284 栽则葬凿蚤贼蚤燥灶葬造悦澡蚤灶藻泽藻阅则怎早砸藻泽藻葬则糟澡驭悦造蚤灶蚤糟葬造孕澡葬则皂葬糟燥造燥早赠, 圆园 14 May, 灾燥造援圆 5 晕燥援 3 sorting and MTT assay were utilized to detect the cell apoptosis and

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利怡戚
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1 中药新药与临床药理圆园 14 年 5 月第 25 卷第 3 期参考文献 : [1] 史哲新, 杨文华, 汤毅, 等. 六神丸逆转白血病多药耐药作用及相关机制研究 [J]. 天津中医药大学学报,27,26(1): [2] 陈奇. 中药药理实验方法 [M]. 北京 : 人民卫生出版社,1994:26. [3] 严永清. 中药现代研究的思路与方法 [M]. 北京 : 化学工业出版社, 26:341. [4] 李玉莹, 马武开. 中医药逆转白血病多药耐药细胞的研究进展 [J]. 世界中西医结合杂志,21,1(5): 96. [5] ustamante J, Caldas LE, Garcia M, et al. Disruption of mitochondrial membrane potential during apoptosis induced by PSC 833 and Cs in multidrug-resistant lymphoid leukemia [J]. Toxicol ppl Pharmacol,24,199(1): [6] Thomas H,Coley HM.Overcoming.the clinical strategy of inhibiting P-glycopmtein[J].Cancer Control,23,1(2): [7] 王玮, 岑建农, 李建勇. 急性白血病中 MDRI MRP cl-2 基因表达及其临床意义 [J]. 中国肿瘤临床,23,3(7): [8] 马晓军, 任红波, 叶蕾.cl-2 ax 在急性白血病表达中的研究进展 [J]. 中国临床医学,25,12(5): [9] 戴锡孟, 徐芳. 六神丸诱导白血病细胞凋亡及调控凋亡相关基因的实验研究 [J]. 辽宁中医杂志,23,(6): 431. [1] 戴锡盂, 徐芳. 六神丸诱导白血病细胞凋亡及 CL-2 相关基因的实验研究 [J]. 陕西中医杂志,24,3(7): ( 编辑 : 宋威 ) 鼠尾草酸对人结肠癌细胞增殖抑制作用及增强其对 5- 氟脲嘧啶敏感性的研究江红娟 1, 金闺秀 2, 叶强 1 (1. 浙江省人民医院, 浙江杭州 3114;2. 宁波大学医学院, 浙江宁波 ) 摘要 : 目的研究鼠尾草酸 (carnosic acid,c) 抑制人结肠癌细胞 SW48 增殖和增强化疗药物 5- 氟脲嘧啶 (5-Fluorouracil,5-FU) 敏感性的作用及机制方法结晶紫染色法检测 C 对 SW48 增殖的抑制作用, 流式细胞技术分析和 MTT 法检测 C 和 5-FU 联合使用对人结肠癌细胞 SW48 凋亡和细胞活力的影响采用 β-catenin 荧光素酶报告基因 (TOP-Flash) 检测 C 作用后 SW48 细胞内 β-catenin 活性改变不同浓度 C 处理 SW48 后,Western blot 检测 β-catenin 蛋白质表达水平变化,RT-PCR 法检测其下游基因 Cyclin D1 和 P-gp(P-glycoprotein) 的 mrn 表达水平变化结果 C 对人结肠癌 SW48 细胞增殖有抑制作用, 且 C 能够增强 5-FU 对结肠癌细胞凋亡和细胞活力的影响 C 处理后细胞内 β-catenin 转录活性明显降低,Western blot 法和 RT-PCR 法结果显示 C 下调了 β-catenin 的蛋白水平及下游基因 Cyclin D1 和 P-gp mrn 表达结论 C 能够抑制人结肠癌 SW48 细胞增殖和增强 5-FU 的抗肿瘤效果, 其机制可能与抑制 β-catenin 活性并下调其下游基因 Cyclin D1 和 P-gp 表达有关关键词 : 鼠尾草酸 ; 结肠癌 ;5- 氟脲嘧啶 ; 细胞增殖 ; 细胞凋亡 ;β-catenin 中图分类号 :R285.5 文献标志码 : 文章编号 : (214) doi:1.3969/j.issn Studies on Carnosic cid in Suppressing Proliferation of Human Colon Cancer Cells and Enhancing Their Chemosensitivity to 5-Fluorouracil JING Hongjuan 1,JIN Guixiu 2, YE Qiang 1 (1. Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou 3114 Zhejiang, China ;2. Ningbo University School of Medicine,Ningbo Zhejiang,China) bstract: Objective To investigate the antitumor effects and underlying mechanism of carnosic acid(c)on the proliferation of human colon cancer SW48 cells and their chemosensitivity to 5-fluorouracil(5-FU). Methods The anti-proliferation effect of C on SW48 cells was determined by crystal violet staining. Fluorescence activated cell 收稿日期 : 作者简介 : 江红娟, 女, 硕士, 药师, 研究方向 : 肿瘤药理 tigergirl@126.com 通讯作者 : 叶强, 主管药师, 研究方向 : 临床药理学 yht22517@qq.com

2 284 栽则葬凿蚤贼蚤燥灶葬造悦澡蚤灶藻泽藻阅则怎早砸藻泽藻葬则糟澡驭悦造蚤灶蚤糟葬造孕澡葬则皂葬糟燥造燥早赠, 圆园 14 May, 灾燥造援圆 5 晕燥援 3 sorting and MTT assay were utilized to detect the cell apoptosis and cell viability of SW48 cells treated by the combination of C and 5-FU. The effect of C on Wnt/β-catenin signaling activity was evaluated by the β-catenin sensitivetop-flash luciferase reporter assay. Western blot was applied to detect theexpression of β-catenin protein, and RT-PCR was applied to examine Cyclin D1 and P-gp(P-glycoprotein) mrn expression in SW48 cells after treated with different concentrations of C. Results C exhibited the proliferation activity of SW48 colon cancer cells. When used together, C could enhance the effect of 5-FU on inducing cell apoptosis and reducing cell viability. β-catenin transcription activity and protein level as well as its target genes Cyclin D1 and P-gp mrn expression were significantly reduced by C in aconcentration-dependent manner. Conclusion C can inhibit cell proliferation and enhance the antitumor effect of 5-FU on human colon cancer SW48 cells,and its mechanism may be related with thedown-regulation of β-cateninactivity and itsdownstream genesexpression(cyclin D1 and P-gp). Keywords:Carnosic acid;colon cancer;5-fluorouracil;cell proliferation;cell apoptosis;β-catenin 结肠癌是世界范围内一种常见的恶性肿瘤, 一些西方国家得益于其预防和早期诊断的策略, 结肠癌造成的死亡率有所下降, 但在许多发展中国家却 [1] 在持续上升目前结肠癌的化疗主要依赖于抗代谢药物 5- 