恶性肿瘤多药耐药标记和临床意义耐药标记作用机制阳性定位主要耐药药物 P 糖蛋白 (P-Gp) 药泵作用胞膜胞浆长春花碱阿霉素谷胱甘肽 S 转移酶解毒作用胞浆顺铂等拓扑异构酶 II 靶点作用胞核 VP16 等 Bcl - 2 抗凋亡作用胞浆多数抗癌药物免疫组织化学技术的全过程抗原提取和纯化

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妣答碧鲁
5 years ago
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1 免疫组织化学 Immunohistochemistry 概述定义标记物分为荧光素荧光免疫技术酶免疫酶技术高电子密度标记物 ---- 免疫电镜技术胶体金免疫胶体金技术具双多价结合力亲和物亲和免疫组化同位素放射自显影技术免疫组织化学的发展过程年代研究者事件 1941 年 Coons 创立免疫荧光技术 1948 年 Fagraeus 发展免疫荧光技术 1966 年 Nakane 免疫酶标抗体技术 1970 年 Sternberger 非标记免疫酶抗体技术 1974 年 Taylor 证实组织中浆细胞, 免疫组化 1975 年 Kohler,Milstein 单克隆抗体技术 1976 年 Bayer 亲和组化技术 1981 年 Hsu 胶体金免疫标记 90 年代 SP 法 Envision 法原位杂交法原位 PCR 法免疫组织化学特点高度特异性高度敏感性应用广泛性方法快速性定位精确性肺部肿瘤的鉴别诊断传统的组织化学 : 间皮瘤透明质酸阳性腺癌黏液糖蛋白阳性 : alcin blue, PAS, 黏卡红阳性肺部肿瘤的鉴别诊断抗原纤维性恶性间皮瘤局限性良性纤维型间皮瘤血管源性肉瘤 CK ACTIN + - +/- CD 第八因子几种肿瘤标记免疫组化染色对恶性肿瘤病人的预后意义

免疫组化反应和显色观察和结果记录抗原提取和纯化抗原概念和特性某物质作用机体, 产生相应抗体或使淋巴细胞致敏 (1), 并发生特异性反应之物质 (2) 抗原特性免疫原性 (1) 反应原性 (2)

2 恶性肿瘤多药耐药标记和临床意义耐药标记作用机制阳性定位主要耐药药物 P 糖蛋白 (P-Gp) 药泵作用胞膜胞浆长春花碱阿霉素谷胱甘肽 S 转移酶解毒作用胞浆顺铂等拓扑异构酶 II 靶点作用胞核 VP16 等 Bcl - 2 抗凋亡作用胞浆多数抗癌药物免疫组织化学技术的全过程抗原提取和纯化免疫动物 ( 抗体制备 ) 或细胞融合 ( 单克隆抗体制备 ) 抗体效价检测和提取标记抗体细胞和组织切片标本制备免疫组化反应和显色观察和结果记录抗原提取和纯化抗原概念和特性某物质作用机体, 产生相应抗体或使淋巴细胞致敏 (1), 并发生特异性反应之物质 (2) 抗原特性免疫原性 (1) 反应原性 (2) 完全抗原 : 具 (1,2) 两种特性之物质如蛋白质多肽病原微生物等半抗原 : 只有 (2), 无 (1) 特性之物质大多数多糖类脂简单低分子化学物人工全抗原半抗原 + 大分子载体 ( 蛋白质 ) 具完全抗原特性

3 载体 : 能增加半抗原大小, 激发免疫反应抗原决定簇 ( 表位 ) 抗原分子表面具化学活性基团之区域不同种属间的同一抗原物质, 具完全或部分相同的抗原决定簇提取某一种抗原, 制备抗体, 可用于多种动物抗原物质需具备的条件异原性或异种性种属关系越远, 组织结构差异越大, 抗原性越强分异种抗原和同种抗原 ( 同种异型抗原 ) 理化性质分子量越大 (>1 万 ), 表面积大, 排泄慢, 免疫原性强分子构型排列免疫原性环状 > 直线, 聚合 > 单体特异性取决于抗原表面抗原决定簇的性质数量空间构型抗原分类按物理性状颗粒抗原 - 抗原性强可溶性抗原 - 抗原性弱按性质分结构抗原分泌抗原沉积抗原入侵抗原制备抗体用之抗原物质应具备纯度高稳定性高免疫原性好抗原制备和纯化一般步骤增溶溶解分离纯化抗原纯度鉴定特异性抗体制备多克隆抗体 (Polyclone antibody,pcab) 由抗原免疫动物产生的抗体, 因抗原有多个抗原决定簇, 由多个 B 细胞克隆同时受刺激

