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此畏许
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1 中南大学学报 ( 医学版 ) J Cent South Univ (Med Sci) 2016, 41(5) DOI: /j.issn 表皮生长因子及睾酮对尿道下裂尿道板成纤维细胞雄激素受体活化水平的影响林俊山 1, 谢承 2, 陈瑞庆 3 1, 李笃妙 (1. 福建医科大学附属第一医院小儿外科, 福州 ;2. 福建省福州儿童医院小儿外科, 福州 ; 3. 福建医科大学附属第一医院中心实验室, 福州 ) [ 摘要 ] 目的 : 探讨尿道下裂尿道板成纤维细胞雄激素受体 (androgen receptor,ar) 的表达情况及表皮生长因子 (epidermal growth factor,egf) 和睾酮 (testosterone,t) 对 AR 活化水平的影响方法 : 原代培养尿道下裂患儿的尿道板成纤维细胞, 分别采用 EGF 和不同浓度睾酮干预, 通过免疫细胞化学技术及图形分析技术检测成纤维细胞中 AR 活化水平的变化结果 : 在生理浓度睾酮 ( mol/l) 的作用下, 中远端型尿道下裂组与对照组 AR 的活化水平差异无统计学意义 (P>0.05), 近端型尿道下裂组的成纤维细胞 AR 的活化水平与其他两组比较有明显的差异 (P<0.001) 在睾酮浓度为 mol/l 时,3 个组 AR 活化有明显差异 ( 对照组 > 中远端型组 > 近端型组,P<0.001) 在 EGF 与生理浓度睾酮干预下, 近端型尿道下裂组的成纤维细胞 AR 的活化程度升高最为明显, 与对照组及中远端型组有明显差异 (P<0.001), 中远端型组 AR 的活化升高的水平与对照组相比也有提高 (P=0.02) 结论: 尿道下裂尿道板成纤维细胞 AR 的表达与活化均存在异常,EGF 可提升不同类型尿道下裂尿道板成纤维细胞 AR 的活化水平, 尤以近端型明显 [ 关键词 ] 表皮生长因子 ; 睾酮 ; 雄激素受体 ; 尿道下裂 ; 成纤维细胞 Effect of epidermal growth factor and testosterone on androgen receptor activation in urethral plate fibroblasts in hypospadias LIN Junshan 1, XIE Cheng 2, CHEN Ruiqing 3, LI Dumiao 1 (1. Department of Pediatric Surgery, First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou ; 2. Department of Pediatric Surgery, Children Hospital of Fuzhou, Fuzhou ; 3. Central Laboratory, First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou , China) ABSTRACT Objective: To investigate androgen receptor (AR) expression and the effect of epidermal growth factor (EGF) and testosterone on AR expression level. 收稿日期 (Date of reception): 第一作者 (First author): 林俊山, fyyy @126.com 通信作者 (Corresponding author): 林俊山, fyyy @126.com 基金项目 (Foundation item): 福建医科大学青年骨干教师培养专项基金 ( JGG201314) This work was supported by Young Key Teacher Special Fund from Fujian Medical University, P. R. China ( JGG201314).

2 508 中南大学学报 ( 医学版 ), 2016, 41(5) Methods: EGF or different concentrations of testosterone were incubated with the primary urethral plate fibroblasts from patients with hypospadias. The levels of AR expression in the fibroblasts were detected by immunocytochemical assays and graphical analysis. Results: There was no significant difference in AR activation under physiological concentrations ( mol/l) of testosterone between the control and the distal hypospadias group (P>0.05). However, there was a significant decrease in AR activation in the proximal hypospadias group compared to that in the control group (P<0.001). Under the concentration of mol/l, the effects of testosterone on AR activation were dramatically different in the three groups (control group>distal hypospadias group>proximal hypospadias group, P<0.001). AR activation level in the group of proximal hypospadias was improved most obviously when EGF and physiological concentration of testosterone were employed in the urethral plate fibroblasts from hypospadias patients (P<0.001), and it was improved more in the distal hypospadias group than that in the control group (P=0.02). Conclusion: AR expression and activation in the urethral plate fibroblasts from hypospadias patients are abnormal. EGF can be used to improve AR activation in fibroblasts from different types of hypospadias, especially in the proximal type. KEY WORDS epidermal growth factor; testosterone; androgen receptor; hypospadias; fibroblasts 尿道下裂是小儿外科常见的一种先天畸形, 该病的发病机制比较复杂, 目前尚未完全阐明经典的尿道下裂病因学理论认为尿道下裂的发生是男性外生殖器发育障碍所造成的, 而引起男性外生殖器发育障碍的重要因素是雄激素及受体功能异常 [1] [2-4] 近年来, 研究发现生长因子家族的细胞因子如表皮生长因子 (epidermal growth factor,egf) 成纤维细胞生长因子转化生长因子 -β 的功能异常与尿道 [5-6] 下裂发病相关另有研究指出 EGF 与雄激素受体 (androgen receptor,ar) 的表达存在联系, 这种联系在尿道下裂患儿中是否存在异常, 目前并不清楚本研究通过运用 EGF 和睾酮对尿道下裂尿道板成纤维细胞进行干预, 来研究 EGF 对成纤维细胞生长及其 AR 表达的影响, 探讨尿道下裂的发病机制 1 材料与方法 1.1 材料分组细胞来源通过原代培养尿道下裂尿道板组织及学龄前儿童包皮手术切除的包皮内板组织获得的成纤维细胞, 经传代纯化后使用试剂胎牛血清 DMEM 高糖培养基人重组表皮生长因子 rhegf( 金因肽 ) 购自北京鼎国生物技术有限责任公司, 睾酮购自美国 Sigma 公司, 细胞周期测定试剂盒购自美国 Beckman 公司, 大鼠抗人 AR 单克隆抗体购自英国 ABCAM 公司, 辣根标记羊抗鼠 IgG 抗体 DAB 显色试剂盒购自于北京中杉金桥生物技术有限公司,MTT 试剂盒购自于碧云天生物技术研究所实验分组该研究为福建医科大学附属第一医院小儿外科 2014 年 2 月到 2015 年 2 月采集的 12 例尿道下裂患儿及 6 例行包皮环切术的正常学龄前儿童的包皮标本, 年龄 2~5(3.5±1.07) 岁选取其中远端尿道下裂尿道板原代培养出的成纤维细胞 6 例作为中远端组, 近端尿道下裂尿道板原代培养出的成纤维细胞 6 例作为近端组, 正常学龄前儿童包皮内板原代培养出的成纤维细胞 6 例作为对照组研究过程对患儿预后不造成影响, 术前均通过医院伦理委员会审查, 均与家属沟通, 均签署知情同意书 1.2 方法细胞培养包皮组织取下后存于 PBS 中, 在 4 h 内于超净台中用组织块法接种于培养皿中待包皮成纤维细胞长满培养皿 80% 左右, 通过胰酶差异消化法及成纤维细胞快速贴壁的特点, 传代两次纯化细胞, 冻存于液氮中备用使用时, 复苏细胞, 传至第 2 代使用 MTT 法确定睾酮干预浓度及 rhegf 干预浓度取 96 孔板, 每孔加入 100 µl 细胞悬液铺板使待测细胞密度调至约个 / 孔 ( 边缘孔用灭菌 PBS 填充 ),5%CO 2,37 孵育,24 h 后细胞完全贴壁分别加入含有不同浓度 (0,3 10-9,3 10-8,3 10-7, , mol/l) 睾酮的培养基, 每组设 3 个平行孔另取 96 孔板按照上述浓度接种细胞, 然后加入含不同浓度 (10,20,40,80,160 U/mL)rhEGF 的培养基,5%CO 2,37 孵育 72 h, 每孔加入 20 µl MTT 溶

