血红蛋白的组成

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辩存仇
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1 糖尿病诊断和监测的金标准 HbA1c 沈霞上海交通大学医学院附属新华医院检验科 (200092) 根据国际糖尿病协会 (IDF) 统计,2013 年全球岁成年人的糖尿病患病率为 8.3%, 患者人数达 3.82 亿, 到 2035 年该数字将上升至 5.92 亿 [1] 我国糖尿病的发病率也正呈明显上升趋势, 由上海交通大学医学院附属瑞金医院宁光教授团队首次应用国际最新临床诊断标准在全国范围内完成口服葡萄糖耐量试验结合糖化血红蛋白 [ 即血红蛋白 A1c (Hemoglobin A1c, HbA1c) 测定以明确诊断 2 型糖尿病的调查调查数据表明,2010 年中国 18 岁及以上成人糖尿病患病率高达 11.6% 糖尿病前期率为 50.1%; 根据研究样本 [2] 估测, 我国成人中约有亿糖尿病患者及亿糖尿病前期人群长期以来, 糖尿病的诊断主要依据空腹血糖 (FPG) 和口服葡萄糖耐量试验 (OGTT), 现这种状况将面临改变由美国糖尿病协会欧洲糖尿病研究委员会及国际糖尿病协会联合组成的国际专家委员会推荐使用 HbA1c 作为糖尿病诊断的新指标 [3],HbA1c 还是 WHO 和许多国家糖尿病协会 [3 4 5] 推荐的糖尿病首选诊断标准下面浅析糖化血红蛋白及其检测方法和标准化 1 血红蛋白 (Hemoglobin,Hb) 及其变异体和糖化血红蛋白 (glycosylated hemoglobin, GHb) 定义 1.1 Hb 成人 Hb 主要由 HbA1(95%-97% 2α,2β ) 少量的 HbA2 (2.5%-3.0% 2α, 2δ ) 和 HbF(0.5%-1.0% 2α,2γ ) 组成血红蛋白 A (HbA) 是由 2 条 141 个氨基酸组成的 α A 链和 2 条 146 个氨基酸组成的 β A 链构成的四聚体 2α A2β A HbA 中约 90% 为非糖化血红蛋白 (HbA0),5%-8% 为糖化血红蛋白 (HbA1), 其中 HbA1 经色谱分析后又分为 HbA1a1, HbA11a2 HbA1b HbA1c 四种成分,HbA1c 约占 80%, 是 HbA1 的主要成分 1.2 Hb 变异体 20 世纪 60 年代,Rahbar 在筛查人群中可能存在的异常血红蛋白时发现, 糖尿病患者体内存在电泳速度非常快的血红蛋白成分, 并被认为是一种异常的血红蛋白次年,Rahbar 研究小组证实这种异常血红蛋白在结构上与 HbA1c 相同随后不断的研究, 报道 Hb 变异体有数百种, 大多数起源于 Hb 的 α β γ δ 链的点突变临床最常见的 Hb 变异体是 Hb F Hb S 和 HbC [6] HbF 是胚胎时期的 Hb 由 2 条 α 链和 2 条 γ 链组成出生时,70% 的 Hb 是 Hb F,6 个月后降到 5% 以下遗传性 Hb F 持续存在的个体体内其浓度可达到总 Hb 的 30%, 而 β 地中海贫血和镰状细胞病患者体内 Hb F 的浓度占总 Hb 的 2%-20% 不等 Hb S 变异体有明显的地区种族差异在美国 Hb S 是最常见的 Hb 变异体, 尤其在纯合子镰状细胞病患者体内, 有三分之一可检测出 Hb S HbCS (constant spring, 简称 Hb CS) 是一种 α 链异常的血红蛋白, 较正常的 α 链 (141 个氨基酸 ) 多了 31 个氨基酸, 共 172 个氨基酸原因在于 α 基因的终止密码突变为有意义的密码子而形成的异常血红蛋白, 由于突变使 α 链合成延缓, 引起 α 珠蛋白合成障碍 [7] 性贫血该病在东南亚和中国南方均有发现广西壮族自治区人民医院检验科报道了毛 [8] 细管电泳在 Hb CS-H 病中的诊断价值 1.3 GHb 定义 GHb 是葡萄糖对血红蛋白 HbA 的非遗传修饰, 是人体血液中葡萄糖与血红蛋白链上的游离氨基酸之间非酶促糖化作用的产物血红蛋白链上有多个游离氨基酸, 其中 β 链 N- 末端的缬氨酸氨基暴露于葡萄糖的程度最高, 他们以共价键结合形成稳定的复合物, 其糖化产物是 GHb 的主要成分, 称血红蛋白 A1c (HbA1c) [5 9 10] 未经控制的糖尿病患者的特点就在于血液中葡萄糖浓度太高, 多余的葡萄糖糖化血液中的血红蛋白, 形成 HbA1c 2 HbA1c 形成过程葡萄糖进入红细胞后与血红蛋白 HbA 的 β 链 N 末端颉氨酸残基缩合, 先形成一种不稳定的 Schiff 碱 ( 醛亚胺结构 ), 即前 HbA1c, 再解离或经 Amodori 分子重排后形成 HbA1c ( 醛酮结构 ), 此反应的过程是缓慢和不可逆的, 并且由于红细胞内没有分解醛酮的酶, 因此 HbA1c 的形成过程存在于红细胞 120d 的整个生命周期中,HbA1c 的形成速度与 1

