连接

Size: px

Start display at page:

Download "连接"

越赖
7 years ago
Views:

1 24 doi.3969/j.issn J South Med Univ, 26, 36(9): 临床研究 DNase I 许夏雨, 杨文芳 2, 张思功 3, 赵琴, 梁丽君, 王鑫 3, 沈海丽兰州大学第二临床医学院, 甘肃兰州 733; 2 河北联合大学附属开滦总医院风湿免疫科, 河北唐山 63; 3 兰州大学第二医院风湿免疫科, 甘肃兰州 733 摘要 : 目的探讨脱氧核糖核酸酶 Ⅰ(DNase Ⅰ) 在类风湿关节炎中潜在的致病作用方法辐射状酶扩散法测定 83 例类风湿关节炎 (RA) 患者和 6 名健康对照者血清 DNaseⅠ 活性以及 27 例 RA 患者和 38 例其他炎症性关节炎患者滑液 (SF)DNaseⅠ 活性, PicoGreen 试剂盒测定游离 DNA(cfDNA) 水平, 并分析两者与 RA 患者临床指标的相关性结果 RA 组血清 DNaseⅠ 活性显著低于健康对照组 [(.365±.436)U/mL vs(.4289±.976)u/ml, P<.]; 血清 DNaseⅠ 活性与 ESR(r=-.2862, P=.) CRP(r=-.279, P=.84) 和中性粒细胞计数 (r=-.287, P=.) 呈负相关 SF DNaseⅠ 活性在 RA 强直性脊柱炎组和痛风性关节炎组中几乎都是阴性的 RA 组患者 SF cfdna 水平明显高于骨性关节炎组患者 [(.8±42.98)μg/mL vs (8.98±3.4)μg/mL, P=.2]; 与强直性脊柱炎组 (45.85±47.67 μg/ml, P=.428) 和痛风性关节炎组 (62.95±97.49 μg/ml, P=.32) 无显著性差异 ; 炎症性关节炎患者 SF cfdna 水平与 ESR(r=.46, P=.6) 和 CRP(r=.5747, P=.2) 呈显著正相关结论 DNase I 活性受损可能是中性粒细胞胞外网状陷阱形成增强的原因并在 RA 发病机制中起作用关键词 : 关节炎, 类风湿 ; 脱氧核糖核酸酶 Ⅰ;DNA Correlation of DNase I in serum and synovial fluid with inflammatory activity in patients with rheumatoid arthritis XU Xiayu, YANG Wenfang 2, ZHANG Sigong 3, ZHAO Qin, LINAG Lijun, WANG Xin, SHEN Haili 3 Second School of Clinical Medicine, Lanzhou University, Lanzhou 733, China; 2 Department of Rheumatology and Immunology, Kailuan General Hospital Affiliated to Hebei United University, Tangshan 63, China; 3 Department of Rheumatology and Immunology, Second Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 733, China Abstract: Objective To investigate the potential role of deoxyribonuclease I (DNase I) in the pathogenesis of rheumatoid arthritis (RA). Methods DNase I activity was measured by radial enzyme-diffusion method in serum samples from 83 RA patients and 6 healthy volunteers and in the synovial fluid (SF) from 27 RA patients and 38 patients with other inflammatory arthritis. SF cfdna level was measured with Pico Green Kit, and the correlation among DNase I activity, cfdna level and clinical parameters of RA patients was analyzed. Results Serum DNase I activity was significantly lower in RA patients than in the healthy control subjects (.365±.436 vs.4289±.976 U/mL, P<.), and was negatively correlated with ESR (r=-.2862, P=.), CRP (r=-.279, P=.84) and neutrophil cell counts (r=-.287, P=.). SF DNase I activity was almost negative in patients with RA, ankylosing spondylitis (AS) and gouty arthritis (GA). SF cfdna level in RA patients was significantly higher than that in patients with osteoarthritis (.8±42.98 vs 8.98±3.4 μg/ml, P=.2), but similar to that in patients with AS (45.85±47.67 μg/ml, P=.428) and GA (62.95±97.49 μg/ml, P=.32). In patients with inflammatory arthritis, SF cfdna level was positively correlated with ESR (r=.46, P=.6) and CRP (r=.5747, P=.2). Conclusion Impairment of DNase I activity may be responsible for the enhanced NETs generation and plays a role in the pathogenesis of RA. Key words: arthritis, rheumatoid; deoxyribonuclease I; DNA 类风湿关节炎 (RA) 是一种慢性自身免疫性疾病, 以关节滑膜炎症为主要病理特征引起 RA 发生的早收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金 (856267); 甘肃省科技支撑计划 - 社会发展类项目 (44FKCA6); 甘肃省卫生行业科研计划管理项目 (GWGL24-47); 亚太风湿病学会研究基金 25 Supported by National Natural Science Foundation of China (856267). 作者简介 : 许夏雨, 硕士研究生, @qq.com 通信作者 : 沈海丽, 博士, 主任医师, shl52394@sohu.com 期事件仍未清楚, 但抗瓜氨酸化蛋白抗体 (ACPAs) 的形成被认为是其关键的致病事件, 因为 RA 相关的致病性 [] 自身抗体先于临床症状出现近来有研究指出中性粒细胞胞外网状陷阱 (NETs) 是瓜氨酸化自身抗原的来 [2-3] 源且其本身可能是自身抗体的靶点 RA 患者中性粒细胞能通过一种新的死亡方式即 NETosis 自发形成 NETs [4], 使瓜氨酸化的波形蛋白和 ɑ- 烯醇化酶外化, 此外还能诱导成纤维滑膜细胞表达和分泌促炎症细胞因