4 产生的抗体多克隆抗体制备动物选择佐剂免疫方法效价测定放血或定期抽血常用佐剂目的延长抗原在体内时间增强抗原性完全福氏佐剂 85% 石蜡油 15% 羊毛脂卡介苗 200mg/100ml 不完全福氏佐剂石蜡油 5 份 ( 或 3 份 ) 羊毛脂 -1 份纯化的抗原 + 福氏佐剂充分乳化注射动物第一次 - 抗原 2mg + 等量佐剂第二次 - 抗原 1mg, 不用佐剂 (1-2 周后 ) 第三次 - 同第二次免疫方法途径肌注静脉注射皮内皮下多点注射脾内腹腔内淋巴结内抗原量 0.005mg 可产生抗体常用 0.5~1.0mg/kg 体重抗原量过大有抑制作用测定抗体效价 ( 第末次加强免疫,2 周后采血 ) 环状沉淀试验或免疫电泳法双相琼脂扩散 (1 :64 + 时可放血 ) 酶联免疫吸附试验 (ELISA ) 免疫组化方法放血或定期抽血颈动脉放血

5 分离血清纯化抗血清分管冷冻或抗体冷冻干燥可长期保存单克隆抗体 (monoclone antibody,mcab) 针对一个抗原决定簇的一个 B 淋巴细胞克隆分泌的抗体单克隆抗体制备免疫动物细胞融合选择培养克隆化抗体检测扩大培养免疫组织化学染色过程中的基本技术组织标本的取材和固定玻片的处理抗原修复抗体稀释法免疫组织化学染色方法组织标本的取材和固定保持组织细胞形态, 保持组织成分抗原性取材及时组织块大小 :2x2x0.2cm 固定时间 24h 内或冰冻切片可用微波组织固定法组织置于生理盐水 500ml 的塑料缸, 用微波功率为第三档 (300~350W 功率 ), 辐射时间 4-5 分, 如有温控系统则调整温度 50~55, 自动停机后, 自然冷却, 进入脱水流程机制 : 可能与微波对组织产生热效应和化学效应有关玻片的处理 ( 防止染色过程中脱片 ) 清洗干净涂防脱片剂明胶水溶液防脱片白胶 (Elmer s Glue) 多聚赖氨酸 (Poly-L-Lysin) 防脱片剂 (APES 等 ) 抗原修复指石蜡切片免疫组化染色前用酶表面活性剂微波金属盐等方法对被掩盖的抗原决定簇或变性抗原进行暴露或修复, 使抗原得到一定程度的恢复过程石蜡切片中抗原降低的主要原因甲醛固定液中醛基与抗原蛋白中的氨基交联 -> 羧甲基 - 封闭抗原决定簇甲醛使组织中蛋白与蛋白之间发生交联 > 形成网络结构而掩盖抗原决定簇组织从脱水透明浸蜡烘片过程, 温度过高及其他理化因子使抗原性破坏丢失