氟脲嘧啶 (5-Fluorouracil,5-FU), 但只有 1% ~15 % 的晚期结肠癌病人在接受 5-FU 单独治疗后有 [2] 效因此, 研发一种新型的高效低毒的治疗方案, 特别是能够克服传统化疗药物耐药性的新策略具有极为重要的意义有流行病学研究发现结肠癌的发病和饮食密切相关, 其中大约 6 %~75 % 的结肠癌病人直接受到 [3] 了饮食的影响化学预防作为控制结肠癌的一种主要策略受到越来越多的关注, 许多能够抑制结肠癌的天然化合物及其衍生物正处于研发之中, 而且有 [4] 些已经成为重要的化疗药物植物来源的多元酚类 [5] 物质是一大类天然的抗氧化剂, 研究表明摄取富含多元酚的水果和蔬菜能够明显降低包括癌症在内的多种疾病发生风险鼠尾草酸 (carnosic acid,c) 是迷迭香提取物中的主要多元酚成分之一, 具有抗氧化抗感染等多 [6] [7] 种药理学活性最近有报道显示 C 在乳腺癌肝癌前列腺癌和肺癌等多种癌细胞中表现出了明显的抗增殖效果在此基础上, 本研究进一步探讨 C 在人结肠癌细胞中的抗肿瘤活性和其增强 5-FU 药物敏感性的效应, 以及 C 抑制细胞内 Wnt/β-catenin 信号转导的可能作用机制, 为将 C 开发成一种新型的高效低毒的人结肠癌治疗药物或辅助治疗药物提供理论基础 1 材料与方法 1.1 细胞细胞培养基及试剂人结肠癌细胞 SW48, 批号 : CCL-228, TCC(merican Type Culture Collection); 细胞培养使用 Gibco 公司 RPMI-164 培养基 ( 含有 1 % 胎牛血清,2 mm 的 L- 谷氨酰胺和 1% 青链霉素 ), 标准条件培养细胞 (37 室温, 95 % 湿度,5%CO 2 ); 鼠尾草酸 (C) 5- 氟脲嘧啶 (5-FU) 二甲基亚砜(DMSO) 二苯基四氮唑溴盐 (MTT) 和结晶紫试剂, 美国 Sigma 公司 ;TOP-Flash (β-catenin 报告基因 ) 质粒, 批号 : 12456, ddgene; 双荧光素酶检测试剂盒,Promega 公司 ; nnexin Ⅴ-FITC/PI 双染试剂盒, 碧云天生物技术研究所 ; 实验所用抗体,Santa Cruz 公司 ; Lipofectamine 2 Trizol 和 RT-PCR 试剂盒, Invitrogen 公司 1.2 方法结晶紫染色取对数生长期的 SW48 细胞, 个 / 孔接种于 24 孔板内, 不同浓度 C 处理 24,48,72 h 后, 结晶紫染色检测细胞增殖情况 [8] 实验操作参照文献方法 : 磷酸盐缓冲液 (PS) 清洗细胞后, 结晶紫染液 (2% 结晶紫溶于 2 % 甲醇溶液 ) 室温染色 15 min, 蒸馏水洗去多余染料, 晾干后拍照 33 % 醋酸溶解染料, 在 595 nm 波长下检测吸光值每组实验重复 3 次, 结果取平均值细胞凋亡检测将指数生长的细胞种于 6 孔板, 按实验设计用 C 和 5-FU 处理细胞于处理第 48 h 后收集细胞并用 PS 清洗 ; 然后用 annexin Ⅴ-FITC 和 PI 进行孵育, 通过流式细胞仪分析凋亡情况 ( 按试剂

3 中药新药与临床药理圆园 14 年 5 月第 25 卷第 3 期盒说明进行操作 ) 每组实验重复 3 次 MTT 法检测取对数生长期的 SW48 细胞, 按个 / 孔接种于 96 孔板内待细胞贴壁后, 按实验设计加入不同浓度 (1~1 滋 mol L -1 ) 的 C 和 5-FU 进行分别处理或联合处理, 每组设 6 个复孔细胞培养 72 h 后, 每孔加入 2 滋 LMTT(5g L -1 ), 孵育 4h 后弃上清液, 再加 15 滋 L 的 DMSO 振荡混匀在酶标仪上检测 49 nm 处吸光度 (OD), 实验重复 3 次细胞存活率 =( 实验组 OD 值 / 对照组 OD 值 ) 1 %, 绘制细胞活力曲线并计算半数致死浓度 (IC 5 ) 荧光素酶报告基因实验对数生长 SW48 细胞铺在 24 孔板内, 贴壁后采用 Lipofectamine 2 转染试剂, 在细胞内同时转入 TOP-Flash 报告质粒和内参报告质粒 prl-tk, 不同浓度 C 处理 24 h, 按照试剂盒说明书检测细胞裂解液内荧光素酶活性, 每组实验重复 3 次, 结果取平均值 Western blot 检测人结肠癌 SW48 细胞在不同浓度 C 处理 24 h 后, 冰预冷的 RIP 裂解液收集细胞全蛋白, 加入适量蛋白上样缓冲液, 沸水煮 1 min 使蛋白充分变性, 进行 SDS-PGE 电泳后将蛋白转至 PVDF 膜, 再按常规方法进行 Western blot 一抗二抗检测 RT-PCR 实验将细胞铺于培养皿中, 采用含胎牛血清的完全培养基培养细胞, 