2 J South Med Univ, 26, 36(9): 子如 IL-8 等, 反过来又可进一步增强 NETosis [5], 扩大瓜氨酸化自身抗原暴露和促进易感个体自身抗体形成体外形成的 NETs 能被脱氧核糖核酸酶 Ⅰ(DNaseⅠ) 和健康者血浆降解, 而自身血浆则不能或不完全能降 [6-7] 解, 说明体内 NETs 降解受损可能与 DNaseⅠ 异常有关 DNaseⅠ 活性受损与狼疮性肾炎相关也支持了该 [8-9] 观点 NETosis 在 RA 中是增强的, 如果 DNaseⅠ 活性存在异常而不能有效降解 NETs, 势必会增加 NETs 的暴露, 加重 ACPAs 的异常形成, 且进一步诱发炎症反应而使关节炎症恶化本研究拟通过测定血清和关节液 DNaseⅠ 活性, 分析其活性是否存在异常及与 NETs 在 RA 致病是否相关并对关节液中 NETs 标记物 (cfdna) 进行测定, 进一步分析 DNaseⅠ 与 NETs 的关系 DNaseⅠ 活性异常可能是 RA 发病中的一个中心环节, 因此对其机制的阐明能为 RA 治疗提供新的理论基础资料和方法. 研究对象纳入我院住院 RA 患者 83 例, 其中女性 63 例, 男性 2 例, 年龄 27~86 岁, 平均 59±3 岁, 所有患者均符合 987 年 ACR 修订的 RA 分类诊断标准同期纳入年龄和性别匹配健康对照者 6 名血清标本来自以上患者和健康者关节液来自 24 年 7 月 ~25 年月我院住院和门诊患者, 其中 RA 患者 27 例, 女性 23 例, 男性 4 例, 年龄 ~68 岁, 平均 53± 岁 ;OA 患者 23 例, 女性 6 例, 男性 7 例, 年龄 42~8 岁, 平均 57± 岁 ;AS 患者 9 例, 女性 4 例, 男性 5 例, 年龄 7~46 岁, 平均 27± 岁 ; GA 患者 6 例, 全为男性, 年龄 33~64 岁, 平均 44± 岁.2 标本采集和资料收集血清标本采集 : 清晨空腹抽取 RA 和健康者全血 5 ml,3 r/min 离心 min, 分离血清并取.5 ml 分装后 -3 冻存, 用于检测血清 DNaseⅠ 活性关节液标本采集 : 膝关节穿刺术抽取 RA 和其他炎症性关节炎患者关节液,3 r/min 离心 min 后取上清液放入 Eppendorf 管 -8 保存待测收集 RA 患者标本采集时的临床资料, 包括病程 ESR CRP 评分中性粒细胞计数 RF 和抗 CCP 抗体.3 DNaseI 活性的测定采用辐射状酶扩散法测 DNaseⅠ 活性该法基于对底物 dsdna 的降解, 配制含有 dsdna(sigma) 和核酸染料 Sybr Green(Sigma) 的琼脂糖 (Biowest) 凝胶, 用血清 / 关节液扩散降解底物 dsdna 后用凝胶成像系统测量扩散面积具体步骤为 : 牛甲状腺 dsdna 用蒸馏水溶解为 5 mg/ml 的溶液, 取.86 ml 的 dsdna 溶液加入 8.4 