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1 中国农业科学 2010,43(1): Scientia Agricultura Sinica doi: /j.issn 万寿菊属品种资源遗传关系的 ISSR 分析曾丽 1,2, 赵梁军 1, 孙佳 2, 赵子刚 2, 杨帆 2 ( 1 中国农业大学观赏园艺与园林系, 北京 ; 2 上海交通大学农业与生物学院, 上海 ) 摘要 : 目的通过 ISSR 分子标记研究品种资源遗传关系, 探讨其种群遗传多样性水平和遗传结构, 为了解品种间遗传多样性品种间亲缘关系育种及科学合理保存和利用现有万寿菊属种质资源提供理论依据和技术支持方法对 29 份万寿菊材料及 2 份孔雀草材料利用 ISSR 分子标记进行遗传关系分析结果用 11 个引物对 31 份万寿菊属材料进行 PCR 扩增, 每个引物扩增的 ISSR 条带数在 5 11 条, 平均每条引物能扩增出 6.8 条带, 多态位点百分率为 40% 100% 聚类分析结果表明,ISSR 分类结果与传统分类的结果基本一致,31 份材料按照万寿菊及孔雀草分为两大类, 并且同系列万寿菊品种被划为同一亚组结论利用 ISSR 标记技术可较准确分析万寿菊属材料间的亲缘关系及遗传多样性关键词 : 万寿菊属 ;ISSR; 品种资源 ; 遗传关系 Analysis of Genetic Relatedness of Genetic Resources of Tagetes as Revealed by ISSR ZENG Li 1,2, ZHAO Liang-jun 1, SUN Jia 2, ZHAO Zi-gang 2, YANG-fan 1 ( 1 Department of Ornamental Horticulture and Landscape Architecture, China Agricultural University, Beijing100193; 2 Agricultural and Biological College of Shanghai Jiaotong University, Shanghai ) Abstract: Objective ISSR markers were used to study the genetic relationship and investigate the genetic diversity and genetic structure for providing a theoretical basis and technical support for appropriate conservation and application of existing genetic resources of Tagetes. Method Genetic relationship of 29 accessions of Tagetes erecta and 2 accessions of T. patula were analyzed using ISSR markers. Result The genomic DNA of 31 accessions of genus Tagetes was amplified with 11 primers, the bands produced by each primer ranged from 5 to 11, and 6.8 bands were obtained on average, the polymorphic loci ranged from 40%-100%. The cluster analysis of ISSR data indicated that the resources classified by ISSR was basically in accordance with that by traditional method, the accessions were generally classified into 2 groups of different species, and cultivars of same lines were clustered into a subgroup. Conclusion The genetic relationship and genetic diversity of genus Tagetes could be assessed efficiently by ISSR markers. Key words: Tagetes; ISSR; genetic resources; genetic relationship 0 引言研究意义万寿菊(Tagetes erecta) 与孔雀草 (Tagetes patula) 同为菊科万寿菊属植物, 原产墨西哥及美洲地区, 现世界各地均有栽培, 既是重要的园林花卉, 也是提取叶黄素的优质材料, 用途极为广泛, 其研究具有重要意义 [1] 探讨万寿菊属植物种群遗传多样性水平和遗传结构, 可为了解品种间遗传多样性品种间亲缘关系育种及科学合理保存和利用现有万寿菊种质资源提供理论依据和技术支持前人研究进展 ISSR 分子标记是在 SSR 标记基础上发展起来的一种新技术, 是一种快速可靠可以提供基因组丰富信息的 DNA 指纹技术, 目前已广泛应用于植物品种鉴定遗传作图基因定位遗传多样性进化收稿日期 : ; 接受日期 : 基金项目 : 国家 863 计划项目 (2007AA10Z189) 作者简介 : 曾丽, 副教授 Tel: ; zljs@sjtu.edu.cn 通信作者赵梁军, 教授 zhaolj5073@163.com

