为本研究的参考仪器, 来自美国 Bio-Rad 公司, 配套试剂批号 : 正确度验证所用的低值和高值质控品 ( 批号 :33821), 为美国家 Bio-Rad 公司提供 1.2 标本来源 51 例标本来自 2013 年 8 月北京协和医院门诊患者, 均经 VariantⅡ 全自动糖

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勋植宋
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1 临床检验亲和层析高效液相法检测糖化血红蛋白的性能验证陈雨, 杜娟, 胡莹莹, 齐志宏, 张辉, 崔巍中国医学科学院北京协和医院检验科, 北京摘要 : 目的验证亲和层析高效液相法检测糖化血红蛋白的性能方法参考美国临床实验室标准化协会 (CLSI) EP5 EP6 EP9 文件对亲和层析高效液相法糖化血红蛋白分析仪的正确度不精密度检测范围携带污染率方法学比对和干扰性进行验证结果正确度与靶值接近不精密度分别为 0.82%,0.72% 和 0.79% 糖化血红蛋白浓度在 5.2% ~18.8% 区间, 线性相关良好 (r 2 =0.999) 检测浓度在 4.9% ~15% 区间, 携带污染率为 0.12 全血和稀释模式数据最大偏差为 0.1 PremierHb9210 与 VariantⅡ 仪器比对 :r 2 =0.996, 线性回归分析方程 y=1.0001x-0.003,t 检验 (n=40),t=0,p=1.43 干扰试验中含变异血红蛋白的标本, 亲和层析高效液相法结果与血糖结果相关性 :HbJ 组,r =0.93;HbF 组,r=0.83, 离子交换高效液相法与血糖相关性 :HbJ 组,r=0.024;HbF 组,r=0 结论亲和层析高效液相法设备各项性能参数符合 CLSI 文件要求, 适用于临床检测关键词 : 糖化血红蛋白 ; 亲和层析高效液相法 ; 性能验证中图分类号 : 文献标识码 :A 文章编号 : (2014) PerformanceverificationofafinitychromatographyHPLCinHbA1cdetection CHENYu,DUJuan,HUYing-ying,QIZhi-hong,ZHANGHui,CUIWei DepartmentofLaboratoryMedicine,PekingUnionMedicalColegeHospital, ChineseAcademyofMedicalScience,Beijing100730,China Abstract:Objective ToverifytheanalyticalperformanceofafinitychromatographyHPLCinhaemoglobinA1c(HbA1c)de tection.methods Theaccuracy,imprecision,detectionrange,contaminationcaryoverrate,methodologycomparisonandin terferenceofafinitychromatographyhplcwereverifiedreferingtotheclsievaluationprotocolsep5,ep6andep9.results Accuracytestresultswerealwithintherangeofqualitycontrols,andclosetothetargetvalues.Imprecisionresultsatthree diferentlevelswere0.82%,0.72% and0.79%,respectively,whichmettherequirement(lesthan1%).thehba1c showedgoodlinearcorelationintheconcentrationrangeof5.2% ~18.8%(y=1.003x-0.125,r=0.995).Thecaryover valuewas0.12whenhba1cconcentrationintherangeof4.9% ~15%,thecroscontaminationbetweensamplescanbeig nored.manualdilutionevaluationtestresultsshowedthatthemaximumdeviationbetweenwholebloodanddilutionmodewas0. 