ml 的 DNaseⅠ 缓冲液 ( mmol/l Tris-HCl ph7.5, mmol/l MgCl 2,2 mmol/l CaCl 2 和 5 mmol/l NaCl) 中, 并加入电泳级 Sybr Green(/) μl, 混匀后加热至 4~5 同时用 DNaseⅠ 缓冲液配制 2 ml 的 2% 的琼脂糖凝胶, 待温度降至 4~5 时与配制好的 dsdna 混合液混匀, 将胶倒入 96 孔细胞培养板的板盖中, 待胶凝固后在每孔中央用 μl 吸头加入 2 μl 血清 / 关节液, 用已知浓度的 DNaseⅠ 配制标准品, 每孔加入从. U/mL 倍比稀释到.34 U/mL 的 DNaseⅠ 标准品各 2 μl, 胶用自封袋封口后避光 37 温箱孵育 2 h 采用 PCR 凝胶成像系统拍照,IPP6. 软件定量分析.4 关节液 cfdna 的测定采用 PicoGreen 试剂盒测定关节液 cfdna 含量该法基于荧光核酸染料 PicoGreen 可特异性结合 dsdna, 结合后经 488 nm 荧光激发后可发出 52 nm 荧光, 荧光酶标仪可准确读数用已知浓度的 Lambda DNA 作为标准品, 根据标准品可推算出样品浓度简要步骤为 : 经离心的关节液稀释 4 倍后取 μl 加入黑色 96 孔微孔板, 加入经 2 倍稀释的 PicoGreen μl, 室温孵育 min 后使用荧光酶标仪测定荧光值.5 统计学处理采用 Graphpad Prism5 软件制图,SPSS 9. 软件进行分析, 符合正态分布的计量资料用均数 ± 标准差表示, 组间比较应用独立样本 t 检验 ; 不满足正态分布的计量资料用 M(P 25,P 75) 表示, 组间比较应用 Mann- Whitney U 检验 ; 两变量之间的相关性应用 Pearson 和 Spearman 相关分析 P<.5 认为差异有统计学意义 2 结果 2. RA 血清 DNaseⅠ 活性降低与疾病活动度的关系 RA 血清 DNase Ⅰ 活性显著低于健康对照组 (.365±.436 U/mL vs.4289±.976 U/mL,P<.), 差异有统计学意义 ( 图 A); 进一步分析 RA 血清 DNase I 活性与临床指标的相关性发现其与 ESR (r=-.2862,p=., 图 C) CRP(r=-.279,P=.84, 图 D) 和中性粒细胞计数 (r=-.287,p=.) 呈负相关, 而与 (r=-.324,p=.2544, 图 B) RF 抗 CCP 抗体无关 ( 表 ) 2.2 各组炎症性关节炎患者关节液中 DNaseⅠ 几乎无活性关节液中 DNaseⅠ 活性的测定同样采用辐射状酶扩散法, 该法基于测定 DNaseⅠ 降解琼脂糖凝胶的面积来推算其活性由于根据标准品计算出的 DNaseⅠ 活性在炎症性关节炎中只有 2 例阳性, 其中例为 RA, 例为 OA, 故通过比较 DNaseⅠ 降解琼脂糖的面积大小来比较各组间是否有差异如图 2A 所示,DNaseⅠ 活性

