206,32(4) 69 席海秀等普通小麦幼苗叶肉细胞原生质体分离方法的优化为分离原生质体的材料但应用这两种材料分离原生质体耗时长操作繁琐且经酶解后仍有很多未酶解的组织细胞和已破碎的物质对原生质培养和进一步的遗传转化等极为不利 2 目前仅有少数的报道对小麦叶肉细胞原生质体的分离

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土跃富
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1 技术与方法生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 206, 32(4):68-73 普通小麦幼苗叶肉细胞原生质体分离方法的优化席海秀艾可筠佟少明 ( 辽宁师范大学生命科学学院辽宁省植物生物工程重点实验室, 大连 608) 摘要 : 以 7 日龄小麦幼苗的叶肉细胞为材料, 采用正交试验分析了纤维素酶浓度离析酶浓度酶解时间甘露醇浓度对原生质体分离时的产量和活力的影响 ; 采用瞬时表达技术通过 PEG-Ca 2+ 介导法转化小麦的原生质体, 分析了 PEG 浓度对转化效率的影响结果表明, 小麦叶片原生质体分离的最佳条件为纤维素酶.5%, 离析酶 0.75%, 甘露醇 0.4 mol/l, 酶解时间 3 h, 得到的原生质体的产量可达到个 /g FW, 活力超过 95% ; 瞬时表达实验结果表明, 在 25% PEG 浓度下, 小麦原生质体的转化效率最高关键词 : 普通小麦 ; 原生质体 ; 分离 ; 瞬时表达 DOI :0.3560/j.cnki.biotech.bull The Optimization of Isolation Method for Mesophyll Protoplast from Common Wheat(Triticum aestivum)seedlings XI Hai-xiu AI Ke-jun TONG Shao-ming (School of Life Sciences,Liaoning Normal University,The Key Laboratory of Plant Biotechnology of Liaoning Province,Dalian 608) Abstract: By orthogonal test,we analyzed the effects of concentrations of cellulose,macerozyme,and mannitiol as well as the time of enzyme digestion on the productivity and vitality during the isolation of protoplast from 7 days of wheat seedling mesophyll. Further,the transient expression technology was employed to analyze the effects of PEG concentration on the transformation efficiency by PEG-Ca 2+ -mediated transformation of mesophyll. The results showed that the optimal condition for isolating the mesophyll from wheat leaves was :.5% of cellulase, 0.75% of macerozyme,0.4 mol/l mannitol,and 3 h of enzyme digestion ;the protoplast yield was cells/g FW,the vitality was more than 95%. The results from the transient expression technology revealed that transformation efficiency was the highest