1.PremierHb9210andVariantⅡwereingoodcorelation,withthelinearregresionequationy=1.0001x-0.003,r= Pairedt-testdataofthetwogroups(n=40)showedtherewasnosignificantstatisticaldiference(t=0,P=1.43).Ininter ferencetest,theresultsofafinitychromatographyhplcmethod(premierhb9210)hadgoodcorelationwiththebloodglucose (grouphbj,r=0.927;grouphbf,r=0.827),andtheresultsofvariantⅡ hadpoorcorelationwiththebloodglucose (grouphbj,r=0.024;grouphbf,r=0).conclusion TheHbA1cdetectionbyafinitychromatographyHPLCmethodisin linewiththerequirementsofclsi,applicabletoroutineclinicaltesting. KeyWords:HbA1c;AfinitychromatographyHPLC;Performanceverification 糖化血红蛋白 (HbA1c) 是红细胞中血红蛋白与葡萄糖持续且不可逆地进行非酶促蛋白糖基化反应的产物, 其寿命与红细胞的寿命一致人体内红细胞的寿命一般为 120d, 在红细胞死亡前, 血液中 HbA1c 含量相对保持恒定 HbA1c 水平反映的是在检测前 120d 内机体的平均血糖水平, 不受标本采集时间是否空腹是否使用胰岛素等因素影响, 是判定糖尿病患者血糖长期控制情况的良好指标 [1] 本研究评价作者简介 : 陈雨 (1970-), 女, 大专, 主管技师, 主要从事临床基础检验及内分泌学研究通讯作者 : 崔巍, cuiw@pumch.cn 了亲和层析高效液相法检测 HbA1c 的性能, 以期验证该方法是否适用于临床应用 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂仪器 A 及配套试剂 ( 性能验证用 ):PrimusPremierHb9210 全自动糖化血红蛋白分析仪 ( 亲和层析高效液相原理,CV<2%), 为本研究的测试仪器, 来自英国 TrinityBiotech 公司, 配套试剂 A( 批号 :3816), 试剂 B( 批号 :4278),DIL( 批号 : 4211) 仪器 B 及配套试剂 :VariantⅡ 全自动糖化血红蛋白分析仪 ( 离子交换高效液相原理,CV<2%),

2 为本研究的参考仪器, 来自美国 Bio-Rad 公司, 配套试剂批号 : 正确度验证所用的低值和高值质控品 ( 批号 :33821), 为美国家 Bio-Rad 公司提供 1.2 标本来源 51 例标本来自 2013 年 8 月北京协和医院门诊患者, 均经 VariantⅡ 全自动糖化血红蛋白分析仪首先测定了 HbA1c 浓度其中,30 例的 HbA1c 在 4% ~6% 之间,20 例的 HbA1c 在 6% ~15% 之间,1 例的结果 >15% 者, 用于正确度精密度携带污染和方法学比对研究 1 例 HbA1c 为 18.9% 的标本来自北京大学人民医院, 用于线性验证 20 例变异血红蛋白阳性的标本来自北京协和医院门诊, 其中 HbF 阳性的标本共 10 例, 浓度为 65% ~80%;HbJ 阳性的标本共 10 例, 浓度为 25% ~53%, 用于干扰性验证上述所有标本均为常规检测的剩余标本, 本研究不采集与患者隐私相关的任何医疗信息 1.3 方法严格按照校准程序进行仪器校准, 方法评价期间每日测定 2 个水平定值质控品, 判断是否在控根据美国临床实验室标准化协会 (CLSI)EP5 EP6 EP9 文件制定实验方案正确度验证对于验证仪器 PremierHb9210, 使用伯乐厂家赋值的低值质控品和高值质控品, 每个水平的质控分别测定 6 次, 计算测定均值与赋值的百分偏倚要求每次测量的结果均应在质控要求的可信范围内精密度评价根据 EP5-A2 文件, 对高中低 