3 26 J South Med Univ, 26, 36(9): A Control *** RA B r=.324 P= n= C ESR (mm/h) 2 r= P=. n= D Sera CRP concentration (mg/dl) r=-.279 P=.84 n= 图血清 DNase I 活性分布及其与疾病活动的关系 Fig. Distribution of serum DNase I activity and its relationship with disease activity. 表 RA 血清 DNaseⅠ 活性与临床指标的相关性 Tab. Correlation between serum DNase I activity of RA and clinical parameters Duration ESR CRP Neutrophil cell counts RF Anti-CCP antibody r P n 在各组间无统计学差异可见 DNaseⅠ 在这些炎症性关节炎关节液中几乎是无活性的 2.3 关节液 cfdna 与炎症指标的关系 RA 组关节液 cfdna 水平显著高于 OA 组 (.8± μg/ml vs 8.98±3.4 μg/ml,p=.2, 图 2B), 其水平与病程 ESR CRP 中性粒细胞计数 RF-IgG RF-IgA RF-IgM 及抗 CCP 抗体无关 ( 表 2) RA 组关节液 cfdna 水平较 AS 组 (45.85±47.67 μg/ml,p=.428) 高, 较 GA 组 (62.95±97.49 μg/ml,p=.32) 低, 但差异均无统计学意义与 OA 组和 AS 组相比, GA 组 cfdna 水平显著升高 (62.95±97.49 μg/ml vs 8.98 ± 3.4 μg/ml,p<.);(62.95 ± μg/ml vs ± μg/ml,p=.8); 而 OA 和 AS 组间 cfdna 水平无差异对所有炎症性关节炎患者关节液 cfdna 水平与炎症指标间的相关性分析发现其水平与 ESR(r=.46,P=.6) 和 CRP(r=.5747,P=.2) 呈显著正相关 ( 图 2C,D) 3 讨论我们的研究发现血清 DNaseⅠ 活性在 RA 中是受损的, 而关节液 DNaseⅠ 活性比血清低血清 DNaseⅠ 活性与炎症指标 ESR 和 CRP 及中性粒细胞计数呈负相关可见 DNaseⅠ 活性不足是 NETs 调控异常的一个重要因素, 而关节液中异常增高的 NETs 标记物 (cfdna) 提示关节炎症中大量形成的 NETs 不能被 DNaseⅠ 降解可能是重要的自身抗原来源虽然中性粒细胞在凋亡和其他炎症细胞在 NETosis 相关的过程中可能释放它们的染色质, 但关节液 cfdna 可能更多来源于 NETosis 因为在早期 RA [] 患者关节液中中性粒细胞凋亡水平是显著减少的, 且只有极少量嗜酸性细胞和肥大细胞存在于 RA 患者关 [] 节液中我们的研究发现 RA 关节液 cfdna 水平是升高的, 而关节液 DNaseⅠ 活性是显著降低的, 说明 RA 关节中 NETs 形成是增强的,DNaseⅠ 活性降低使 NETs 过度形成和持续存在推测 NETs 在 RA 中的致病作用