不同浓度 C 处理 24h 后,TRIzol 法提取总 RN; 通过 RT-PCR 检测 Cyclin D1 和 P-gp(P-glycoprotein) 的表达, 每组实验重复 3 次所用引物如下:18S rrn 上游 5 -CGCCCCCGGT TGGC-3, 下游 5 -TGT GCGCGGGCGGTGTG-3 ;Cyclin D1 上游 5 -TGTT CGTGGCCTCTGT GG-3, 下游 5 -GGTTCC CTTGGCTTGTTCC -3,P-gp 上游 5 -TTCGC CCCCGTCCTC-3, 下游 5 -CTGGTGGTCC GCCTTT 统计学处理方法采用 SPSS17. 软件, 所有数据以均数 ± 标准差 (x 依 s) 表示, 多组间比较采用单因素方差分析, 两组间比较采用两样本均数的 t 检验, P <.5 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 C 抑制 SW48 细胞的增殖见图 1 在 1~1 滋 mol L -1 浓度范围内,C 对结肠癌 SW48 细胞的增殖具有明显的抑制作用, 而且这种抑制作用呈现出对药物浓度和作用时间的依赖性注 : 与同时间点的空白对照组比较, P <.5, P <.1 图 1 Figure 1 24 h 48 h 72 h C 对 SW48 细胞增殖抑制的影响 Proliferation -inhibitory effect of C on SW48 cells 2.2 C 增强 5-FU 诱导的 SW48 细胞凋亡见图 2 SW48 细胞分别经 C 5-FU 以及 5-FU+C 联合用药处理 48 h 后, 结果显示 C 组 5-FU 组以及 5FU+C 联合用药组诱导的细胞凋亡率与空白对照组比较, 差异有统计学意义 (P <.5,P <.1), 而 5FU+C 联合用药组与单独给药组比较差异有统计学意义 (P <.5) 表明 C 能够促进 5-FU 诱导人结肠癌细胞凋亡的作用 C 增强 5-FU 对 SW48 细胞活力的抑制作用见图 3 C 与 5-FU 单独用药均呈现剂量依赖效应, C 5-FU 及 5-FU+C 联合用药的 IC 5 分别为 (41.25±2.43) 滋 mol L -1 (19.62±3.62) 滋 mol L -1 以及 (6.17±1.29) 滋 mol L -1, 其中联合用药组的 IC 5 小于 5-FU 单独用药组 (P <.5), 表明 C 可以增强 5-FU 杀伤 SW48 细胞的作用 24 h 48 h 72 h 2.4 C 降低 SW48 细胞茁 -catenin 的活性见图 4 TOP-Flash 荧光素酶质粒含有多个 β-catenin 结合元件, 所以能够反映细胞内 β-catenin 的转录活性图 4 显示 Wnt3a 能够明显提高 β-catenin 的活性, 而 C 可以有效抑制 β-catenin 的活性 Western blot 检测结果 ( 图 4) 显示,C 作用于 SW48 细胞导致 β-catenin 蛋白水平的下调, 并且随药物浓度增 285

4 286 栽则葬凿蚤贼蚤燥灶葬造悦澡蚤灶藻泽藻阅则怎早砸藻泽藻葬则糟澡驭悦造蚤灶蚤糟葬造孕澡葬则皂葬糟燥造燥早赠, 圆园 14 May, 灾燥造援圆 5 晕燥援 3 Control C FU 5-FU+C Wnt3a/nmol L -1 nnexin V-FITC 5 # # 茁 -catenin 3 TCF 茁 -actin 空白对照组 C 组 5-FU 组 5-FU+C 组注 : 与空白对照组比较, P <.5; 与 5-FU 组比较, # P <.5 图 2 C 和 5-FU 对 SW48 细胞凋亡的影响 (n=3) Figure 2 Cell apoptosis induced by 5-FU and C in SW48 cells 12 C 1 5-FU 8 5-FU+C Concentration/ 滋 mol L -1 图 3 C 和 5-FU 对 SW48 细胞活力的影响 (n=3) Figure 3 Cell viability reduced by 5-FU and C in SW48 cells 加而作用增强, 而同时其共转录因子 TCF-4 的蛋白表达并没有发生明显变化这提示 C 能够通过降低 β-catenin 蛋白水平而下调其转录活性 2.5 C 抑制 SW48 细胞 Cyclin D1 和 P-gp 的 mrn 表达见图 5 RT-PCR 检测结果显示,C 能够抑制 SW48 细胞内 Cyclin-D1 和 P-gp 的 mrn 表达, 表达水平随药物浓度增加而明显降低注 : 与空白对照组比较, P <.5, P <.1 图 