3 表皮生长因子及睾酮对尿道下裂尿道板成纤维细胞雄激素受体活化水平的影响林俊山, 等 509 液 (5 mg/ml, 即 0.5% MTT), 继续培养 4 h, 常温下终止培养, 小心吸去孔内培养液, 每孔加入 150 µl 二甲基亚砜, 置摇床上低速振荡 10 min, 使结晶物充分溶解在酶联免疫检测仪检测波长为 490 nm 处各孔的吸光度值同时设置调零孔 ( 无细胞培养基中加入 MTT 和二甲基亚砜 ) 根据增殖的水平确定使细胞内 AR 完全活化的睾酮水平及 rhegf 促进成纤维细胞增殖的最佳干预浓度, 以便后续实验的效果达到最佳 EGF 和睾酮干预于 6 孔板各孔中放置一片清洗后经高压灭菌的盖玻片, 并分别接种中远端组近端组对照组的成纤维细胞, 每孔细胞数约 10 5 个,5%CO 2,37 孵育培养 24 h 后, 根据上一步研究结果确定 3 种培养基的药物水平分别为 rhegf 40 U/mL+ 睾酮 mol/l( 生理浓度 ) 睾酮 mol/l 和睾酮 mol/l, 5% CO 2,37 孵育 72 h 免疫细胞化学取中远端组近端组对照组成纤维细胞在 3 种不同培养条件下 (rhegf 40 U/mL+ 睾酮 mol/l, 睾酮 mol/l, 睾酮 mol/l) 爬片, 用 PBS 轻轻漂洗后, 用多聚甲醛固定 20 min 于 0.1% Triton X-100( 破膜剂 ) 内浸 15 min, 再用 PBS 漂洗 5 min, 共 3 次 3% H 2 O 2 阻断内源性过氧化物酶, 室温湿盒内放置 10 min,pbs 漂洗 5 min, 共 3 次 5%~10% 山羊血清 (PBS 稀释 ) 封闭, 阻断非特异性染色位点, 室温湿盒内孵育 15~30 min 吸去血清, 勿洗, 加一抗工作液 100 µl ( 大鼠抗人 AR 单克隆抗体 ),37 湿盒内 4 过夜 PBS 漂洗 5 min, 共 3 次, 加 HRP 标记的二抗 100 µl ( 辣根标记羊抗鼠 IgG 抗体 ) 室温湿盒孵育 60 min PBS 漂洗 5 min, 共 3 次, 加 DAB( 新配 ) 显色, 室温 7 min, 再次自来水漂洗, 梯度酒精脱水, 树脂封片, 数码拍照并用已知 AR 阳性前列腺癌细胞作阳性对照, 以 PBS 代替一抗做阴性对照图像分析将所拍免疫细胞化学照片运用 IPP6.0 软件, 随机检测 400 倍显微镜下 15 个细胞的细胞核 AR 表达的 OD 值, 计算 :AR 的活化水平 = 细胞核内平均 OD 值 - 无细胞区平均背景 OD 值 1.3 统计学处理采用 SPSS13.0 统计软件进行分析, 计量资料以均数 ± 标准差 (x±s) 表示, 多组比较采用方差分析, P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 MTT 法确定睾酮及 rhegf 干预浓度在睾酮浓度分别为 ,3 10-6,3 10-7, ,3 10-9,0 mol/l 时, 对照组成纤维细胞 MTT 值分别为 0.354±0.035,0.402±+0.051,0.345±0.032, 0.353±0.039,0.363±0.041,0.338±0.030 可见处于 mol/l 睾酮浓度下, 对照组成纤维细胞生长增殖水平最高, 更高的睾酮浓度并不能进一步提高细胞的增殖水平, 因此睾酮浓度 mol/l 时其对 AR 活化水平是接近最高水平的, 以此为干预浓度之一睾酮浓度为 mol/l 是位于正常男童生理浓度范围, 以此作为另一个睾酮干预浓度在 rhegf 浓度分别为 0,10, 20, 40, 80, 160 U/mL 时, 正常包皮内板成纤维细胞 MTT 值分别为 0.447±0.039,0.471±0.057,0.505±0.042, 0.532±0.030,0.490±0.046,0.488±0.034 根据 rhegf 干预的实验结果, 通过干预药物浓度组间方差分析及两两比较, 发现 40 U/mL rhegf 组同其他浓度组相比, 能更好地刺激成纤维细胞增殖 (P<0.05) 2.2 免疫细胞化学及图像分析从免疫细胞化学照片阳性对照可以看出, 未加睾酮激活的 AR 大都位于细胞胞浆中, 加入睾酮后 AR 出现核内转移, 核内的 AR 是与睾酮结合的呈活化状态的 AR( 图 1A,1B) 成纤维细胞作为正常表达 AR 的细胞, 其核内 AR 也为活化状态 ( 图 1C,1D) A B C D 图 1 实验细胞及阳性对照细胞内 AR 的表达 ( 免疫细胞化学 DAB, 400) Figure 1 AR expression in experimental cells and positive control cells (Immunocytochemistry DAB, 400) A: Prostate cancer cells cultured without testosterone (Positive control); B: Prostate cancer cells cultured with testosterone (Positive control); C: Experimental cells cultured without testosterone; D: Experimental cells cultured with testosterone

