可为进一步研究杀扑磷污染地区环境修复杀扑磷污水处理菌种优化相关基因克隆表达和使农产品在采摘前尽快使杀扑磷残留降低到许可标准提供应用基础. 1 材料与方法 1.1 实验材料 40% 杀扑磷乳油 ( 浙江禾本科技有限公司 ), 杀扑磷原药 ( 山东某农药厂 ), 杀扑磷标准品 ( 上海市农药研究所有限公司 ), 甲醇 ( 德国默克公司 ). 杀扑磷原药甲醇溶液 : 取 5.0 g 杀扑磷原药, 溶于甲醇, 用 50 ml 容量瓶定容后备用. 无机盐培养基 (MSM)( g/l):mgso 4 7H 2 O 0.2 g, NH 4 NO g,(nh 4 ) 2 SO g,kh 2 PO g,k 2 HPO g, NaCl 0.5 g,feso 4 痕量,MnSO 4 痕量,pH 自然,121 灭菌 20 min, 固体培养基加 2% 琼脂. 1.2 杀扑磷降解菌的富集与分离采集使用 40% 杀扑磷乳油倍液 (1-2 周 ) 和 200 倍液喷洒 3 个月后植物根际土壤 (5-10 cm 深 ), 过 10 目筛后置于 4 冰箱备用. 在 MSM- 杀扑磷液体培养基中加入配好的杀扑磷原药甲醇溶液, 每 ml 培养基加 1 ml, 使杀扑磷原药终浓度为 mg/l. 培养基在 37 摇床温育 24 h 使甲醇尽量挥发掉, 之后加入 10%(m/V) 土壤, 于 30 摇床 180 r/min 培养 6 d. 每次完成后吸取 200 μl 培养液转接到新的培养基中, 重复做 5 次. 吸取 μl 最后一次的培养液, 均匀涂布于 MSM- 杀扑磷平板 ( 预先在 37 培养箱中放置 24 h), 于 30 恒温培养箱中培养 3 d, 反复挑选单菌落划线纯化, 重复做 5 次. 1.3 菌株鉴定使用 16S rrna 基因序列测序, 与 NCBI 数据库进行比对, 并做系统发育树和生理生化试验确定菌株种属. 1.4 样品处理培养 24 h 后发酵液经过 r/min 离心 5 min, 上清液用 0.22 μm 有机系针筒式滤膜过滤器过滤, 装入自动进样瓶备用. 扫描电镜样品经过戊二醛固定漂洗和乙醇脱水后, 进行临界点干燥 [3]. 1.5 杀扑磷降解条件优化的单因素试验针对 5 个对杀扑磷降解率直接相关的因素进行单因素试验,5 个因素分别为温度 ph NaCl 浓度 (m/v) 摇床转速和初始杀扑磷浓度. 其中, 温度分别为 , ph 分别为 ,NaCl 浓度分别为 0% 0.5% 1% 1.5% 2%, 摇床转速分别为 r/min, 初始杀扑磷浓度分别为 mg/l. 1.6 高效液相色谱条件高效液相色谱 (HPLC) [4] 是一种常用的分析方法, 在农药残留检测上使用也较多, 可以检测杀扑磷残留浓度, 计算降解率. 仪器方法和杀扑磷浓度计算公式参考国家标准 [5]. 1.7 响应面优化在单因素结果基础上, 进行响应面优化试验. 选取 3 因素 3 水平输入 Design-Expert 软件生成响应面试验组 ( 表 1). 1.8 优化效果评估用降解前的培养基杀扑磷浓度作为对照, 优化前的条件和优化后的条件作为实验组, 用 HPLC 检测残留浓度, 计算降解率. 1.9 数据处理试验结果使用 Design-Expert 软件处理, 分析得到最优降解条件, 并验证降解效果. 2 结果与分析 2.1 分离与鉴定共分离到 5 株细菌, 形态学描述及种属鉴定如表 1 所示. 表 1 鉴定结果及形态学描述 Table 1 Identification results and morphological descriptions 菌株编号 Number MS1-2 MS1-3 MS2-2 MS2-3 MS2-4 形态学描述 Morphological descriptions 白色或淡黄色, 圆形, 表面及边缘光滑, 略透明, 较潮湿,d 0.5 mm. Colonies are white or light yellow, round, slightly transparent, a little wet with smooth surface and edge, d 0.5mm. 淡黄色, 圆形, 表面光滑, 较透明,d 0.5 mm. Colonies are light yellow, round, more transparent with smooth surface, d 0.5mm 边缘黄中间白, 圆形, 表面及边缘粗糙, 不透明,d 2 mm, 液体培养呈球状 Colonies are round and have yellow edge and white central, roughness surface and edge, opaque, d 2 mm. It becomes globular in liquid medium. 