under 25% PEG. Key words: common wheat ;protoplast ;isolation ;transient expression 原生质体是指去除细胞壁的植物细胞, 可以同整株植物一样进行正常的生理反应和细胞活动 [], 是多功能的植物遗传改良的重要实验体系之一, 在研究细胞生理过程和活动中发挥着重要的作用, 如细胞壁的合成, 细胞分裂分化 [], 光合作用 [2], 钙离子信号调控 [3] [4], 蛋白质亚细胞定位和完整细胞器的分离 [5] 应用原生质体为受体进行的遗传操作必须建立在其有效分离的技术基础之上原生质体分离的方法主要有机械法和酶解法两种, 机械法分离原生质体的过程非常复杂且产量低, 而酶解法可以在短时间内非常容易地分离出大量的原生质体, [6] 因此目前常用酶解法分离原生质体从 Cocking 等首次采用酶解法成功地分离原生质体至今, 已经成功应用此法分离到了多种植物的原生质体, 如拟南芥 [] 烟草 [7] 水稻 [8] [9] [0] 一品红及番茄等普通小麦 (T.aestivum. L) 是世界上种植面积最大的粮食作物, 由于其具有遗传上的高度杂合性染色体的多种倍性和来源广泛等特点, 使其原生质体培养一直受到重视, 成为小麦育种的重要手段之一, 通常小麦的悬浮培养细胞和愈伤组织常用来作收稿日期 : 作者简介 : 席海秀, 女, 硕士研究生, 研究方向 : 植物分子生物学 ; haixiuxi@yeah.net 通讯作者 : 佟少明, 男, 副教授, 研究方向 : 植物分子生物学 ; tongsm@63.com

2 206,32(4) 69 席海秀等普通小麦幼苗叶肉细胞原生质体分离方法的优化为分离原生质体的材料但应用这两种材料分离原生质体耗时长操作繁琐且经酶解后仍有很多未酶解的组织细胞和已破碎的物质对原生质培养和进一步的遗传转化等极为不利 2 目前仅有少数的报道对小麦叶肉细胞原生质体的分离方法进行了研究本研究以 7 日龄小麦的叶肉细胞为材料对分离原生质体过程中使用的酶浓度酶解时间及酶解液中甘露醇浓度等因素进行研究建立了最佳的小麦叶肉细胞的原生质体制备体系旨为进一步的细胞培养和融合及以原生质体为受体材料而进行的各种遗传操作提供参考 B A 生长 7 d 的麦苗图中圆圈为叶鞘及叶片部分 B 完全浸在的酶解液中的麦苗切段材料与方法. A 图用于制备原生质体的麦苗及酶解液中的麦苗切段材料实验材料为普通小麦 T. aestivum L 品系的尼龙过滤网提前用 W5 洗液润洗过滤到 50 ml CAU98 用 5 的次氯酸钠对种子进行表面消毒处的离心管中去除未酶解的组织每次用 5 ml W5 洗理 0 min 蒸馏水冲洗 3 遍置于 4 冰箱中黑暗液冲洗 3-5 次取滤液室温下 00 g 离心 5 min 去培养 3 d 后将种子分散放置在盛有水的托盘里除上清液用 5 ml 的 W5 洗液将原生质体重新悬水分以没过种子为准置于培养室温度 25 相浮起来 00 g 离心 5 min 重复操作 3 次洗涤纯化对湿度 60 6 h 光照 /8 h 黑暗光强 250 μmol 原生质体最后用 5 ml W5 溶液悬浮原生质体 m s 中培养取播种后生长至第 7 天的麦苗的 g 离心 5 min 收集原生质体叶片及叶鞘部分作为实验材料图 -A.2.3 实验所用载体是在 pbi22 基础上改造而成由小麦原生质体分离条件的优化依据单因素试验结果及已报道的文献资料选取纤维素酶浓度烟草花叶病毒 35S 启动子萤火虫荧光素酶基因和离析酶浓度甘露醇浓度及酶解时间 4 个因素中较 NOS 终止子构成优的 3 个水平进行正交试验设计通过正交试验确.2 定小麦原生质体分离的最优条件实验设计因素水.2. 