3 个浓度水平的 HbA1c 标本, 每天检测同一浓度 2 份标本, 分 2 批检测, 每天得到 4 个测定值, 连续测定 20d 对每个浓度水平独立进行精密度评价, 计算平均值标准差和 CV 值要求各浓度水平标本的 CV% 值均应 2% 分析测量范围评估根据 EP6-P2 文件, 将接近分析仪检测上限的高值样本和检测下限的低值样本混合成 5 个不同浓度的标本, 浓度分别为 100% 低值,75% 低值 +25% 高值,50% 低值 +50% 高值, 25% 低值 +75% 高值,100% 高值混合均匀后将各个浓度的标本分别测定 2 次, 取其均值, 采用直线回归方程进行数据分析, 直线回归方程,y=bx+a 要求 r 携带污染率评估取 HbA1c 低值标本 (5. 0% 左右 )11 例, 及高值标本 (>15%)10 例, 按照 L1, L2,L3,H1,H2,L4,H3,H4,L5,L6,L7,L8,H5,H6, L9,H7,H8,L10,H9,H10,L11 顺序检测标本, 计算每个水平的 CV% 值, 高 - 低标本的 SD 值和低 - 低标本 SD 值要求 :(1) 每个水平的 CV% 值计算要低于 2%;(2) 高 - 低标本的 SD 值 3 倍的低 - 低标本 SD 值 ;(3) 携带污染率 = 高 - 低标本检测平均值 - 低 - 低标本检测平均值, 要求携带污染率 <3 倍的低 - 低标本 SD 值手工稀释验证取 10 例抗凝血标本, 采用如下两种模式进行操作 :(1) 全血模式 : 原采血管上机检测, 记录结果 (2) 稀释模式 : 同样 10 例血标本, 采用稀释模式进行检测, 记录结果以全血模式检测结果为基础值 A, 以 A±7%A 计算参考范围, 对比两种模式实验结果差异要求稀释模式的在此参考范围为符合比对实验 PremierHb9210 作为实验仪器和实验方法,VariantⅡ 作为基准仪器和比对方法根据 NCCLEP9-A2 要求, 取 50 例 HbA1c 水平不同的临床标本, 其中 20 例的 HbA1c 范围 >6% 每天检测 10 例标本, 按照的标本顺序, 分别在 PremierHb9210 和 VariantⅡ 上进行检测, 持续 5d 利用所有样本双份测定的有效数据, 计算两个方法的线性回归方程,y= a+bx, 要求 r 0.975,b 接近 1,a 足够小干扰性研究取 HbF 和 HbJ 增高的标本, 分别使用两种方法进行检测, 数据分析方法 :(1) 对两组数据进行配对 t 检验分析, 评估两数据差异有无显著差异,P<0.05 表示两种方法的检测结果之间的差异有统计学意义 (2) 分析检测结果与血糖结果进行相关性分析,r>0.800 为检测结果与血糖有良好的相关性 1.4 统计学处理应用 Microsoft2003 及 SPSS11.5 软件进行统计学分析两样本均数比较, 采用配对样本 t 检验,P<0.05 表示两种方法的检测结果之间的差异有统计学意义 ; 相关性分析采用 Pearson 相关分析, 计算相关系数 r 值, 判断 P 值 :r 0.300, 为不存在线性相关 ;0.300<r 为低度线性相关 ;0.500 <r 为显著线性相关 ;r>0.800 为高度线性相关 ;P>0.05 为两变量无相关,P<0.05 为两变量相关 ; 线性回归采用简单线性回归分析计量资料以均数 ± 标准差 ( 珋 x±s) 表示 2 结果 2.1 正确度评估低值质控样本范围为 5. 4% ±0.08%, 在质控靶值和范围 5.6%(5.0% ~6. 2%) 内高值质控样本范围 9.8% ±0.05%, 在质控靶值和范围 9.8% (8.6% ~11.0%) 内提示, 结果符合正确度评估的要求 2.2 精密度验证对于高中低 3 个不同水平的 HbA1c 标本, 检测结果见表 1, 珋 x±s 分别为 4.9% ±0. 04% 8.3% ±0.06% 和 12.6% ±0.1%;CV% 分别为 0.82% 0.72% 和 0.79%, 均符合要求