白色, 圆形, 不透明, 很小 Colonies are white, round, opaque and very small. 淡黄色, 圆形, 表面及边缘光滑, 潮湿, 不粘稠, 不透明,d 1 mm, 菌液淡绿色 Colonies are light yellow, round, wet, not sticky, opaque with smooth surface and edge, d 1 mm. Bacterial liquid become light green after culture. 种属 Species 膝形假单胞菌 P. geniculata 假单胞菌属 Pseudomonas sp. 链霉菌属 Streptomyces sp. 鞘氨醇单胞菌属 Sphingomonas sp. 铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa 其中, 分离到一株杀扑磷降解菌, 编号为 MS1-2, 其在平板上的生长速度与生长量远大于其他菌. 经 16S rrna 基因测序, 比对结果与膝形假单胞菌 (Pseudomonas geniculata) 寡养单胞菌属 (Stenotrophomonas maltophilia) 相似度均为 %. 与模式菌株对比发现, 膝形假单胞菌最适生长温度为 30, 而寡养单胞菌属为 35 且菌落颜色为黄色. 根据最适温度菌落颜色和系统发育树判断为菌株 MS1-2 为膝形假单胞菌 P. geniculata, 其平板照片及革兰氏染色照片见图 1, 系统图 1 菌株 MS1-2 的平板照片及革兰氏染色照片. MS1-2 革兰氏染色为阴性. Fig. 1 Plate photo of Strain MS1-2 and its gram staining. Gram stain of MS1-2 is gram negative. Chin J Appl Environ Biol 应用与环境生物学报

226 一株杀扑磷高效降解菌的分离鉴定及降解条件的 2 期 55 90 MS1-2 Pseudomonas geniculata AB021404 Pseudomonas hibiscicola AB021405 98 Stenotrophomonas maltophilia AB021406 99 67 Stenotrophomonas maltophilia JALV00036

3 226 一株杀扑磷高效降解菌的分离鉴定及降解条件的 2 期 MS1-2 Pseudomonas geniculata AB Pseudomonas hibiscicola AB Stenotrophomonas maltophilia AB Stenotrophomonas maltophilia JALV00036 Stenotrophomonas pavanii FJ Stenotrophomonas chelatiphaga EU Stenotrophomonas koreensis AB Stenotrophomonas ginsengisoli DQ Stenotrophomonas humi AM Stenotrophomonas terrae AM Stenotrophomonas nitritireducens AJ [9] 图 2 菌株 MS1-2 的系统发育树. 该系统发育树使用邻接法构造. Bootstrap 值 ( 表示次重复中的百分比 ) 大于 50% 的显示在分支上表示每个碱基位置有 2 个不同. Fig. 2 Rooted phylogenetic tree for Strain MS1-2. The tree was constructed using the neighbour-joining method. Bootstrap values (expressed as percentages of replications) greater than 50% are shown at branch points. Bar: substitutions per nucleotide position. 发育树如图 2 所示, 扫描电镜照片见图 r/min, 发现在 r/min 时杀扑磷降解率最大,200 r/min 时杀扑磷降解率最小. 在实际试验过程中, 我们发现这一结果跟我们的试验是一致的, 因此选用 r/min 作为固定条件. 而初始杀扑磷浓度在低于 75 mg/l 时降解率最高, 大于 75 mg/ L 时降解率相对稳定. 同时为了与已报道菌株作对比, 我们也 50 图 3 菌株 MS1-2 的扫描电镜照片. 