2 216 中国农业科学 43 卷及分子生态型研究 [2-13] 近年来, 国内外许多学者利用 ISSR 分析技术对植物亲缘关系进行了研究 [14-16] 刘小莉对报春花属 10 个种的种间变异进行了 ISSR 分析, 并将这 10 个种聚为三大类 [17] 于恒秀利用 ISSR 引物鉴定芍药栽培品种间的亲缘关系 [18] Varela 等利用 ISSR 分子标记研究了草莓的遗传距离 [19] 缪恒彬等利用 ISSR 分子标记对 25 份小菊品种及 85 份大菊品种的遗传多样性进行了分析, 并对 25 份小菊品种构建了指纹图谱 [20-21] 齐迎春等对孔雀草自交系的遗传关系进行了研究, 发现当优先考虑花型和材料来源两个表型性状时, 两种分类方法得到的结果基本一致 [22] 本研究切入点前人已从形态学 SRAP 分子标记等角度研究了部分万寿菊品种资源遗传关系, 但应用 ISSR 标记在万寿菊属品种资源研究上报道较少 [23-24] 拟解决的关键问题本试验以不同的万寿菊属品种资源为材料, 利用 ISSR 分析万寿菊属品种资源的亲缘关系, 以期为科学利用万寿菊属种质资源提供理论依据 1 材料与方法 1.1 材料供试材料为 31 份万寿菊属种质资源, 其中 2 份为孔雀草品种, 和 0160 为北京园林科学研究所选育的品系, 奇迹印加人皇室泛美色素万寿菊和色素万寿菊杂交 F 1 为北京园林科研所提供的泛美种子公司万寿菊杂交品种, 老印卡为虹越种子公司提供的万寿菊杂交品种, 另外 21 份为中国林木种子公司提供的万寿菊属杂交品种发现系列有发现 - 橙色和发现 - 黄色品种 ; 奇迹系列有奇迹 - 橙红色奇迹 - 金黄色和奇迹 - 黄色品种 ; 安提瓜系列有安提瓜 - 金黄色安提瓜 - 橙色和安提瓜 - 黄色品种 ; 丰收系列有丰收 - 金黄色丰收 - 黄色和丰收 - 橙黄色 ; 泰山系列有泰山 - 橙黄色和泰山 - 黄色品种 ; 完美系列有完美 - 黄色完美 - 橙色和完美 - 金黄色 ( 表 1) 表 1 供试材料 Table 1 List of the experimental materials 编号 No. 品种或品系 Cultivars or lines 颜色 Color 编号 No. 品种或品系 Cultivars or lines 颜色 Color 1 皇室 Royal 黄色 Yellow 17 泛美色素万寿菊 Pigment Marigold of Pan American 猩红色 Scarlet 2 印加人 Inca 橙黄色 Orange 18 色素万寿菊杂交 F 1 Pigment Marigold Hybrid F 1 橙黄色 Orange 3 迪卡 Deco 黄色 Yellow 橙黄色 Orange 4 奇迹 Marvel 橙黄色 Orange 20 丰收 Harvest 金黄色 Gold 5 奇迹 Marvel 金黄色 Gold 21 丰收 Harvest 橙黄色 Orange 6 奇迹 Marvel 黄色 Yellow 22 丰收 Harvest 黄色 Yellow 7 发现 Discovery 橙色 Orange 23 完美 Perfection 黄色 Yellow 8 发现 Discovery 黄色 Yellow 24 泰山 Mount Tai 橙黄色 Orange 9 老印卡 Old Inca 橙色 Orange 25 泰山 Mount Tai 黄色 Yellow 黄色 Yellow 26 安提瓜 Antigua 金黄色 Gold 黄色 Yellow 27 安提瓜 Antigua 橙黄色 Orange 黄色 Yellow 28 安提瓜 Antigua 黄色 Yellow 13 小英雄 Little Hero 橙黄色 Orange 29 新纪元 New Era 黄色 Yellow 14 珍妮 Jenny 淡黄色 Light yellow 30 完美 Perfection 橙黄色 Orange 15 Inca II 黄色 Yellow 31 完美 Perfection 金黄色 Gold 16 Inca I 黄色 Yellow 1.2 方法基因组 DNA 提取采集供试材料的幼嫩叶片, 用天根基因组 DNA 提取试剂盒提取其 DNA ISSR-PCR 反应体系的建立试验采用 25 µl 的 PCR 反应体系, 反应混合物成分为 2 µl,10 Buffer 1.5 mmol L -1 的氯化镁 0.2 mmol L -1 dntp