方法小麦叶肉原生质体分离取 2 g 约株平见表麦苗用新的手术刀片切成 0.5- mm 细条立即将表切好的材料浸没在 0.4 mol/l 甘露醇中黑暗处理 0 小麦原生质体分离正交实验设计因素水平表 min 弃掉甘露醇后将细条培养在装有 20 ml 酶解因素液的三角瓶中用锡纸将三角瓶包好黑暗条件下纤维素酶浓度 /% 离析酶浓度 /% 甘露醇浓度 / mol L- 酶解时间 /h 用真空干燥器抽真空 30 min 使细条完全浸没在酶解液中图 -B 将三角瓶置于摇床中在室温黑暗条件下以 r/min 转速振荡酶解当酶解液变绿后 2 h 在显微镜下观察原生质体分离情况每隔 h 检测一次约 3 h 原生质体可充分释放图 2 释收集到的原生质体取少量原生质体悬浮液滴加.2.2 酶解结束后用在 0. mm 血球计数板上盖上盖玻片在光学显微等体积的 W5 洗液 2 mmol/l MES ph 镜下 0 00 观测计算 4 个角上大格及中央大 mmol/l NaCl 25 mmol/l CaCl2 5 mmol/l KCl 稀格共 5 个大格内的原生质体数目然后按公式释酶解液将原生质体悬浮液经 200 目 0.75 μm 计算原生质体总数每个样品重复 3 次最后计算小麦叶肉原生质体纯化原生质体产量测定用 5-0 倍的 W5 溶液稀

3 70 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 206,Vol.32,No.4 出每克材料分离得到的原生质体产量 ( 个 /g FW) 原生质体数 ( 个 /ml)=5 个大格内原生质体总数稀释倍数原生质体产量 ( 个 /g)=[ 原生质体数 ( 个 /ml) 稀释后体积 (ml)]/ 叶片质量 (g).2.5 原生质体活力测定采用 FDA(Sigma) 染色法检测原生质体活力取 00 μl 原生质体悬浮液, 加入 2 μl 5 mg/ml FDA( 丙酮溶解 ),2-5 min 后在荧光显微镜下观察 [3], 统计发绿色荧光的原生质体数和原生质体总数原生质体活力以一个视野中有活力的原生质体占该视野中原生质体总数的百分数来表示, 随机选取 3 个视野进行统计原生质体活力 =( 发绿色荧光的原生质体数 / 原生质体总数 ) 00%.2.6 小麦原生质体转化将原生质体悬浮液 200 g 离心 5 min, 弃上清收集原生质体 ; 用 MMG 溶液 (4 mmol/l MES ;0.4 mol/l 甘露醇 ;5 mmol/l MgCl 2 ) 稀释原生质体至 0 6 个 /ml ; 取 00 μl 原生质体加入到 2 ml tube 管中, 每管加入 0 μl 质粒 (5-20 μg) 混匀 ; 加入 0 μl 不同浓度的 PEG-Ca 2+ 转化液 (0.2 mol/l 甘露醇 ;00 mmol/l CaCl 2 ;0% 20% 25% 30% 和 40% PEG-4000);23 暗培养 20 min ; 加入 440 μl 的 W5 溶液终止反应,200 g 离心 5 min ; 弃上清, 加入 260 μl 的 WI 溶液 (4 mmol/l MES ;0.5 mol/l 甘露醇 ;5 mmol/l KCl), 混匀后加入到 24 孔板 (BSA 洗液润洗 ),23 暗培养 24 h.2.7 荧光素酶基因瞬时表达检测荧光素酶基因瞬时表达检测采用荧光素酶检测试剂盒 (Promega, USA) 在发光仪 (Berthold,Germany) 上检测所发荧光的强度, 检测过程参照说明书, 略加修改将用液氮快速冷冻转化后过夜培养的原生质体, 充分研磨 ; 加入 00 μl CCLR( 试剂盒中试剂 ) 重新悬浮并匀浆 ; 平衡至室温后 000 g 离心 2 min ; 取上清, 弃碎片, 加入 200 μl 裂解液和 00 μl 检测试剂 ; 混匀后, 于发光仪上检测荧光素酶活性 2 结果 2. 小麦原生质体最佳分离条件的确定在设定的水平范围内, 根据正交实验结果, 对小麦原生质体的产量和活性进行极差分析, 确定纤维素酶离析酶甘露醇浓度及酶解时间 4 个因素对小麦原生质体产量及活性的影响 ( 表 2) 表 2 正交试验结果及极差分析实验组数纤维素酶 /% 离析酶 /% 甘露醇 /(mol L - ) 酶解时间 /h 产量 /( 个 /g FW) 活性 /% K K K R 从表 2 中的极差分析可知, 纤维素酶浓度的 R 值最大, 说明这几个因素中纤维素酶浓度对小麦叶片原生质体分离影响最大 ; 其次是离析酶浓度在本研究中, 选用播种后生长至第 7 天小麦幼苗的叶片和叶鞘制备原生质体时, 酶液组合为.5% 纤维素酶及 0.75% 离析酶, 解离 3 h 后分离到的原生质体