细胞长度约 1.0 μm, 宽度约 0.8 μm. Fig. 3 Scanning electronic micrograph for Strain MS1-2. Cells are about 1.0 μm long and 0.8 μm in diameter. Degradation rate (r/%) Temperature (θ ) 2.2 优势菌种分析实验中一共分离到 5 株细菌, 从鉴定结果可以看到假单胞菌属的菌占了绝大多数, 根据文献报道, 我们发现假单胞 [6-7] 菌中有很多能降解农药和其他有毒物质, 如一株恶臭假单胞菌能去除水体中的汞 [8]. 2.3 单因素试验结果根据 HPLC 的峰面积计算, 杀扑磷原药的纯度为 99.0%, 因此杂质对试验的影响基本可以忽略不计. 为了获得在单一碳源 ( 杀扑磷 ) 条件下最佳的降解效果, 做了 5 个单因素, 分别是温度 ph NaCl 浓度以及转速和初始杀扑磷浓度. 从单因素结果可以看到 : 菌株 MS1-2 培养温度在 30 时降解效果最好,NaCl 浓度在 0.5% 时降解效果最好,pH 在 6.5 时降解效果最好, 过大或过小均会使降解效果降低 ( 图 4). 其中, 温度和 NaCl 浓度对降解率的影响很显著,pH 影响相对较小. 另外, 目前以 Li Chuang 等报道的杀扑磷降解菌效果最好 [10], 他们对转速优化时, 转速设置为 r/min 150 r/min 和 Degradation rate (r/%) Degradation rate (r/%) NaCl NaCl concentration (w/%) ph 图 4 温度 NaCl 浓度和 ph 对杀扑磷降解率的影响. Fig. 4 Effects of temperature, NaCl concentration and initial ph on the degradation rate of methidathion. 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol

4 22 卷王川等 227 选取 mg/l 作为初始杀扑磷浓度. 培养基装填比例与之基本相同, 棉塞封口. 2.4 响应面优化结果降解率测定由于试验周期长, 为了尽可能减少误差, 做单因素试验响应面试验和验证优化后降解率的提高时分别使用了不同批次的菌液, 因此单因素试验和响应面试验的降解率是有差别的. 温度选择 30,pH 选择 6.5,NaCl 浓度选择 0.5% 作为响应面初始条件, 设计 3 因素 3 水平的响应面试验 ( 表 2) [11], 设计试验使用 HPLC 对降解率进行测定 ( 表 3). 表 2 因素和水平 Box-Benhnken 设计表 Table 2 Factors and levels of Box-Benhnken design 因素 Factor 因素水平和编码 Levels and coding 温度 Temperature (θ/ ) NaCl 浓度 Concentration of NaCl (w/%) ph 表 3 响应面设计及结果 Table 3 Response surface design and results 温度 (θ/ ) NaCl 浓度 (w/%) ph Temperature NaCl concentration 试验号 Run 降解率 (r/%) Degradation rate 使用 Design-Expert 对表 3 数据进行多元回归拟合, 得到相应的二次多项回归模型 : 降解率 = ( A B C AB AC 0.70BC 1.80A B C 2 ) %, 其中, A 代表温度,B 代表 ph,c 代表 NaCl 浓度. 对该模型进行显著性检验, 其回归模型系数的显著性检验结果见表方差分析方差分析结果由 Design-Expert 软件生成, 如表 4 所示. 模型 P 值小于 , 说明该回归模型极为显著. 回归模型的失拟项 (P Lack of fit )= > 0.05, 失拟不显著. 并且该模型复相关系数 R 2 = , 表明此模型有着良好的拟合程度及较小的试验误差, 同时较高的信噪比值 (Adeq precision = > 4) 说明该模型可以用于响应值的预测. 本实验的 C.V. 值较低, 为 2.81%, 表明该模型的实验可信度较高. 综上所述, 该模型适合分析菌株 MS1-2 降解杀扑磷的最佳条件. 回归模型的检验结果表明, 回归方程的一次项 B 不显著,A C 极显著, 二次项均极显著. 交互项均不显著各因素交互作用分析使用 Design-Expert 软件生成各因素交互作用的三维图形和等高线 ( 图 5). 杀扑磷降解率随着温度和 ph 温度和 NaCl 浓度以及 ph 和 NaCl 浓度的增加均呈现先提高后下降的趋势 ( 图 5), 并在中心点附近达到最大值, 这表明只有当温度 ph 和 NaCl 浓度均处于适中水平时, 才能得到最大的降解率. 