4 J South Med Univ, 26, 36(9): A Synovia DNase I activity (relative area) DNase I positive DNase I negative RA OA Gout AS B Synovia cfdna level (μg/ml) ** ** * RA OA Gout AS C ESR (mm/h) 5 5 r=.46 P=.6 n= Synovia cfdna concentration (μg/ml) D Sera CRP concentration (mg/dl) 3 2 r=.5747 P=.2 n= Synovia cfdna concentration (μg/ml) 图 2 关节液 DNase I 和 cfdna 分布以及 cfdna 和炎症指标间的相关性 Fig.2 Distribution of synovial fluid DNase I and cfdna and the correlation between cfdna and inflammatory markers. 表 2 RA 关节液 cfdna 水平与临床指标的相关性 Tab.2 Correlation between synovial fluid cfdna level and clinical parameters in RA patients Duration ESR CRP Neutrophil cell counts RF-IgG RF-IgA RF-IgM Anti-CCP antibody r P n 是由于 DNase Ⅰ 活性降低或缺陷不能及时降解 NETosis 过程中形成的染色体 DNA 网状物, 使瓜氨酸化自身抗原暴露, 机体对自身抗原丧失免疫耐受导致特异性自身抗体形成和炎症反应, 该炎症坏境反过来又高度有利于 NETosis 的产生, 造成一个恶性循环本研究显示 RA 关节液 cfdna 水平与疾病活动度无相关性, 这可能与疾病处于不同时期药物干预等因素有关但在炎症性关节炎关节液中均存在不同程度 cfdna 水平且与 ESR 和 CRP 呈显著正相关说明 NETs 在这些疾病关节液中都有形成, 而瓜氨酸化蛋白不仅存在于 RA 患者关节液中, 在其他炎症性关节炎关 [2] 节液中也存在, 因此蛋白瓜氨酸化可能是一种炎症相关的表现此外在痛风性关节炎患者中关节液 cfdna 水平是显著升高的, 其是所有炎症性关节炎中发病急炎症程度最强的, 在急性期单钠尿酸盐结晶沉积在关节液和滑膜, 可使大量中性粒细胞聚集并活化导致 NETs [3-4] 聚合物形成 DNaseⅠ 对中性粒细胞 NETs 形成具有负向调节作 [5] 用, 其是浓度依赖型的, 此外 NETs 还能通过巨噬细胞的吞噬作用被清除, 该调节机制是表型和时间依赖型的 M 型巨噬细胞在与 NETosis 相互作用下能增加其 [6] 自身 cfdna 的释放, 但最后能被其完全降解巨噬细胞功能紊乱是否参与 RA 的发病机制还未知, 但 RA 关节液 cfdna 水平与巨噬细胞数量无关而与中性粒细 [7] 胞计数显著相关, 说明关节液 NETs 增强可能主要以 DNaseⅠ 活性受损为主表达 DNaseⅠ 的病原微生物能抑制后期中性粒细胞活性氧簇 (reactive oxygen [8] species, ROS) 的产生, 进而逃离 NETs 捕杀 RA 中性粒细胞 NETosis 依赖 ROS 的产生,DNaseⅠ 在 RA 中的作用在某方面上可能是通过抑制 ROS 的产生减少 NETs 形成及促进已形成 NETs 降解总之, 蛋白瓜氨酸化参与 RA 的发病,NETs 是瓜氨酸化蛋白的来源之一, 而 DNase I 活性不足可能导致 NETs 来源的瓜氨酸化蛋白暴露, 引起异常免疫应答和