4 510 中南大学学报 ( 医学版 ), 2016, 41(5) 在 rhegf+ 生理浓度睾酮干预后, 近端组的成纤维细胞 AR 的活化程度升高最为明显, 与其他两组比较差异有统计学意义 (P<0.001), 而对照组 AR 活化升高的水平与中远端组比较差异也有统计学意义 (P=0.02; 表 1, 图 2) 在睾酮浓度为 mol/l 时, 近端组成纤维细胞 AR 的活化程度较低, 与其他两组比较有明显差异 (P<0.001), 对照组与中远端组 AR 的活化水平差异无统计学意义 (P=0.503; 表 1, 图 2) 在睾酮浓度为 mol/l 时,3 个组 AR 活化有明显差异 (P<0.001), 对照组均数 > 中远端组均数 > 近端组均数 ( 表 1, 图 2) 表 1 免疫细胞化学尿道下裂成纤维细胞 AR 活化水平的 OD 值 (n=6,x±s) Table 1 OD values of AR activation levels in the hypospadias fibroblasts by immunocytochemical method (n=6, x±s) 组别 rhegf(40 U/mL)+ 睾酮 ( mol/l) 睾酮 ( mol/l) 睾酮 ( mol/l) 近端组 0.098±0.004** 0.041±0.001** 0.047±0.002** 中远端组 0.072±0.003* 0.047± ±0.003 对照组 0.080± ± ±0.003 与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01; 与中远端组比较, P<0.01 A B C D E F G H I 图 2 不同干预条件下成纤维细胞内 AR 表达 ( 免疫细胞化学 DAB, 400) Figure 2 AR expression in fibroblasts cultured in different situation (Immunocytochemistry DAB, 400) A: Normal child fibroblasts cultured with testosterone ( mol/l); B: Normal child fibroblasts cultured with testosterone ( mol/l); C: Normal child fibroblasts cultured with EGF (40 U/mL) and testosterone ( mol/l); D: Distal hypospadias fibroblasts cultured with testosterone ( mol/l); E: Distal hypospadias fibroblasts cultured with testosterone ( mol/l); F: Distal hypospadias fibroblasts cultured with EGF (40 U/mL) and testosterone ( mol/l); G: Proximal hypospadias fibroblasts cultured with testosterone ( mol/l); H: Proximal hypospadias fibroblasts cultured with testosterone ( mol/l); I: Proximal hypospadias fibroblasts cultured with EGF (40 U/mL) and testosterone ( mol/l)

5 表皮生长因子及睾酮对尿道下裂尿道板成纤维细胞雄激素受体活化水平的影响林俊山, 等讨论尿道下裂是一种常见的男性外生殖器发育畸形男性外生殖器是由尿生殖窦起源的, 其中男性尿道的全长, 包括阴茎头部都是由进入生殖结节生长的背侧尿道板与腹侧的尿道褶融合而形成的 [7] 在这个发育过程中, 任何组织细胞出现异常, 都有可能造成男性外生殖器发育的异常, 从而导致尿道下裂的发生男性外生殖器发育的过程离不开雄激素的作用, 雄激素会促使胚胎外生殖器原基向男性方向发育, 正由于雄激素在胚胎外生殖器男性化过程中的重要作用, 经典的尿道下裂病因学认为尿道下裂的发生是由男性外生殖器性别分化障碍导致, 雄激素的功能异常是重要的发病机制之一 [1] 男性外生殖器的组织细胞是雄激素作用的主要靶细胞之一, 其组织中 AR 的表达水平可直接影响胚胎外生殖器的发育正常条件下, 雄激素进入细胞后在胞浆中与热休克蛋白偶联的 AR 结合, 使其构象发生改变, 释放出结合了雄激素的 AR, 该配体受体复合物通过核膜进入细胞核内与 DNA 结合, 引起相关的目的基因表达, 因而细胞核内的 AR 是与 DNA 结合的活化状态的受体 [8-9] 受体的活化水平又直接影响到靶细胞靶组织的生长一旦出现活化水平的异常, 相关组织的发育也会发生异常改变本研究发现 : 在生理水平的睾酮浓度下, 近端型尿道下裂尿道板成纤维细胞 AR 活化水平与中远端型及正常对照组相比有明显下降, 同时中远端型与对照组在这一激素条件下不存在明显差异 ; 说明在生理水平的睾酮浓度下, 近端型尿道下裂患者尿道板 AR 的活化水平明显下降, 中远端型尿道下裂患者尿道板 AR 