2 红细胞内葡萄糖浓度有关, 而与胰岛素水平无关所以,HbA1c 水平只与红细胞寿命和该时期体内血糖的平均浓度有关, 不受运动和饮食的影响, 能反映过去 8-12 周的平均血糖浓度, 是目前国际上公认的用于评估糖尿病患者长期血糖状况的理想指标 3 HbA1 c 测定方法到目前为止, 有超过 30 种不同的方法用于定量检测 HbA1 c [ ], 其中常用的检测方法及其性能如下 3.1 离子交换层析法基于电荷差异进行分析葡萄糖与血红蛋白的 β 链末端 Val 连接降低了等电点, 导致 HbA1c 带的正电荷比未糖化血红蛋白的少, 与树脂的附着力小可以分别用不同离子浓度的缓冲液在不同的时间将血红蛋白从阳离子交换柱中洗脱下来, 再根据每个峰值下的面积来计算 HbA1c 占总血红蛋白的比例该方法中血红蛋白变异体会随 HbA1c 一起被洗脱下来, 影响 HbA1c 值 3.2 亲和层析法基于糖化与非糖化血红蛋白结构不同, 凡是糖基化的血红蛋白均可以与硼酸盐结合形成可逆的复合物, 未糖化血红蛋白先被洗脱后, 再用山梨醇分离复合物, 并将全部糖化血红蛋白洗脱出来, 检测结果是总糖化血红蛋白, 通过换算得出 HbA1c 的量该法对于变异血红蛋白和病理血红蛋白的影响相对其它方法不敏感, 易造成检测结果的不准确 [ 免疫法采用单克隆抗体特异识别 GHb β 链 N 末端最后 4-6 个氨基酸组成的抗原表位, 在自动生化分析仪上利用抗原抗体反应的原理进行免疫比浊测定以糖化蛋白为标准, 测定 HbA1c 的含量, 再测定 Hb 的含量, 最后计算出 HbA1c 占总 Hb 的百分数该方法具有良好的精密度及其与其他方法良好的相关性但当血红蛋白发生第 6 位氨基酸变异 (Hb S 和 HbC) 时将不会被识别又因各厂家产品的单抗针对的抗原决定族不同亲 12 和力不同等因素将影响检测结果的可比性 3.4 均相酶法其原理是在蛋白酶的作用下, 切断 HbA1c 的 β 链 N 末端的糖化二肽在果糖基肽氧化酶的作用下生成过氧化氢, 在过氧化氢的存在下与显色剂产生显色反应, 通过测定吸光度值求出 HbA1c 的百分浓度此法是近几年才推出的如同临床生化反应一样快速均一的反应体系该方法精密度好, 与 HPLC 和免疫法有良好相关性但其缺点是也 [14] 不能识别 Hb 变异体 3.5 毛细管电泳法由法国 Sebia 公司推出了 CAPILLARYS 2 FLEX-PIERCING 毛细管电泳分析仪, 其检测原理是利用不同蛋白分子在 ph9.4 的缓冲条件下, 仪器自动溶血, 通过毛细管的阳极端吸入进样, 然后在高电压条件下, 中电渗流和电场力的作用下的泳动速率不同而进行蛋白质分离, 属液相电泳并在毛细管阴极端以波长 415nm 直接检测血红蛋白 (415nm 是血红蛋白特有的吸收峰, 可以准确地对 HbA1c 以及其它血红蛋白进行定量 ) 在使用碱性缓冲液条件下, 正常和异常 ( 或变异体 ) 血红蛋白按下列顺序检测出来, 从阴极到阳极依次为 A2 C E S D F A0 其它 Hb 以及 HbA1c 距阴极端最近的是含糖量最少的 HbA1a 和 HbA1b, 中间的是 HbA1c, 距阳极端最近的是 Hb 的主要成分, 未糖化的 HbA0 和糖化的 HbA2 同时它对 HbA2 的定量检测又可用于 β 地中海贫血的筛查该方法是已通过国际临床化学联合会 (International Federration of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, IFCC) 和美国糖化血红蛋白标准化计划组织 (National Glycohemoglobin [ ] Standardization Program, NGSP 认证的 HbA1c 检测方法 3.6 即时检验 (point-of care testing,poct) 国内目前使用较多的有 2 种方法 : 一种是利用硼酸亲和原理在颜色反射机上进行 HbA1c 的快速检测 ; 另一种是基于免疫反应原理在荧光分光光度仪上检测含 HbA1c 的荧光染料分子的斑点数, 换算成 HbA1c 的百分浓度 POCT 检测 HbA1c 具有便携快速等优点但相当一部分 POCT 方法其精密度不能满足 [18] 临床要求, 且对样品中 Hb 含量有较大限制 2