3 1 期曾丽等 : 万寿菊属品种资源遗传关系的 ISSR 分析 217 1U Taq 酶 0.5 µmol L -1 引物 20 ng 模板 DNA 扩增反应程序为 94 预变性 2 min,94 变性 30 s, 58 复性 45 s,72 2 min, 接着梯度降温进行复性, 5 个循环后稳定在 53 复性, 进行 39 个循环, 最后 72 延伸 5 min 电泳及检测扩增产物在含有 EB 的 1.5% 琼脂糖凝胶上电泳检测, 电压 100 V,20 min, 并以 bp 标准分子质量进行对照数据分析 ISSR 电泳结果采取 0/1 赋值记带, 有带记为 1, 无带记为 0 用 NTSYSpc2.1 软件计算相似系数及遗传距离, 并进行聚类分析, 绘制树状聚类图 2 结果与分析 2.1 万寿菊的 ISSR 遗传多态性根据 British Columbia 大学公布的序列, 从 100 个 ISSR 引物中初步筛选出 57 条 ISSR 引物用于试验材料的扩增, 引物由上海生工有限公司合成从 57 条引物中筛选出 11 条条带清晰重复性好的引物用于 31 份材料的 PCR 扩增每个引物扩增的 ISSR 条带数在 5 11 条, 平均每条引物能扩增出 6.8 条条带, 其中引物 P48 最多扩增出 8 条多态性条带, 引物 P39 和 P45 最少只扩出 2 条多态性条带 ( 表 2) 引物 P34 扩增的 ISSR 产物电泳图见图 1 ISSR 检测到较高的 1 31 同表 1 编号 ;M:DNA 标准分子量 1-31: Material code listed in Table 1; M: DNA ladder 图 1 引物 P34 对 31 份万寿菊属材料的 ISSR-PCR 扩增结果 Fig. 1 ISSR-PCR profiles of 31 accessions of Tagetes with primer P34 表 2 所用引物扩增结果 Table 2 The amplification result with used primers 引物 Primer 序列 Sequence 扩增条带数 No. of amplified bands 多态性带数 No. of polymorphic bands 多态位点百分率 Percentage of polymorphic bands (%) P9 AGA GAG AGA GAG AGA GC P11 AGA GAG AGA GAG AGA GG P34 GAC AGA CAG ACA GAC A P37 ACA CAC ACA CAC ACA CT P38 ACA CAC ACA CAC ACA CC P39 ACA CAC ACA CAC ACA CG P45 GGG TGG GGT GGG GTG P47 AGA GAG AGA GAG AGA GYC P48 AGA GAG AGA GAG AGA GYA P49 GAG AGA GAG AGA GAG AYT P55 CAC ACA CAC ACA CAC ARG

4 218 中国农业科学 43 卷多态性条带的比率,11 条引物扩增产物的多态位点百分率在 40% 100%, 表明 ISSR 技术可以用于 31 个万寿菊属材料的遗传多样性分析 2.2 聚类分析 31 份万寿菊属品种间的遗传距离在 ( 表 3 表 4), 其中奇迹 - 金黄色和奇迹 - 黄色 ; 安提瓜 - 金黄色和安提瓜 - 橙色 ; 安提瓜 - 橙色和安提瓜 - 黄色之间的距离最小为 , 与它们为同系列品种的划分相符发现和老印卡之间的遗传距离最大 (0.452) 利用 ISSR 标记数据计算材料间的遗传相似性系数矩阵, 采用 UPGMA 法构建了万寿菊属材料间的遗传关系聚类图 ( 图 2) 31 份材料可分为两大组, 第一大组包括 : 皇室迪卡印加人发现 - 橙色发现 - 黄色泛美色素万寿菊色素万寿菊杂交 F 1 代奇迹 - 橙红色奇迹 - 金黄色奇迹 - 黄色 0160 安提瓜 - 金黄色安提瓜 - 橙色安提瓜 - 黄色丰收 - 金黄色丰收 - 黄色丰收 - 橙黄色泰山 - 橙黄色泰山 - 黄色新纪元 - 黄色老印卡 - 橙色 Inca II- 黄色 Inca I- 黄色 0130 完美 - 黄色完美 - 橙色完美 - 金黄色 ; 第二大组为两个孔雀草品种 : 小英雄和珍妮第一大组又分为两个亚组, 第一亚组包括 : 皇室迪卡印加人 0140 和 0120, 第二亚组包括 : 发现 - 橙色发现 - 黄色泛美色素万寿菊色素万寿菊杂交 F 1 代奇迹 - 橙红色奇迹 - 金黄色奇迹 - 黄色 0160 安提瓜 - 金黄色安提瓜 - 橙色安提瓜 - 黄色丰收 - 金黄色丰收 - 黄色丰收 - 橙黄色泰山 - 橙黄色泰山 - 黄色新纪元 - 黄色老印卡 - 橙色 Inca II- 黄色 Inca I- 黄色 0130 完美 - 黄色完美 - 橙色和完美 - 金黄色 3 讨论 ISSR 通常为显性标记式遗传, 具有很好的多态性稳定性和可重复性, 不受样品形态基因表达与否及环境因子的限制本研究应用 ISSR 分子标记分析了万寿菊属 31 份材料的遗传关系,ISSR 分类结果图 2 31 份万寿菊属品种资源的聚类结果图 Fig. 2 The dendrogram of cluster analysis of 31 accessions of Tagetes