的活化水平是正常的, 提示中远端型尿道下裂的发病与 AR 活化异常不一定存在必然的联系由于 AR 与其他受体一样具有专一性可饱和性的特点, 本研究用较高浓度的睾酮使尿道板成纤维细胞的 AR 处于饱和状态, 使几乎所有的 AR 成为活化状态而移入细胞核内, 对比发现 3 组成纤维细胞的活化水平出现明显差异 ( 正常对照组 > 中远端型组 > 近端型组 ); 说明了尿道下裂患者尿道板成纤维细胞 AR 表达水平与对照组相比是存在明显差异的, 并且随着尿道下裂程度的加重,AR 的表达水平相应减少安 [10] 宇等通过实验证实先天性尿道下裂阴茎皮肤组织 AR 表达较低, 尿道板组织 AR 缺陷突出 ; 与本实验结 [11] 果接近关于 AR 对尿道下裂的作用机制,Silva 等推论尿道黏膜 AR mrna 的低水平表达可能是导致中 [12] 度尿道下裂发生的决定因素 Vottero 等研究发现尿道下裂 AR 基因甲基化比正常小儿严重, 导致 AR 表达减少而双氢睾酮和睾酮均能够显著降低 AR 基因甲基化, 从而提高 AR 的表达 EGF 分布于人类大多数组织中, 如皮肤肾前列腺男性生殖道等 EGFR 在普通细胞和肿瘤细胞的生长中发挥重要作用 [13] 在病理状态下, 如尿 [14] 道下裂患者中,el-Galley 等发现尿道缺损周围的皮肤 EGF 水平比正常包皮低, 提示 EGF 的低表达可能诱发尿道下裂本研究发现 EGF 可以很好地促进各组成纤维细胞细胞的增殖在 EGF 的作用机制的研究中, [15] Shaw 等研究发现 EGF 与其受体是通过 AR 促进中肾 [16] 管发育而 Izumi 等在对膀胱肿瘤的研究中发现, AR 能促进膀胱癌的发生及进展, 活化的 EGF 受体也能刺激膀胱肿瘤的生长 EGF 是通过调节 AR 信号促进膀胱癌的增殖但在尿道下裂尿道板中,EGF 对睾酮的作用机制尚不明了, 本研究使用 EGF 干预处于生理浓度睾酮的尿道下裂尿道板成纤维细胞, 发现 2 个实验组与对照组的 AR 活化水平均有很大程度的提高, 其中近端组的提高更为明显, 使原本在生理浓度或高浓度睾酮作用下活化低下的近端组成纤维细胞 AR 活化水平明显增强, 甚至达到正常水平 ; 提示 EGF 可能有促进 AR 表达的作用, 这需要进一步实验来证明综上所述, 本研究发现尿道下裂尿道板成纤维细胞 AR 的表达与活化均存在异常,EGF 可提升不同类型尿道下裂尿道板成纤维细胞 AR 的活化水平, 以近端型明显尿道下裂的发生可能与尿道板成纤维细胞 AR 表达数量减少, 与 EGF 和睾酮的生物学活性不足导致 AR 活化异常有关参考文献 [1] Kalfa N, Sultan C, Baskin LS, et al. Hypospadias: etiology and current research [ J]. Urol Clin North Am, 2010, 37 (2): [2] El-Galley RES, Smith E, Cohen C, et al. Epidermal growth factor (EGF) and EGF receptor in hypospadias [ J].Br J Urol, 1997, 79(1): [3] Kaartinen V, Voncken JW, Shuler C, et al. Abnormal lung development and cleft palate in mice lacking TGF-beta 3 indicates defects of epithelial-mesenchymal interaction[ J]. Nat Genet, 1995, 11(4): [4] Willingham E, Baskin LS. Candidate genes and their response to environmental agents in the etiology of hypospadias[ J]. Nat Clin Pract Urol, 2007, 4(5): [5] Leotoing L, Manin M, Monte D, et al. Crosstalk between androgen receptor and epidermal growth factor receptor-signalling pathways: a molecular switch for epithelial cell differentiation[ J]. J Mol

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戊酸雌二醇片联合宫颈注射利多卡因用于绝经后妇女取环的临床效果评价陆琴芬, 等 371 Keywords groups, no removal difficulties and failure, was statistically s 370 临床与病理杂志 J Clin Pathol Res 2015, 35(3) http://www.lcbl.net doi: 10.3978/j.issn.2095-6959.2015.03.009 View this article at: http://dx.doi.org/10.3978/j.issn.2095-6959.2015.03.009 戊酸雌二醇片联