由等高线图可以知道,3 个单因素之间的交互作用不显著最优降解条件根据 Design-Expert 软件分析结果, 在温度为 29.74,pH 为 6.48,NaCl 浓度为 0.63% 时杀扑磷残留量最少, 即此时降解率最高. 将降解前的培养液作为空白对照,24 h 后降解后的培养液作为实验组, 优化前条件为 30, NaCl 浓度 0.05%,pH 为 7.0. 实验接种 200 μl 菌液, 其 OD 600 nm 值为优化前降解率为 36.3%, 优化后为 42.3%, 较优化前提高了 16.5%, 降解效果与已报道菌株相比要好很多 ( 表 5). 3 结论和讨论本研究筛选到一株杀扑磷高效降解菌 MS1-2, 经鉴定为膝形假单胞菌 (P. geniculata). 假单胞菌属菌占分离得到菌表 4 方差分析表 Table 4 Analysis of variance 来源 Source 平方和 Sum of squares 自由度 d f 均方 Mean square F 值 F-value P 值 P-value Model < 显著 Significant A- 温度 Temperature B-pH C-NaCl 浓度 NaCl concentration AB AC BC A < B C 残差 Residual 失拟 Lack of fit 不显著 Not significant 纯误差 Pure error 总计 Cor total R 2 = ; C.V. = 2.81%; Adeq Precision = Chin J Appl Environ Biol 应用与环境生物学报

5 228 一株杀扑磷高效降解菌的分离鉴定及降解条件的 2期图 5 温度 NaCl浓度和pH及其交互作用对杀扑磷降解率影响的曲面图和等高线图. Fig. 5 Response surface and contour plot of temperature, ph, NaCl concentration and their interactions on degradation of methidathion. 表5 菌株MS1-2与SPL-2杀扑磷降解效果对比 Table 5 Degradation effect of methidathion by strain MS1-2 and SPL-2 菌株编号 Number MS1-2 SPL-2 [10] 转速(v/r min-1) Speed 初始杀扑磷浓度(ρ/mg L-1) Initial concentration of methidathion D600 nm 接种量(φ/%) Inoculum size h降解率(r/%) Degradation rate in 24 h 42.3 (-2.7) %为蒸发引起的杀扑磷减少量. 2.7% is the reduce of methidathion caused by evaporation. 的多数在很多文献报道中假单胞菌属细菌中存在大量有机磷农药和一些其他高毒农药降解基因并且一株有机磷农药降解菌很可能对其他有机磷农药也有一定的降解作用因此今后分离有机磷农药降解菌可以优先考虑从假单胞菌属中筛选. 菌株MS1-2在降解条件优化前对杀扑磷的降解率为应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 36.3% 优化后为42.3% 较优化前提高了16.5%. 由于优化前的温度与优化后的温度十分接近在一定范围内pH对降解率的影响不大因此NaCl浓度是影响优化结果的主要因素. 菌株MS1-2在培养过程中会迅速形成絮状沉淀对其生长曲线测定时发现培养1-3 d后发酵液的od 600 nm值几乎为

6 22 卷王川等 229 零, 但沉淀的体积明显增大, 对沉淀进行扫描电镜观察发现, 大量菌体和纤维状产物交织在一起 ( 图 3), 说明沉淀会吸附菌体. 因此, 过量接种菌液会使得降解率的测定不稳定. 本文首次报道了膝形假单胞菌能降解有机磷农药, 并使用 HPLC 直接对培养液检测杀扑磷浓度, 省去了萃取步骤, 降低了实验误差. 菌株 MS1-2 对杀扑磷的降解效果十分明 [10] 显,24 h 降解率比已报道菌株如 Li Chuang 等人的结果要高 ( 表 5). 因此菌株 MS1-2 为杀扑磷微生物降解提供了新的素材. 本研究虽然对降解条件进行了优化, 但还未对培养基进行优化, 使得菌株 MS1-2 的潜力还未完全发掘出来, 后续将对培养基进行优化以期达到更佳的降解效果. 参考文献 [References] 1 刘书丽. 杀介壳虫特效药杀扑磷 [J]. 