6 抗原修复方法酶消化法微波辐射法酸水解法高压加热法去垢剂处理法酶消化法 ( 消化时间 37 10~40,2-3h) 胰蛋白酶消化法链霉蛋白酶消化法无花果蛋白酶消化法适用于细胞内抗原 ( 中度消化, 弱消化 ) 胃蛋白酶消化法菠萝蛋白酶消化法适用于细胞间质抗原 ( 强度消化 ) 酶消化法注意事项消化液配制的最适 PH 消化后充分洗涤阳性和阴性对照片同时消化蛋白酶尿素及胰蛋白酶联合消化技术酶消化能力强, 易脱片, 有时破坏组织形态或影响抗原性尿素 (3mol/L 尿素水溶液 5min) 对单克隆抗体标记的抗原暴露效果好联合法降低胰酶浓度缩短时间进行预消化, 再提高尿素浓度进行胰酶 - 尿素联合消化技术优点 : 不脱片, 对单多克隆抗体标记好微波辐射法用重金属盐类修复液, 缓冲液类修复液微波辅助金属盐或缓冲液抗原修复技术微波辅助硫氰酸铅等重金属盐能修复石蜡切片中大部分被破坏抗原常用金属盐 : 硫酸锌硫酸铝硫酸铜硫酸钾氯化铝醋酸铅等微波辅助抗原修复技术柠檬酸缓冲液 (PH6.0) 盐酸 - 甘氨酸缓冲液 (PH3.5) 磷酸缓冲液 (PH7.4) Tris-Hcl 或醋酸缓冲液 (PH8~9) 柠檬酸缓冲液配制 A 液 : 称取 21.01g 柠檬酸溶于 1000mlD.W. B 液 : 称取 29.41g 柠檬酸钠 1000ml D.W. 工作液取 9mlA 液 +41ml B 液 +450ml D.W. 调节 PH=6.0±1 微波辐射法步骤

7 石蜡片脱蜡, 水洗后放于修复液中微波炉内微波辐射, 用 250w 的输出功率辐射 2x5 分钟冷却至室温 15 常规免疫组化染色微波辐射法原理 : 未明热效应辐射场内极性分子运动加速, 使被封闭抗原决定簇重新暴露或修复化学反应化学物质与部分决定簇结合起化学反应, 增加通透性, 抗原 - 抗体结合更多微波直接作用高频电磁波作用, 使打开蛋白质之间的交联, 使抗原决定簇中化学链获得修复酸水解法 1mol/L Hcl,37 13~18, 80 1~3,60 8~13 盐酸水解作用能使交联断裂, 抗原决定簇暴露关键 : 防止水解过度高压加热法切片入下列任何一种柠檬酸缓冲液蒸馏水生理盐水 PBS 自来水恒温水浴内煮沸 2x5 分钟, 或高压锅 ( 或高压灭菌锅 ) 煮沸 1-2 分钟注意喷气时间不能 >2 分钟, 以防脱片和结构破坏去垢剂处理法种类皂角苷吐温 Triton X-100 作用溶解胞膜脂质增加细胞通透性适用于细胞涂片冰冻切片去垢剂处理法 0.05%~0.1%Triton x-100+ 微波辅助作用, 效果好优点操作简单经济实用易于配制关键浓度温度

时间免疫电镜慎用最佳修复方法的选择对抗原修复方法的评价酶消化法使部分抗原决定簇暴露, 染色性增强同时破坏部分抗原对某些膜抗原激素受体癌基因及部分淋巴细胞抗原无增强作用有破坏作用 ( 结构受损, 增加弥散 ) 不利定位观察对抗原修复方法的评价单纯加热高压加热微波等方法温度在 95 以上, 必须使用修复缓冲液, 有化学效应, 对受高温作用组织起保护作用单纯加热法

8 时间免疫电镜慎用最佳修复方法的选择对抗原修复方法的评价酶消化法使部分抗原决定簇暴露, 染色性增强同时破坏部分抗原对某些膜抗原激素受体癌基因及部分淋巴细胞抗原无增强作用有破坏作用 ( 结构受损, 增加弥散 ) 不利定位观察对抗原修复方法的评价单纯加热高压加热微波等方法温度在 95 以上, 必须使用修复缓冲液, 有化学效应, 对受高温作用组织起保护作用单纯加热法操作简单经济, 适用于所有实验室对封闭牢固的抗原决定簇暴露不太理想对抗原修复方法的评价高压加热法对部分抗原经高压加热, 染色强度和效果比微波好时间不易掌握, 会发生非特异性抗原暴露, 增加背景染色对抗原修复方法的评价微波修复法广泛应用, 不同型号微波功率不同, 价贵抗体稀释法目的寻找抗体最佳工作浓度 - 最佳稀释度最强的特异性染色最弱的背景染色影响抗体稀释度的因素抗体的浓度质量有效期抗体中非特异性蛋白质的含量孵育时间长短染色方法灵敏度差异