5 28 J South Med Univ, 26, 36(9): 炎症的发生也许外源性给予 DNaseⅠ 或抑制诱导 NETosis 的信号转导级联中的成分能为 RA 的治疗提供新的思路和靶点参考文献 : [] Holers VM. Autoimmunity to citrullinated proteins and the initiation of rheumatoid arthritis[j]. Curr Opin Immunol, 23, 25(6): [2] Khandpur R, Carmona-Rivera C, Vivekanandan-Giri A, et al. NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis[j]. Sci Transl Med, 23, 5(78): 2. [3] Pratesi F, Dioni I, Tommasi C, et al. Antibodies from patients with rheumatoid arthritis target citrullinated histone 4 contained in neutrophils extracellular traps[j]. Ann Rheum Dis, 24, 73(7): 44-. [4] Sur Chowdhury C, Giaglis S, Walker UA, et al. Enhanced neutrophil extracellular trap Generation in rheumatoid arthritis: analysis of underlying signal transduction pathways and potential diagnostic utility[j]. Arthritis Res Ther, 24, 6(3): R. [5] Gupta AK, Hasler P, Holzgreve W, et al. Induction of neutrophil extracellular DNA lattices by placental microparticles and IL-8 and their presence in preeclampsia[j]. Hum Immunol, 25, 66(): [6] Jimenez-Alcazar M, Napirei M, Panda R, et al. Impaired DNase- mediated degradation of neutrophil extracellular traps is associated with acute thrombotic microangiopathies[j]. J Thromb Haemost, 25, 3(5): [7] Li J, Zhang Y, Zhou X, et al. Establishment and evaluation of an in vitro method for neutrophil extracellular trap Generation and degradation[j]. J Cell Molecular Immunol, 24, 3(9): [8] Hakkim A, Fuernrohr BG, Amann K, et al. Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis[j]. Proc Natl Acad Sci USA, 2, 7(2): [9] Martinez-Valle F, Balada E, Ordi-Ros J, et al. DNase activity in systemic lupus erythematosus patients with and without nephropathy[j]. Rheumatol Int, 2, 3(2): 6-4. []Raza K, Scheel-Toellner D, Lee CY, et al. Synovial fluid leukocyte apoptosis is inhibited in patients with very early rheumatoid arthritis [J]. Arthritis Res Ther, 26, 8(4): R2. []Freemont AJ, Denton J. Disease distribution of synovial fluid mast cells and cytophagocytic mononuclear cells in inflammatory arthritis[j]. Ann Rheum Dis, 985, 44(5): [2]Kinloch A, Lundberg K, Wait R, et al. Synovial fluid is a site of citrullination of autoantigens in inflammatory arthritis[j]. Arthritis Rheum, 28, 58(8): [3]Maueröder C, Kienhöfer D, Hahn J, et al. How neutrophil extracellular traps orchestrate the local immune response in gout[j]. J Mol Med, 25, 93(7): [4]Schett G, Schauer C, Hoffmann M, et al. Why does the gout attack stop?a roadmap for the immune pathogenesis of gout[j]. RMD Open, 25(Suppl ): e46. [5]Meng W, Paunel-Görgülü A, Flohé S, et al. Deoxyribonuclease is a potential counter regulator of aberrant neutrophil extracellular traps formation after major trauma[j]. Mediators Inflamm, (): [6]Nakazawa D, Shida H, Kusunoki Y, et al. The responses of macrophages in interaction with neutrophils that undergo NETosis [J]. J Autoimmun, 26, 67(9): [7]Spengler J, Lugonja B, Ytterberg AJ, et al. Release of active peptidyl arginine deiminases by neutrophils can explain production of extracellular citrullinated autoantigens in RA synovial fluid[j]. Arthritis Rheumatol, 25, 67(2): [8]Munafo DB, Johnson JL, Brzezinska AA, et al. DNase I inhibits a late phase of reactive Oxygen species production in neutrophils[j]. J Innate Immun, 29, (6): ( 编辑 : 孙昌朋 )

<4D6963726F736F667420576F7264202D20B2CCA3BA4542B2A1B6BE52746120496747BFB9CCE5D3EBB1C7D1CAB0A9B7D6C6DAB5C4B9D8CFB52E646F63>

<4D6963726F736F667420576F7264202D20B2CCA3BA4542B2A1B6BE52746120496747BFB9CCE5D3EBB1C7D1CAB0A9B7D6C6DAB5C4B9D8CFB52E646F63> EB 病毒 Rta/IgG 抗体与鼻咽癌分期的关系蔡永林, 郑裕明, 成积儒, 李军, 莫永坤, 钟青燕 ( 广西梧州市红十字会医院, 梧州市肿瘤防治研究所, 广西梧州 543002) 摘要 : 目的探讨 EB 病毒 Rta/IgG 抗体与鼻咽癌临床分期的关系方法用酶