5 1 期曾丽等 : 万寿菊属品种资源遗传关系的 ISSR 分析 219 表 3 各材料间的遗传相似性系数 Table 3 The D ice genetic similarity coefficient of the accessions

6 220 中国农业科学 43 卷表 4 各材料间的遗传距离 Table 4 The genetic distance of the accessions

7 1 期曾丽等 : 万寿菊属品种资源遗传关系的 ISSR 分析 221 将试验材料按照万寿菊及孔雀草分为两大类, 此结果与传统分类相吻合在进一步亚组划分时, 同系列万寿菊品种被划为一组因此,ISSR 标记技术用于评价万寿菊属材料间的亲缘关系及遗传多样性分析是较为准确的 [22] 齐迎春等对 12 份孔雀草自交系和 4 份孔雀草 F 1 代及两份万寿菊材料分别用 ISSR 分子标记和形态学特征进行了遗传分析, 发现优先考虑花型和材料来源两个表型性状时, 两种分类方法结果基本一致, 从而得出在孔雀草分类中以花型和材料来源为重要依据时, 能够比较客观地反映其遗传基础上的差异本试验结果显示, 同属及同系列的万寿菊属材料间遗传距离较近, 这一结果与齐迎春等的研究结果相一致 [22] 张西西等应用 SRAP 分子标记对当前市场上推广的 48 个万寿菊杂交一代品种进行遗传多态性研究, 结果显示了较高的多态性比率, 大部分相同系列的品种聚在一起, 但同一系列的杂交种没有完全聚为一类, 与本文结果不完全一致, 其原因可能是所选材料的样本不同, 也受不同分子标记的影响 [23] 叶要妹利用 RAPD 和 ISSR 分析百日草自交系间的种质遗传多样性, 指出不同分子标记之间并不相互排斥, 也无法相互取代, 不同标记间的相互补充和利用, 能更好地揭示种质之间的遗传多样性 [25] 4 结论本文利用 ISSR 技术对 29 份万寿菊材料和 2 份孔雀草材料进行了亲缘关系及遗传多样性分析 ISSR 分类结果将 31 份材料按照万寿菊及孔雀草分为两大类, 并且同系列万寿菊品种被划为同一亚组, 表明 ISSR 标记的分类结果与传统分类结果较一致, 利用 ISSR 标记技术可较准确分析万寿菊属材料间的亲缘关系及其遗传多样性本研究结果可为科学利用万寿菊属种质资源提供理论依据 References [1] 梁顺祥, 唐道城, 杨正勇. 万寿菊鲜花产量及叶黄素含量比较研究. 北方园艺, 2007(6): Liang S X, Tang D C, Yang Z Y. Comparative studies of fresh flower yield and lutein content of Marigold. Northern Horticulture, 2007(6): (in Chinese) [2] 罗海燕, 陈业渊. ISSR 分子标记及其应用. 安徽农学通报, 2008, 14(19): Luo H Y, Chen Y Y. ISSR molecular marker and its using. Anhui Agricultural Science Bulletin, 2008, 14(19): (in Chinese) [3] 王建波. ISSR 分子标记及其在植物遗传学研究中的应用. 遗传, 2002, 24(5): Wang J B. ISSR markers and their applications in plant genetics. Hereditas (Beijing), 2002, 24(5): (in Chinese) [4] Pradeep Reddy M, Sarla N, Siddiq E A. Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism and its application in plant breeding. Euphytica, 2002, 128: [5] Li J M, Jin Z X. Genetic structure of endangered Emmenopterys henryi Oliv. based on ISSR polymorphism and implications for its conservation. Genetica, 2008, 133: [6] Fang D Q, Roose M L. Identification of closely related citrus cultivars with inter-simple sequence repeat markers. Theoretical and Applied Genetics, 1997, 95: [7] 吴振兴, 王慧中, 施农农, 赵艳. 兰属 Cymbidium 植物 ISSR 遗传多样性分析. 