CD20检测试剂盒(免疫组化)说明书

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1 CD45 检测试剂盒 ( 免疫组织化学法 ) 说明书 说明书编号 :40024a 产品编号 :Kit-0024 产品名称 通用名称 :CD45 检测试剂盒 ( 免疫组织化学法 ) 英文名称 :CD45 Detection KIT (Immunohistochemistry) 包装规格 30 人份 / 盒 ;60 人份 / 盒 预期用途 用于福尔马林固定 石蜡包埋的人体组织切片, 细胞中 CD45 抗原的定性检测, 以辅助 淋巴造血系统源性肿瘤的诊断及鉴别诊断 阳性细胞中抗原定位为细胞膜 对任何阳性或阴 性结果的解读, 应由病理医生结合病理形态学 临床表现及其它检测方法进行, 不作为单独 的诊断指标 检测原理 利用免疫学抗原抗体分子由于结构的互补和彼此亲和性所发生特异性结合原理, 并通过 氧化还原化学反应使标记抗体的酶显色剂显色来确定组织细胞内抗原, 对其进行定位 定性 首先是联结鼠抗人 CD45 免疫组化单克隆抗体和组织上的 CD45 抗原, 第二是酶标羊抗小鼠 / 兔 IgG 聚合物识别已经连接上的 CD45 抗体 ; 第三, 加入底物, 聚合物上的辣根过氧化物 酶部分可以催化 DAB 显色液中的 H 2 O 2 分解, 使联苯胺氧化变成联苯亚胺, 使组织切片中 抗原位点上出现黄色或棕黄色着色 最后对样本进行复染和封片 通过显微镜观测显色情况, 推断组织切片上 CD45 的存在位点和情况 为了质量控制, 提供福尔马林固定石蜡包埋的人 类扁桃体组织切片作为阳性对照 本试剂盒采用抗体克隆为 :PD7/26+2B11; 细胞染色定位为细胞膜 ; 抗原修复必须采用 柠檬酸缓冲液高压法 主要组成成份 试剂 1: 内源性过氧化物酶阻断剂 3ml/ 瓶 6ml/ 瓶 试剂 2: 试剂 3: 一抗 : 鼠抗人 CD45 免疫组化单克隆抗体 (IgG 1 /κ, 来源 : 小鼠组织培养上清液 ; 克 隆号 :PD7/26+2B11;) 二抗 : 酶标羊抗小鼠 / 兔 IgG 聚合物 ( 动物 源性 : 山羊 IgG; 辣根过氧化物酶 ) 3ml/ 瓶 3ml/ 瓶 6ml/ 瓶 6ml/ 瓶 试剂 4A: DAB 缓冲液 6ml/ 瓶 15ml/ 瓶 试剂 4B: DAB 底物 (20 ) 1ml/ 瓶 1ml/ 瓶 试剂 4C: DAB 色原 (20 ) 1ml/ 瓶 1ml/ 瓶 试剂 5: 苏木素体细胞染色液 6ml/ 瓶 15ml/ 瓶 试剂 6: 空白对照试剂 ( 牛血清白蛋白 ) 3ml/ 瓶 6ml/ 瓶 试剂 7: 柠檬酸组织抗原修复液 (100 ) 100ml/ 瓶 250ml/ 瓶 粉剂 : PBS 磷酸盐缓冲液 ( 粉剂 ) 2000ml/ 包 5000ml/ 包 试管 : DAB 显色液配制管 1 支 1 支 质控片 : CD45 阳性对照片 ( 扁桃体 ) 2 片 / 盒 4 片 / 盒 本包装仅提供试剂盒一抗组分, 不包括试剂 1 试剂 3 试剂 4 试剂 5 试剂 6 试剂 7 粉剂 试管 质控片组分 1