4 席海秀等普通小麦幼苗叶肉细胞原生质体分离方法的优化 206,32(4) 7 的产量可以达到个 /g FW 麦原生质体进行染色染色后发绿色荧光的原生质 2.2 小麦原生质体活力测定体为有活力的原生质体荧光显微镜下观察大部分原生质体活力高低是代表原生质体分离质量好小麦原生质体发出绿光染色清晰图 2-D E F 坏的重要指标之一本研究中采用 FDA 染色法对小最佳酶解条件下原生质体活力可高达 98% A B 及 C 为光学显微镜下观察分离到的原生质体分别放大 00 倍 200 倍及 600 倍 D E 及 F 为荧光显微镜下观察分离的 FDA 染色后的原生质体分别放大 00 倍 200 倍及 600 倍图2 显微镜下观察分离到原生质体及原生质体活力检测瞬时表达转化原生质体 40% 的 PEG 浓度的相对较低其中在 0% 的 PEG 本研究将含有改造过的萤火虫荧光素酶的载体浓度下小麦原生质体的转化效率最低 pbi22 通过 PEG-Ca 法转化进入小麦的原生质体 3 讨论探讨了不同 PEG 浓度对小麦原生质体的转化效率的原生质体可以从植物叶片叶鞘叶柄茎等影响结果图 3 发现 25% PEG 浓度下小麦原组织器官中分离出来由于叶片来源广泛叶肉细生质体的转化效率显著的高于其他浓度 P<0.0 最高其次是 30% 和 20% 的 PEG 浓度 0% 及胞排列松散等特点是植物原生质体分离的常用材料 4 本研究在分别取用播种后水培养 7 d 的小麦幼苗的叶片和叶鞘分离原生质体时发现叶片与叶.0 06 鞘分离出的原生质体的产量几乎相差无几但取用幼茎作材料时产量显著低于叶片和叶鞘最适宜㦗 ݹ ᕪᓖ 的培养时间为 5-7 d 最佳为 7 d 若低于 5 d 由于材料过于幼嫩不容易控制酶解时间同时分离到的碎片太多不利于后期遗传转化即使调节酶解液浓度效果也不明显超过 7 d 后相应要增加酶解时间可能是叶片幼嫩程度不一致随着酶解时间的延长先分离出的原生质体就会破碎产生的碎片也不利 PEG ᓖ/% 图 3 不同浓度 PEG 介导的转化小麦原生质体的瞬时表达荧光强度于后期遗传转化因此在本研究中我们选用播种后生长 7 d 左右的小麦幼苗的叶片和叶鞘作为分离材料时得到的原生质体的产量最高质量最佳

5 72 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 206,Vol.32,No.4 酶解法是目前植物原生质体分离的主要方法, 酶解材料时, 酶液的组成浓度渗透压及酶解时间等因素对原生质体的产量和活力会产生显著的影响酶液的组合和浓度要随酶解材料的不同略有差异 [5,6] [7], 孙鹤等以 0 日龄小麦叶片为材料分离原生质体, 最佳酶液组合为.5% 纤维素酶及 0.5% 离析酶, 酶解 5 h 后产量达个 /g FW 在本研究中, 选用 7 日龄小麦幼苗叶片和叶鞘制备原生质体, 发现酶液组合为.5% 纤维素酶及 0.75% 离析酶, 解离 3 h 后产量就可达个 /g FW, 采用此酶液的组合在缩短了酶解时间的同时, 增加了原生质体的产量 ; 酶解液中渗透压的调节是依赖于不同浓度的甘露醇来实现的, 不适宜的渗透压会造成原生质体的胀裂或皱缩在酶液和洗涤液中, 广泛使用的渗透压调节剂浓度约在 mol/l [8] 本实验结果表明, 用 0.4 mol/l 甘露醇作为渗透剂有利于小麦叶肉原生质体渗透压的稳定, 分离的原生质体呈饱满球形, 活力较高 ( 图 2-A C); 酶解时间是影响原生质体分离的另一重要因素, 酶解时间过短, 原生质体释放不充分产量太低, 时间过长则导致较早游离出来的原生质体破裂本实验中酶解 2 h 后仅有少量原生质体游离出来, 超过 3 h 的酶解时间虽然会使原生质体的产量增加, 但细胞碎片增多, 影响原生质体活力, 不利于后续融合转化等实验经过综合分析, 确定小麦原生质体分离最佳的酶解时间为 3 h, 此时分离的原生质体产量高碎片少且均具有较高活性除此之外, 原生质体分离的过程中还需要考虑其他的因素, 如酶解液的 ph 值离心力酶解温度等酶解液的 ph 值过低或过高时, 产量都不高, 原因是受到酶的活力的影响, 纤维素酶的最适 ph 是 [9] ; 离析酶有效作用的 ph 是 [20], 因此, 酶解液的 ph 