遗传, 2008, 30(5): Wu Z X, Wang H Z, Shi N N, Zhao Y. The genetic diversity of Cymbidium by ISSR. Hereditas(Beijing), 2008, 30(5): (in Chinese) [8] Ammiraju S S, Dholakia B B, Santra D K, Singh H, Lagu M D, Tamhankar S A, Dhaliwal H S, Rao V S, Gupta V S, Ranjekar P K. Identification of inter simple sequence repeat (ISSR) markers associated with seed size in wheat. Theoretical and Applied Genetics, 2001, 102: [9] Ratnaparkhe M B, Tekeoglu M, Muehlbauer F J. Inter-simplesequence-repeat (ISSR) polymorphisms are useful for finding markers associated with disease resistance gene clusters. Theoretical and Applied Genetics, 1998, 97: [10] Danilova T V, Karlov G I. Application of inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism for detection of sex-specific molecular markers in hop (Humulus lupulus L. ). Euphytica, 2006, 151: [11] Casasoli M, Mattioni C, Cherubini M, Villani F. A genetic linkage map of European chestnut (Castanea sativa Mill. ) based on RAPD, ISSR and isozyme markers. Theoretical and Applied Genetics, 2001, 102: [12] Gaurab G, Subhash K R, Kaushik G, Ramit P, Tanoy B, Debabrata Basu, Kalyan K M. Sex detection of Carica papaya and Cycas circinalis in pre-flowering stage by ISSR and RAPD. Current Science, 2007, 92(4): 25. [13] Tikunov Yu M, Khrustaleva L I, Karlov G I. Application of ISSR markers in the genus Lycopersicon. Euphytica, 2003, 131: [14] 赵谦, 杜虹, 庄东红, 马瑞君, 谢启鑫. 14 个蝴蝶兰品种遗传关系的 ISSR 分析. 植物研究, 2008, 28(2):

8 222 中国农业科学 43 卷 Zhao Q, Du H, Zhuang D H, Ma R J, Xie Q X. Genetic relationships analysis of 14 cultivars of Phalaenopsis hybrid based on ISSR molecular markers. Bulletin of Botanical Research, 2008, 28(2): (in Chinese) [15] 马朝芝, 傅廷栋, Stine Tuevesson, Bo Gertsson. 用 ISSR 标记技术分析中国和瑞典甘蓝型油菜的遗传多样性. 中国农业科学, 2003, 36(11): Ma C Z, Fu T D, Tuevesson S, Gertsson B. Genetic diversity of Chinese and Swedish rapeseed (Brassica napus L. ) analyzed by inter-simple sequence repeats (ISSRs). Scientia Agricultura Sinica, 2003, 36(11): (in Chinese) [16] Rajesh P N, Sant V J, Gupta1V S, Muehlbauer F J, Ranjekar P K. Genetic relationships among annual and perennial wild species of Cicer using inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism. Euphytica, 2002, 129: [17] 刘小莉, 刘飞虎, 李宗菊, 曾淑华. 10 种报春花亲缘关系的 ISSR 分析. 云南大学学报 : 自然科学版, 2004, 26 ( 5): Liu X L, Liu F H, Li Z J, Zeng S H. ISSR analysis on the inter2species relationship in Primula. Journal of Yunnan University: Natural Sciences Edition, 2004, 26(5): (in Chinese) [18] 于恒秀, 王淼, 梁国华, 何小弟, 龚志云, 孙维娟. ISSR 引物鉴定芍药栽培品种之间亲缘关系的初步研究. 