农药市场信息, 2006, 19: 35 2 Sait Ç, Şeref K, Türker A. Degradation of some pesticides in the field and effect of processing [J]. Analyst, 1995, 120: 肖媛, 刘伟, 汪艳, 左艳霞, 胡锐, 李婷婷, 崔宗斌. 生物样品的扫描电镜制样干燥方法 [J]. 实验室研究与探索, 2013, 32 (5): [Xiao Y, Liu W, Wang Y, Zuo YX, Hu R, Li TT, Cui ZB. Drying methods of biological sample preparation for scanning electron microscope [J]. Res Explor Lab, 2013, 32 (5): 46-53] 4 宣秋江, 周传光, 徐恒振, 王艳洁, 林忠胜, 姚子伟, 吕景才. 高效液相色谱分离 10 种有机磷农药 [J]. 分析试验室, 2008, 27 (Suppl 5): 许来威, 邢红, 王强, 李云华, 顾少麟. GB , 杀扑磷原药 [S]. 北京 : 中国标准出版社, 柏文琴, 何凤琴, 邱星辉. 有机磷农药生物降解研究进展 [J]. 应用与环境生物学报, 2004, 10 (5): [Bai WQ, He FQ, Qiu XH. Advances in biodegradation of organophosphates [J]. Chin J Appl Environ Biol, 2004, 10 (5): Lakshmi CV, Kumar M, Khanna S. Biotransformation of chlorpyrifos and bioremediation of contaminated soil [J]. Int Biodeter Biodegr, 2008, 62 (2): von Canstein H, Li Y, Timmis KN, Deckwer WD, Wagner-Döbler I. Removal of mercury from chloralkali electrolysis wastewater by a mercury-resistant Pseudomonas putida strain [J]. Appl Environ Microbiol, 1999, 65 (12): Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees [J]. Mol Biol Evol, 1987, 4 (4): Li C, Lan Y, Zhang JC. Biodegradation of methidathion by Serratia sp. in pure cultures using an orthogonal experiment design, and its application in detoxification of the insecticide on crops [J]. Ann Microbiol, 2013, 63: 王九峰, 万忠民, 濮生财, 焦威, 阳小成, 邵华武. 减压内沸腾和响应面分析优化苦荞总黄酮提取工艺 [J]. 应用与环境生物学报, 2014, 20 (4): [Wang JF, Wan ZM, Pu SC, Jiao W, Yang XC, Shao HH. Extraction of total flavonoids from Fagopyrom esculentum seeds by decompressing inner ebullition extraction method and response surface analysis [J]. Chin J Appl Environ Biol, 2014, 20 (4): ] Chin J Appl Environ Biol 应用与环境生物学报

第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析

第期黄雪莲等响应面优化绿色木霉菌培养基材料与方法菌种仪器与试剂菌种的活化单因素试验响应面优化试验优化工艺的验证数据处理结果与分析第卷第期年月食品与生物技术学报响应面优化绿色木霉菌培养基黄雪莲于新仲恺农业工程学院轻工食品学院广东广州利用响应面分析法对绿色木霉菌的培养基进行优化通过测量不同营养条件下绿色木霉菌落生长直径研究其生物学特性在单因素实验的基础上选定葡萄糖添加量丙氨酸添加量和磷酸二氢钾添加量个因素进行中心组合实验建立二次回归方程并应用响应面分析法进行优化结果表明绿色木霉菌最佳培养基为葡萄糖