4 Cyclin-D1 和 P-gp 作为 β-catenin 的下游靶基因, 其表达水平下调应该与 C 抑制细胞内 β-catenin 的活性有关 3 讨论 C 对 SW48 细胞内茁 -catenin 活性的影响 (n=3) Figure 4 β-catenin activity decreased by C in SW48 cells 注 : 与空白对照组比较, P <.5, P <.1 图 5 Figure 5 cells Cycin-D1 P-gp C 对 SW48 细胞内茁 -catenin 靶基因表达的影响 Target genes of β-catenin modulated by C in SW48 迷迭香提取物及活性成分有明显的抗细胞增殖和抗肿瘤的作用, 其中约占到迷迭香叶干重 4% 的鼠尾草酸 (C) 在抗肿瘤效果中起到了关键的作用 [9] 本研究中, 采用不同浓度的 C 体外作用可以抑制人

5 中药新药与临床药理圆园 14 年 5 月第 25 卷第 3 期结肠癌 SW48 细胞的增殖, 而且这种抑制效应呈浓度和时间依赖性的通过对其机制的研究发现 C 下调了 Cyclin D1 的表达水平 Cyclin D1 属于细胞周期调控蛋白, 表达具有细胞周期特异性, 在 G1/S 交界处表达量最高, 其总含量能够反映处于不同周期的 [1] 细胞群体的增殖活跃程度所以, 提示 C 能够通过下调 Cyclin D1 的表达从而抑制结肠癌细胞的增殖结肠癌是一种常见的恶性肿瘤, 目前临床治疗的主要手段之一是以 5-FU 为基础的化学药物治疗, 而癌细胞产生耐药性是化疗失败的主要原因研究表明其主要机制包括表达 C 转运蛋白 (TPbinding cassette transporter) 把化疗药物输出细胞外, 修复化疗药物造成的 DN 损伤和阻止细胞进入凋亡 [11] 程序等 P-gp 作为 C 转运蛋白系统的主要跨膜成分, 能够通过降低细胞内药物浓度或者改变药物在细胞内的分布来限制药物作用的效果, 从而导致了 [12] 癌细胞的药物耐受本研究表明 C 能够增强 5-FU 的抗肿瘤活性, 而其主要机制是通过降低 P-gp 的表达水平从而促进 5-FU 诱导的细胞凋亡, 提示两药联合的化疗方案具有潜在的临床应用价值 Wnt/ 茁 -catenin 信号通路在发育和组织内稳态中起着重要的作用, 而 β-catenin 的持续激活则能够导致肿瘤特别是结肠癌的发生实际上超过 9 % 的结肠癌都伴随有 Wnt/β-catenin 信号通路的基因突变, 主要是 PC 和 β-catenin 的突变导致了该信号通路 [13] 的持续激活 β-catenin 被激活后能够进入细胞核并与 TCF/LEF 形成转录复合物, 诱导其下游基因的表达进而促进肿瘤的发生发展, 而且多项研究表明 β- catenin 的核聚集与肿瘤的分期转移和不良预 [14] 后密切相关因此 β-catenin 成为结肠癌药物治疗的重要靶点, 目前针对该信号通路已经成功研发出多种小分子抑制剂, 但它们大多是通过靶向 [15] β-catenin 的调节蛋白而间接抑制其活性我们的研究表明,C 能够通过下调 β-catenin 自身及其下游基因 Cyclin D1 和 P-gp 的表达水平, 从而抑制结肠癌细胞内过度活化的 Wnt/β-catenin 信号, 进一步表现出显著的抗肿瘤效果但关于 C 抑制 β-catenin 信号通路活性与其抗肿瘤效果的相关机制还有待深入研究参考文献 : [1] Jemal,ray F,Center MM,et al. Global cancer statistics[j]. C Cancer JClin,211,61(2): [2] Zhang N,Yin Y,Xu SJ, et al. 5-Fluorouracil: mechanisms of resistance and reversal strategies[j]. Molecules,28,13(8): [3] ruce WR,Giacca,Medline. Possible mechanisms relating diet and risk of colon cancer [J]. 