9 抗体稀释法判断最佳稀释度应注意背景和阳性染色强度阳性强度 : 以 ++++( 极强 ),+++( 强阳性 ),++( 弱强阳性 ), +( 弱阳性 ),- ( 阴性 ) 表示背景强度以 ++++,+++,++,+,- 表示抗体稀释法抗体稀释度测定法直接法已知其他抗体稀释度时, 直接测一抗稀释度棋盘法对一抗二抗未知最佳稀释度时采用此方法特异性抗体 - 一抗中间抗体 - 二抗标记抗体 - 三抗直接测定法一抗稀释度特异性染色非特异性背景染色范围强度强度 1: : : : : 阴性对照 - - 最佳稀释度 : 在 1:400~1:500 之间 ( 初选 ) 再稀释测定 :1:450 从中选择最佳稀释度棋盘稀释法第二抗体第一抗体稀释度稀释度 1:500 1:1000 1:2000 1:4000 1: (++) ++++(+) +++(-) +(-) 1: (+) +++(-) ++(-) +(-) 1:400 ++(-) +(-) -(-) -(-) ( ) 内为背景着色强度,( ) 外为特异性染色强度上表结果显示 : 一抗以 1:500~1:1000 稀释度为佳二抗以 1:200 稀释度为佳抗体稀释法抗体稀释滴加和保存稀释 : 用 0.01mol/L PBS 或 TBS(PH7.4) 稀释滴加 : 用微量加样器吸取抗体加于组织片上, 一般 30~50ul 滴加前组织勿干保存长期不用抗体 : 分装低温 (-20 ~-40 ) 冰箱或冻干短期使用抗体 :4 冰箱保存数周已稀释抗体 : 一周内用完, 不宜长期保存避免反复冰融, 效价会下降孵育方法及时间

10 孵育 : 在湿盒中进行, 防止蒸发和干燥时间和温度 :4 冰箱过夜, 室温 37,30-60 分钟微波技术进行时, 孵育时间缩短注意 : 孵育后的切片, 用 PBS 充分洗涤免疫组织化学染色方法根据标记物分类免疫荧光技术 Immunofluorescence technique 免疫酶技术 Immunoenzymatic technique 免疫电镜技术 Immunoelectron microscopy 免疫组织化学染色方法根据标记物分类免疫胶体金技术 Immunocolloidal gold technique 免疫金染色免疫金银染色亲和免疫组织化学 Affinity immunohistochemistry 放射自显影 Autoradiography 免疫组织化学染色方法按主要步骤分一步法 ( 直接法 ) 二步法 ( 间接法 ) 三步法 : 如 PAP 法 ABC 法 SP 法四步法五步法多重免疫组化法双重免疫组化法注意选择抗体阳性定位部位不同先测抗原分布情况, 阳性细胞少先染玻片处理 DAB 和 FITC 搭配时双标荧光法搭配时免疫组化染色注意事项抗体保存配制显示剂合理使用对照设计结果判断等免疫组织化学要点免疫组化概念及特点标记物种类及其技术抗原特性及其概念多克隆抗体和单克隆抗体概念免疫组化技术的全过程

11 免疫组化染色过程的基本技术抗原修复概念和方法石蜡切片中抗原性降低的主要原因对抗原修复方法的评价抗体稀释的目的及影响稀释度的因素

材料方法

材料方法生物技术通报姜燕采用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体和胶体金标记鼠抗人血红蛋白单克隆抗体及对照抗体羊抗鼠利用双抗体免疫夹心反应原理特异性地结合人血红蛋白抗原在内可得到胶体金显色结果的原理研制便潜血单克隆一步法胶体金检测试卡用于诊断因各种原因引起的消化道出血疾病应用杂交瘤技术制备两株鼠抗人血红蛋白抗体方法检测效价免疫胶体金技术制备胶体金检测试卡法检测效价的结果显示鼠抗人