3 4 HbA1c 的检测结果报告和临界值 HbA1c 检测结果将在全球范围内标准化, 实验室的结果报告应以 NGSP 的传统单位 (%HbA1c) 报告, 并同时报告 IFCC 的国际单位 (mmol/mol), 再用 NGSP 单位换算公式进行 [5 13] 换算后报告结果 NGSP 单位换算公式如下 :NGSP-HbA1c = (IFCC-HbA1c) +2.15% [3] 2009 年国际专家委员会一致同意推荐使用 HbA1c 诊断糖尿病, 并发布了工作报告 2010 年美国糖尿病学会 (American Diabetes Association,ADA) 对国际专家委员会的建议给予充分肯定, 并正式确定将 HbA1c 作为糖尿病诊断的标准之一, 临界值定为 > 6.5%, 水平在 5.7%-6.4% 的患者归为糖尿病高危人群 2011 年,WHO 正式推荐以 HbA1c> 6.5% [4 作为糖尿病诊断的切入点 10] 5. HbA1c 检测的标准化和质量管理不同实验室间的检测结果可因所用的原理方法学不同, 所测组份 (HbA1 或 HbA1c) 有差异, 再加上 Hb 变异体 (Hb S HbC HbE 和 HbF) 的影响, 使实验结果的准确性重复性甚至样品的稳定性均有所影响, 导致各实验室之间结果有较大差异, 更谈不上可比性和溯源性 [19] 由于 HbA1c 测定的准确性直接关系到糖尿病患者的临床诊断和疗效评估, 为此, 对 HbA1c 检测的标准化和质量管理已受全球关注 5.1 HbA1c 检测的国际标准化和质量管理 1993 年, 美国临床化学协会 (American Association Clinical Chemistry, AACC) 建立的 NGSP 通过参考实验室网络的样本比对来降低室间差异, 要求检测实验室应参加能力比对试验实验室采用可溯源到糖尿病控制与合并症试验 (Diabetes Control and Complication Trial, DCCT) 参考物的方法, 使报告的结果都能溯源到 DCCT 的结果 1995 年,IFCC 成立了 HbA1c 标准化工作组, 旨在研究 [8 13] 一个可供追溯的参照系统, 研发 HbA1c 参考物质和参考方法, 该工作组历时 5 年的探索, 经过多家实验室的努力, 于 2002 年推出了一套 HbA1c 参考方法, 即将待测标本溶血后经胞内蛋白酶酶解, 然后应用高效液相色谱串联电喷雾质谱仪或高效液相色谱串联毛细管电泳仪, 利用信号比例计算出糖基化的 β 链 N 末端六肽片段的比例, 从而得出 HbA1c 在样本中所占的百分比, 是检测 HbA1c 分子浓度的新方法,IFCC 推荐的参考方法较 NGSP 参考方法特异性强, 该方法已经由包括欧洲日本和美国在内的 11 家 IFCC 参考实验室验证 [11] 2011 年, 美国生化科学院发布 HbA1c 检测在糖尿病诊断和管理中的应用与建议中指出,HbA1c 的室内 CV< 2%, 室间 CV< 3.5%, 并至少需要做 2 个水平的质控品 5.2 我国 HbA1c 检测的标准化和质量管理国内各实验室采用的 HbA1c 检测试剂多达 60 余种, 甚至很多实验室仍采用非标准化的方法, 缺乏相关的参考实验室网络及正确性 [11] 验证的途径, 检测结果的可比性不容乐观, 全国范围内的标准化面临严重挑战 2010 年卫生部临检中心 HbA1c 室间质评不同仪器组内 CV 为 4.54%-21.03% [20] 年北京市临检中心 HbA1c 室间质评的结果显示, 相同仪器组内 CV 基本在 4% 以下, 虽显示了很好的精密度, 但是不同仪器组内 CV 仍高达 15.8%, 检测结果的可比性差, 无法达到 HbA1c 检测结果的互认 [20] 于 2010 年 3 月中国 HbA1c 教育计划在北京启动, 该计划是国内首次由内分泌和检验界专家共同参与的大型学术活动, 旨在提高 HbA1c 检测的标准化, 以及在糖尿病管理中的地位, 以加强临床医师对 HbA1c 的认识和重视 [20] 上海临检中心采用 IFCC HbA1c 一级参考方法, 于 2010 年完善并获候选参考实验室资格,2011 年考核合格,2011 年 11 月 1 日正式成为包括欧美日 12 家实验室之后的第 13 家运行一级参考方法的参考实验室网络中 [18] 的一员, 为中国 HbA1c 标准化工作走上一个新的台阶 HbA1c 因其在体内存在时间长, 水平较稳定, 不受饮食或运动影响的特点, 已逐渐成为新的糖尿病诊断和监测指标目前由卫生部临检中心国家食品药品监督管理总局医疗器械检验所和糖尿病学专家根据我国 HbA1c 检测现状, 结合国内外相关研究进展, 共同制 [ 5 ] 定糖化血红蛋白实验室检测指南, 于 2011 年经卫生部组织专家讨论并已通过然而, 3