3 表 1 高中低 3 个水平的 HbA1c 重复性测定结果序号 HbA1c 低值 (%) HbA1c 中值 (%) HbA1c 高值 (%) 分析测量范围评估 2 次分析测量范围实验的结果见表 2, 检测相关性 r 均为 0.995>0.975, 符合线性要求构成因素表 2 HbA1c 两次分析测量范围实验结果 (%) 第一次检测第二次检测平均值 100% 低 % 低 + 25% 高 % 低 + 50% 高 % 低 + 75% 高 % 高携带污染率评估低值为 4.9% 的 HbA1c 标本和高值为 15.0% 的 HbA1c 标本, 其 CV% 值分别为 1. 4% 和 0.6%, 低于 2%; 高 - 低标本的 SD 值为 0, 低 - 低标本 SD 值为 0.045; 携带污染率为 0.12, 携带污染率小于 3 倍低 - 低标本 SD 值 (0.134)( 表 3) 所有结果均符合要求表 3 HbA1c 携带污染率结果标本 HbA1c 测定结果 (%) 低值 - 低值 (%) 高值 - 低值 (%) L1 4.8 L L H H L4 5 5 H3 15 H L5 5 5 L L L H5 15 H L9 5 5 H7 15 H L H H L 平均值 SD CV 手工稀释验证全血模式和稀释模式测定的 HbA1c 结果之间的差值绝对值在 0~0.1 之间 ( 表 4), 符合结果要求序号表 4 全血模式和稀释模式测定的 HbA1c 结果 (n=10) 全血模式测定值 (%) 手工稀释模式测定值 (%) 差值绝对值 (%) 方法对比研究分别使用 PremierHb9210 和 VariantⅡ 测定 50 例 HbA1c 标本, 结果分别为 6.84± 2.03 和 6.80±2.04; 两组数据进行配对标本 t 检验,t =0, 小于 t 39 (2.023),P=1.43, 提示两组数据无统计学显著差异 ; 两种方法的线性回归分析方程为 :y= x-0.003,r=0.998, 提示二者相关性良好

4 2.7 干扰性研究对于 HbJ 变异血红蛋白干扰组, 血糖测定值为 4.89mmol/L±0.24mmol/L, 其中 PremierHb9210 测定的 HbA1c 结果为 4.90% ±0. 40%,VariantⅡ 测定的 HbA1c 结果为 6.82% ±2. 56%, 配对样本均数 t 检验结果显示,t=4.435, t 0.05(9) =2.262,P<0.05; 对于 HbF 变异血红蛋白干扰组, 血糖测定值为 4.76mmol/L±0.49mmol/L, 其中 PremierHb9210 测定的 HbA1c 结果为 3.92% ±0. 26%,VariantⅡ 测定的 HbA1c 结果为 0, 配对样本均数 t 检验结果显示,t=37.560,t ) =2.262,P<0. 05( 表 5) 对于 HbJ 组,PremierHb9210 和 VariantⅡ 检测结果与血糖的相关系数 r 值分别为和 0.024; 对于 HbF 组, 相关系数 r 值分别为和 0 异常血红蛋白类型表 5 HbJ 和 HbF 干扰性研究的检测结果 (n=20) GLU (mmol/l) 亲和层析法 HbA1c(%) 高效液相法 HbA1c(%) HbJ HbJ HbJ HbJ HbJ HbJ HbJ HbJ HbJ HbJ HbF HbF HbF HbF HbF HbF HbF HbF HbF HbF 讨论 1977 年年, 英国 23 个临床中心在对例 2 型糖尿病患者开展的前瞻性糖尿病研究 (UKPDS) 发现,HbA1c 水平仅降低 1%, 就可使糖尿病相关并发症发生的风险降低 21%, 相关死亡降低 25%, 患者总死亡率降低 17%; 患者心肌梗死的风险降低 18%, 脑卒中风险降低 15%, 眼和肾继发性疾病的风险降低 35% 在 HbA1c 超过 6.2% 时, 视网膜病变的发生率明显增高当 HbA1c 超过 8% 以后才出现糖尿病肾病发生危险性明显增高与神经病变相关的 HbA1c 切点可能会更低多项研究证明 :HbA1c 与糖尿病并发症密切相关所以, 在 2002 年, 美国糖尿病学会 (ADA) 将 HbA1c 定义为糖尿病病人血糖监控的金标准,HbA1c<7% 时, 一般可采用饮食和运动疗法 HbA1c>7% 时, 不管 OGTT 的诊断是糖耐量减退还是糖尿病, 均需要药物治疗 HbA1c 在糖尿病监控上的作用很明显, 那么它能否用于糖尿病的筛查和诊断呢? 