2,9(12): Cancer Epidemiol iomarkers Prev, [4] Lee KW,ode M,Dong Z. Molecular targets of phytochemicals for cancer prevention[j]. Nat Rev Cancer,211,11(3): [5] Fiander H,Schneider H. Dietary ortho phenols that induce glutathione S-transferase and increase the resistance of cells to hydrogen peroxide are potential cancer chemopreventives that act by two mechanisms:the alleviation of oxidative stress and the detoxification of mutagenic xenobiotics[j]. Cancer Lett,2,156(2): [6] Moreno S,Scheyer T,Romano CS,et al. ntioxidant and antimicrobial activities of rosemary extracts linked to their polyphenol composition [J]. Free Radic Res,26,4(2): [7] Yesil-Celiktas O,Sevimli C,edir E,et al. Inhibitory effects of rosemary extracts, carnosic acid and rosmarinic acid on the growth of various human cancer cell lines[j]. Plant Foods Hum Nutr,21,65 (2): [8] 潘国凤, 高建莉, 张奇, 等. 雷公藤甲素通过抗 ER 磷酸化抑制小鼠 4T1 乳腺癌增殖作用研究 [J]. 中国中药杂志,213,38 (23): [9] Cheung S,Tai J. nti-proliferative and antioxidant properties of rosemary Rosmarinus officinalis[j]. Oncol Rep,27,17(6): [1] lao JP. The regulation of cyclin D1 degradation: roles in cancer development and the potential for therapeutic invention [J]. Mol Cancer,27,6:24. [11] Szakacs G, Paterson JK, Ludwig J, et al. Targeting multidrug resistance in cancer[j]. Nat Rev Drug Discov,26,5(3): [12] Cheng SC, Zhou J,Xie Y. P-glycoprotein expression induced by glucose depletion enhanced the chemosensitivity in human hepatocellular carcinoma cell-lines[j]. Cell iol Int,25,29(4): [13] Najdi R,Holcombe RF, Waterman ML. Wnt signaling and colon carcinogenesis:beyond PC[J]. JCarcinog,211,1:5. [14] Wong SC, Lo ES, Lee KC, et al. Prognostic and diagnostic significance of beta-catenin nuclear immunostaining in colorectal cancer[j]. Clin Cancer Res,24,1(4): [15] Chen, Dodge ME, Tang W, et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer[j]. Nat Chem iol,29,5(2): ( 编辑 : 邓响潮 )

马丽媛, 等. 油茶皂苷体外诱导人白血病 Jurkat 细胞凋亡及其可能机制 1073 力争将茶油作为食用油的主流品种 [5] 茶麸系油茶果实榨除茶油后的废弃残渣, 药用名为茶子饼,

马丽媛, 等. 油茶皂苷体外诱导人白血病 Jurkat 细胞凋亡及其可能机制 1073 力争将茶油作为食用油的主流品种 [5] 茶麸系油茶果实榨除茶油后的废弃残渣, 药用名为茶子饼, 1072 基础研究 Basic Research www.tumorsci.org 肿瘤 2011 年 12 月第 31 卷第 12 期 TUMOR Vol. 31, December, 2011 DOI: 10.3781/j.issn.1000-7431.2011.12. 004 Copyright 2011 by TUMOR 油茶皂苷体外诱导人白血病 Jurkat