要同时使两种酶的活性达到最佳此外,pH 值还对细胞膜及细胞保护系统有较大的影响 [8] 本研究从上述两方面考虑, 确定酶液的最适 ph 值为 5.6 离心收集原生质体时所用离心力为 00 g(brake 为 3), 离心时间为 5 min 较合适, 实验中发现离心力低于 00 g 无法将原生质体完全沉淀下来, 过大时会使沉淀下来的原生质体压实, 后续无法充分洗涤干净, 且会造成原生质体破碎降低原生质体产量活性染色法是测定原生质体活力的方法之一, 其中最常用的是 FDA 和台盼蓝染色 FDA 染色, 即荧光素双醋酸酯染色法, 因为 FDA 本身不产生荧光, 且能自由出入完整的细胞膜, 当 FDA 进入活细胞后, 被细胞内的酯酶分解生成荧光素, 因此有活力的原生质体能够产生荧光 ; 台盼蓝染液可以通过死亡原生质体的细胞膜而使死亡细胞染成蓝色, 但由于染料无法透过活细胞, 因此活细胞不被着色, 另外由于叶绿体的存在, 在显微镜下看到的是深蓝色, 不容易同活细胞区分 [2] 因此,FDA 比台盼蓝染色更清晰, 且不会受到叶绿体等内含物的干扰, 并且适用于不同来源的原生质体影响原生质体转化效率的因素有许多, 如原生质体纯度和活力质粒 DNA 大小和纯度 DNA 与原生质体的比例孵育时间及 PEG 浓度等 [7,22] PEG 浓度是影响转化率的最重要因素, 不同植物, 甚至同种植物不同的供试组织分离到的原生质体, 其转化所需的 PEG 浓度都是存在差异的 [23] 据报道, 终浓度为 0%-20% 的 PEG 浓度可使拟南芥原生质体转化效率达到最佳 [3] 有报道表明,25% 的 PEG 浓度对于 0 日龄麦苗分离到的原生质转化率是最高的 [7], 在本研究中, 也发现 25% 的 PEG 浓度对于 7 日龄麦苗分离到的原生质体的转化率最高 4 结论综合原生质体产量活力及转化效率等多方面考虑, 确定 7 日龄小麦麦叶肉细胞原生质体分离的最佳条件为 : 酶解液组合为纤维素酶.5% 及离析酶 0.75%, 酶液中甘露醇浓度为 0.4 mol/l, 酶解时间为 3 h, 原生质体的产量可达个 /g FW, 且分离到的原生质体呈饱满球形, 淡绿色叶绿体多, 清晰均匀分布在原生质体中, 并含有颗粒状内含物, 活力较强, 均超过 95% 在 PEG 浓度为 25% 时, 小麦原生质体的转化率是最高的参考文献 []Sheen J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts[j]. Plant Physiol, 200, 27(4): [2]Robert S, Zouhar J, Carter C, Raikhel N. Isolation of intact vacuoles

6 206,32(4) 席海秀等 : 普通小麦幼苗叶肉细胞原生质体分离方法的优化 73 from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts[j]. Nat Protoc, 2007, 2(2): [3]Yoo SD, Cho YH, and Sheen J. Arabidopsis mesophyll protoplasts :a versatile cell system for transient gene expression analysis[j]. Nat Protoc, 2007, 2(7): [4]Vasil IK, Vasil V. Totipotency and embryogenesis in plant cell and tissue cultures[j]. In Vitro, 972, 8(3):7-25. [5]Zaitlin M, Beachy RN. The use of protoplasts and separated cells in plant virus research[j]. Advances in Virus Research, 974, 9:. [6]Cocking EC. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles[j]. Nature, 960, 87 : [7]Fischer R, Hain R. Tobacco protoplast transformation and use for functional analysis of newly isolated genes and gene constructs[j]. Methods Cell Biol, 995, 50 : [8]Zhang Y, Su J, Duan S, et al. A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/ chloroplast-related processes[j]. Plant Methods, 20, 7(): 30. [9]Pitzschke A, Persak H. Poinsettia protoplasts - a simple, robust and efficient system for transient gene expression studies[j]. Plant Methods, 202, 8():4. [0]Shahin E. Totipotency of tomato protoplasts[j]. Theoretical and applied genetics, 985, 69(3): [] 葛台明, 章荣德, 秦发兰, 等. 冬小麦原生质体培养的胚状体直接发生 [J]. 生物工程学报, 2000, 6(5): [2] 张小红, 闵东红, 邵景侠. 小麦愈伤组织诱导及原生质体的分离与纯化 [J]. 中国农学通报, 200, 26(2): [3]Larkin PJ. Purification and viability determinations of plant protoplasts[j]. Planta, 976, 28(3): [4] 彭小群, 唐然, 解新明. 禾本科植物原生质体分离研究进展 [J]. 中国农学通报, 205(): [5]Cao J, Yao D, Lin F et al. PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts :a valuable tool for signal transduction study in maize[j]. Acta Physiologiae Plantarum, 204, 36(5): [6]Yang JW, Fu JX, Li J et al. Novel Co-immunoprecipitation protocol based on protoplast transient gene expression for studying protein and protein interactions in rice[j]. Plant Molecular Biology Reporter, 204, 32():53-6. [7] 孙鹤, 郎志宏, 朱莉, 等. 玉米, 小麦, 水稻原生质体制备条件优化 [J]. 生物工程学报, 203, 29(2): [8] 赵红娟, 张博, 陈爱萍, 等. 酶解对苜蓿子叶原生质体分离效果的影响 [J]. 草地学报, 2008, 6(): [9] 路梅, 李多川. 嗜热毛壳菌 (Chaetomium thermophile) 液体发酵产生纤维素酶及酶学性质的研究 [J]. 工业微生物, 2003, 33(3):2-24. [20] 林开江, 袁康培, 王坤元, 等. 植物细胞离析酶的制备和应用 [J]. 生物工程学报, 994, 0():7-75. [2] 黄静, 赵琦, 李楠, 等. 烟草原生质体活力检测和细胞核染色方法的研究 [J]. 首都师范大学学报, 2007, 28(4): [22] 霍鹏, 言普, 沈文涛, 等. PEG 介导番木瓜叶肉原生质体瞬时表达体系的建立 [J]. 分子植物育种, 205(4): [23] 何业华, 胡芳名. 枣树原生质体分离条件的研究 [J]. 中南林学院学报, 999, 9(): ( 责任编辑狄艳红 )

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