经过专家们多年的研究证明,HbA1c 作为糖尿病的诊断指标有诸多优点 : 更好的反映长期血糖水平和慢性并发症风险生物变异性较小 ; 分析前的不稳定性较小 ; 无需空腹或特定时间取血 ; 相对来讲不受急性 ( 如应激疾病相关 ) 的血糖波动的影响 ; 目前用于指导糖尿病的管理和治疗方案的调整所以, 在 2010 年 ADA 将 HbA1c 纳入糖尿病筛查和诊断指标, 切点是 6.5% 基于 HbA1c 检测在糖尿病的管理中的重要性, 实验室在引入一项新技术或新设备时必须要了解该新方法或新仪器的性能特点 PremierHb9210 采用亲和层析高效液相技术, 原理为葡萄糖和血红蛋白稳定结合都会产生 cis-diol 官能基, 能与硼酸盐特异性结合, 利用管柱层析法, 来分析所有被糖化的血红蛋白, 亲和层析法特异性强 [2] 本文从以下几个方面对该仪器进行了评价正确度验证结果显示, 两个水平的质控样本检测 6 次, 结果均在控精密度验证结果显示,3 个不同水平的 HbA1c 标本检测的 CV 值均 <1%, 符合临床和实验室的要求在 5.2% ~18.8% 之间, 有着良好的线性梯度, 尽管试剂说明书中标明该仪器在 0% ~33. 1% 之间均具有良好的线性, 但在评估此仪器时, 临床所能找到的最高浓度的 HbA1c 标本的测定值为 18. 8%, 因此, 针对这一标本进行了对该仪器的线性验证本次采用 4.9% 和 15.0% 两个标本进行携带污染率的评估, 携带污染率的结果为 0.12, 符合要求, 在临床上,15% 的高值标本的比例相对较少, 所以本次实验可以证明该仪器对于样本间的交叉污染的比率很低, 满足实验的要求手工稀释实验结果显示, 全血和稀释血之间的差异仅仅为 0.1, 这提示该仪器的全血模式和稀释模式均可以很好的满足实验需要在方法比对研究中,PremierHb9210 作为亲和层析高效液相方法学的新仪器, 与本研究的参比仪器 Variant Ⅱ( 离子交换高效液相法 ) 的检测结果有着良好的相关性, 检测结果非常接近异常血红蛋白有可能是干扰 HbA1c 测定的主要因素, 实验结果表明, 当血液中存在变异血红蛋白时, 亲和层析高效液相法与离子交换高效相比, 前者更具有方法学上测定优势, 变异血红蛋白的干扰甚小, 其 HbA1c 的检测结果与血糖之间有着良好的相关性, 这与文献报告的结果一致 [3-6]

5 综上所述, 全自动糖化血红蛋白分析仪 Premier Hb9210 的正确度和精密度高交叉污染小 ( 相邻极高的糖化标本时 ), 且具有良好的线性此外, 有高效液相结果图实时监测软件支持, 可自动检查仪器的状态和结果的可靠性, 适合于临床常规检测 HbA1c 参考文献 [1] 中华医学会糖尿病学分会. 中国 2 型糖尿病防治指南 [M].2010 年版. 北京 : 北京大学医学出版社,2011:1. [2] 王虹, 高颖, 纪立农.PrimusUhra2 亲和层析 HPLC 系统在糖化血红蛋白检测上的临床应用 [J]. 中国医学检验杂志,2006,7(3): [3] LinCN,EmeryTJ,LitleRR.EfectsofhemoglobinC,D,E,and StraitsonmeasurementsofHbA1cbysixmethods[J].ClinChim Acta,2012,413(7-8): [4] LeeSC,WangLH,TsaiSM,etal.EfectsoftheHbE,HbHand HbG-TaichungvariantsonHbA1cvaluesbytheBio-Radvariant Iturboanalyzer[J].ClinBiochem,2011,44(16): [5] 谢荣荣, 潘素芳, 于湄. 离子交换 HPLC 法和亲和层析 HPLC 法检测糖化血红蛋白结果的比较和分析 [J]. 中国实验诊断学,2009, 13(3): [6] LeeST,WeykampCW,LeeYW,etal.Efectsof7hemoglobinva riantsonthemeasurementofglycohemoglobinby14analyticalmeth ods[j].clinchem,2007,53(12): 收稿日期 :

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中华医学会肝病学分会中华医学会感染病学分会 Ó Ñ Ñ Ñ Ñ Ò Ò Ò Ó Ó Ò Ó Ñ Ò Ò Ó Ò Ò Ñ Ò Ñ Ñ Ò Ò Ñ Ñ Ñ Ò Ó Ò Ò Ñ Ó Ò Ò Ó Ó Ñ Ó Ó Ó Ò Ò Ó Ò Ó Ó Ò Ò Ò Ñ Ó Ò Ñ Ò Ò Ñ Ò Ò Ò Ó Ò Ô 中华医学会肝病学分会中华医学会感染病分会慢性乙型肝炎防治指南年更新版中华实验和临床感染病杂志