植物生理学通讯, 2006, 42(2): Yu H X, Wang M, Liang G H, He X D, Gong Z Y, Sun W J. Preliminary identification of relationship among cultivars of Paeonia lactiflora pall by ISSR analysis. Plant Physiology Communications, 2006, 42(2): (in Chinese) [19] Varela M A, González-Tizón A, Mariñas L, Martínez-Lage A. Genetic divergence detected by ISSR markers and characterization of microsatellite regions in Mytilus mussels. Biochemical Genetics, 2007, 45(7/8): [20] 缪恒彬, 陈发棣, 赵宏波, 房伟民, 石丽敏. 应用 ISSR 对 25 个小 Miao H B, Chen F D, Zhao H B, Fang W M, Shi L M. Genetic Diversity and construction of fingerprinting of chrysanthemum cultivars by ISSR markers. Scientia Agricultura Sinica, 2008, 41(11): (in Chinese) [21] 缪恒彬, 陈发棣, 赵宏波. 85 个大菊品种遗传关系的 ISSR 分析. 园艺学报, 2007, 34(5): Miao H B, Chen F D, Zhao H B. Genetic relationship of 85 chrysanthemum [Dendranthema grandiflora (Ramat.) Kitamura] cultivars revealed by ISSR analysis. Acta Horticulturae Sinica, 2007, 34(5): (in Chinese) [22] 齐迎春, 宁国贵, 包满珠. 应用 ISSR 分子标记和表型性状评价孔雀草自交系的遗传关系. 中国农业科学, 2007, 40(6): Qi Y C, Ning G G, Bao M Z. Evaluation of genetic relationships of Tagetes patula inbred lines using ISSR markers and morphological traits. Scientia Agricultura Sinica, 2007, 40(6): (in Chinese) [23] 张西西, 徐进, 王涛, 董爱香, 赵梁军. 万寿菊杂交一代遗传多态性的 SRAP 标记分析. 园艺学报, 2008, 35 (8): Zhang X X, Xu J, Wang T, Dong A X, Zhao L J. Genetic diversity with molecular marker SRAP of Tagetes erecta L. Acta Horticulturae Sinica, 2008, 35 (8): (in Chinese) [24] 唐道城, 唐楠, 唐新桥. 万寿菊资源观赏性状的遗传聚类分析. 青海大学学报 : 自然科学版, 2008, 26(5): Tang D C, Tang N, Tang X Q. Cluster analysis of ornamental traits on Tagetes resources. Journal of Qinghai University: Nature Science, 2008, 26(5): (in Chinese) [25] 叶要妹. 利用 RAPD 和 ISSR 分析百日草自交系间的种质遗传多样性. 中南林业科技大学学报, 2008, 28(4): Ye Y M. Assessment of the germplasm genetic diversity of Zinnia elegans inbred lines detected by RAPDs and ISSRs. Journal of Central South University of Forestry and Technology, 2008, 28(4): (in Chinese) 菊品种进行遗传多样性分析及指纹图谱构建. 中国农业科学, 2008, 41(11): ( 责任编辑曲来娥 )

7期xin

7期xin 中国农学通报 0,0():- Chinese Agricultural Science Bulletin 花椰菜种质资源遗传多样性 SRAP 标记分析荆赞革, 唐征, 裴徐梨, 刘庆, 张小玲, 罗天宽, 朱世杨 ( 浙南作物育种重点实验室, 温州科技职业学院, 浙江温州 00; 作物遗传