4 HbA1c 测定标准化工作在我国还处于起步阶段, 任重而道远希望通过我国糖化血红蛋白实验室检测指南的出台和贯彻落实, 推动 HbA1c 检测标准化和质量管理更加深入开展, 使 HbA1c 定量检测的实验报告能达到结果互认, 能真正成为糖尿病诊断和监测的金标准参考文献 : 1. IDF Diabetes Atlas (2014, sixth edition): 2. Xu Y, Wang L, He J, et al. Prevalence and control of diabetes in Chinese adults. JAMA. 2013, 310(9): International Expert Committee. International Expert Committee report en the role of the A1c assay in the diagnosis of diabetes. Diabetes Care. 2009,32: World Health Organization. Use of glycated haemoglobin (HbA1c) in the diagnosis of diabetes mellitus: abbreviated report of a WHO consultation, Geneva:WHO, 2011: 糖化血红蛋白实验室检测指南中国糖尿病杂志,2013,21: Rahbar S. An abnormal hemoglobin in red cells of diabetics. Clin Chem Acta : Weykamp CW, Penders TJ, Muskiet FAJ et al, Influence of hemoglobin variants and delivatives on glycohemoglobin determinations as investigated by 102 laboratories using 16 methods. 1993,Clin Chem 39: 李友琼, 覃桂芳, 阳文辉, 等毛细管电泳检测血红蛋白 Constant Spring [J]. 临床检验杂志,2012,30(1): IFCC. Recommendation for term and measuement unit for HbA1c. Clin Chem Lab Med,2007,45: Hanas R, John G, International HbA1c Consensus Committee Consensus statement on the worldwide standardization of the hemoglobin A1c Measurement. Clin Chem Lab Med, 2010,48(6): 王冬环, 张传宝, 陈文祥, 等应重视糖化血红蛋白测定技术及量值溯源中华检验医学杂志,2008,31: P Gillery, M Delpech, I Garcia et al,evaluation des méthodes de dosage de L hémoglobine glyque: méthode et paramétre de référence. Ann Biol Clin ( 1995) 53, Cas Weykamp, W.Garry John, Andrea Mosca, A Review of the Challenge in Measuring Hemoglobin A1c [J] Diabetes Science and Tehnology 2009,May Vol 3 (3) 14. Liu L, Hood S, Wang Y, et al. Direct enzymatic assay for % HbA1c in human whole blood samples [J]. Clin Biochem, 2008, 41(7-8): Jeppsson JO, Kobold U, Barr J, et al Approved IFCC reference method for the mesurement of HbA1c in human blood. Clin Chem Lab Med,2002,40:

5 16. Jaisson S, Leroy N, Meurice J, et al. First evaluation of Capillarys 2 Flex Piercing (Sebia) as a new analyzer for HbA1c assay by capillary electrophoresis [J]. Clin Chem Lab Med, 2012,50(10): Cas Weykamp, Helene Waenink-Wieggers,Erwin Kemna et al, HbA1c: performance of the Sebia Capillarys 2 Flex Piercing. Clin Chem Lab Med, 2013; 51(6):e129- e 居漪, 糖化血红蛋白检测技术和质量管理检验医学, 2010,25: 田京, 高洪伟, 洪天配, 从临床视角谈糖化血红蛋白检测的重要性及其结果判读中华检验医学杂志,2012,35: 宋智心, 徐国宾, 马怀安等, 糖化血红蛋白测定的标准化现状中华检验医学杂志,2012,35:

材料方法

材料方法生物技术通报姜燕采用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体和胶体金标记鼠抗人血红蛋白单克隆抗体及对照抗体羊抗鼠利用双抗体免疫夹心反应原理特异性地结合人血红蛋白抗原在内可得到胶体金显色结果的原理研制便潜血单克隆一步法胶体金检测试卡用于诊断因各种原因引起的消化道出血疾病应用杂交瘤技术制备两株鼠抗人血红蛋白抗体方法检测效价免疫胶体金技术制备胶体金检测试卡法检测效价的结果显示鼠抗人