2 不同批号试剂盒各组成成份在有效期内可互换使用 试剂盒未提供试剂 : 二甲苯 乙醇( 无水 95% 85%) 蒸馏水 中性树胶 储存条件及有效期 2-8 避光保存, 不得冻存 自检定合格之日起有效期为 12 个月 使用时, 采取单支试剂即拿即用的原则, 试剂盒中其余组分在 2-8 的冰柜进行保存 单支试剂在每次使用后, 应立即放回试剂盒中 质控片打开真空包装后放置 2-8 避光保存的有效期为三周 样本要求 新鲜活检或外科样本组织, 中性福尔马林固定, 固定时间 8-24 小时, 参照病理技术规范要求取材 脱水 石蜡包埋并制成蜡块 蜡块在常温条件下保存有效期 5 年 组织切片厚度为 3 5 μm 黏附在聚赖氨酸玻片上, 轻拍切片架并用吸湿纸吸取组织切片中的水滴, 再放入 C 恒温箱中加热一个小时后, 从恒温箱中移出放置在室温下冷却 如果切片在室温下 (15 28 ) 保存, 为了良好地重现组织中抗原分布情况, 要在 3 个月内完成检测 检测方法 1 检测所需仪器 设备 : 移液器 免疫组化油笔 1000w 可调电磁炉 计时器 孵育盒 染色架 盖玻片 直径 18-20cm 不锈钢压力锅 光学显微镜 ( ) 洗瓶 2 溶液配置 : 2.1 PBS 溶液 : PBS 磷酸盐缓冲液 ( 粉剂 ) 需在使用时用适量 (2000ml 或 5000ml) 蒸馏水进行溶解, 混合均匀后使用 2.2 柠檬酸组织抗原修复液 : 根据所需抗原修复液的量, 取柠檬酸组织抗原修复液 (100 ), 按 1:100 的比例稀释 可取柠檬酸组织抗原修复液 (100 )10ml 加蒸馏水 990ml, 即成柠檬酸组织抗原修复液 1000ml 2.3 DAB 显色液 : DAB 显色液需要在使用前临时配制, 配制时如出现少许沉淀可过滤后使用, 并不影响染色效果和质量 配制方法 : 在配备的小试管中依次滴加 DAB 缓冲液 1ml,DAB 底物 (20 ), DAB 色原 (20 ) 各 1 滴 (50µl), 以配制 DAB 显色液 配置好的 DAB 显色液避光存放,60 分钟内有效 3 试验温度条件 : 试验步骤 : a) 脱蜡和水化石蜡切片置于新鲜的二甲苯中, 浸泡 15 分钟 2 次 ; 去除多余的液体后, 置无水乙醇中, 浸泡 3 分钟 2 次 ; 去除多余的液体后, 置 95% 乙醇中, 浸泡 3 分钟 ; 去除多余的液体后, 置 85% 乙醇中, 浸泡 3 分钟 ; 自来水冲洗 1 分钟 ; b) 高压加热柠檬酸组织抗原修复液压力锅开盖在电磁炉上大功率加热柠檬酸组织抗原修复液至沸腾 ; 将脱蜡水化后的切片置于耐高温染色架上, 放入压力锅中 ; 盖上锅盖, 扣上压力阀, 继续加热至喷汽, 开始计时 2 分钟后, 压力锅离开热源, 自然冷却 5 分钟 ; 2

3 用自来水冲淋使之冷却, 去阀开盖, 待锅中液体自然冷却至室温后取出切片 ; 蒸馏水冲洗 3 分钟 2 次 ; 用 注意 : 抗原修复时, 修复液的量必须保证切片始终能浸泡在液体内, 一般情况 : 修复液的量为 800ml/1 架 -1500ml/3 架 c) 阻断内源性过氧化物酶除去 PBS 溶液, 加 100μl 内源性过氧化物酶阻断剂, 室温下孵育 10 分钟 ; d) 加 CD45 抗体或空白对照试剂除去 PBS 溶液, 加 100μl 的 CD45 抗体或空白对照试剂, 室温下孵育 60 分钟 ; e) 加酶标聚合物除去 PBS 溶液, 加 100μl 酶标羊抗小鼠 / 兔 IgG 聚合物, 室温下孵育 15 分钟 ; f) 显色除去 PBS 溶液, 加 μl 新鲜配制的 DAB 显色液, 孵育 3-5 分钟, 光镜观察染色结果一般不超过 10 分钟 g) 复染自来水冲洗, 加 μl 苏木素体细胞染色液孵育 秒 ; PBS 溶液或自来水冲洗返蓝 注意 : 依据作用的苏木素染色液的强度和孵育时间的长短 : 对比染色结果导致细胞核呈现淡蓝到深蓝颜色的反应, 而过染或是不足染色都有可能危及正确结果的判断 h) 脱水 透明 封片 85% 乙醇中, 浸泡 3 分钟 ; 95% 乙醇中, 浸泡 3 分钟 ; 无水乙醇, 浸泡 3 分钟 ; 二甲苯透明 ; 中性树胶和盖玻片封片 5 结果判断 : 免疫组化检测结果要由有资格的病理医生在光学显微镜下对染色后切片进行观察并进行判断 5.1 免疫组化染色结果必须建立在组织阳性对照 试剂阴性对照实验成立的基础上, 染色结果的判读 : 阳性 (+)/ 阴性 (-) 染色阳性结果是指组织切片中特定细胞的细胞膜上见有棕黄色着色, 且无背景染色 阴性染色结果是组织内预期细胞中未见棕黄色着色 注意 : 在每一次染色过程中, 必须使用阳性对照片和空白对照试剂, 否则结果不可采用 5.2 组织阳性对照和试剂阴性对照实验成立的基础上, 受检组织片中出现阳性染色表示组织切片上存有 CD45 抗原 5.3 组织阳性对照和试剂阴性对照实验成立的基础上, 受检组织片中出现阴性染色表示组织切片上存有 CD45 抗原可能性低 5.4 如果组织阳性对照和试剂阴性对照实验均为阴性结果, 表明试剂失效或实验操作错误, 应重新实验 过程与结果质控阳性对照 : 3

4 阳性对照可作为正确组织准备和适当染色技术的指示 每次染色都要包含同一测试条件下的阳性对照片进行比较 已知的阳性组织对照只能用于监控步骤的正确执行和试剂的测试, 并不用于帮助叙述病人样本的明确诊断 如果阳性组织对照不能显示适当的阳性染色, 此批实验测试样本的结果应认为是无效的 福尔马林固定 石蜡包埋扁桃体组织切 片,CD45 试剂盒染色, 细胞膜阳性 空白对照 : 每次染色都要包含同一测试条件下的空白对照试剂进行对比 空白对照试剂来代替抗体对组织切片进行染色, 用来判断非特异性着色, 并对抗原部位特异性染色提供更好的解释 空白对照试剂的孵育时间必须与抗体一致 阳性对照片为福尔马林固定石蜡包埋的组织切片, 试剂盒对阳性对照片的前期处理不能进行质控 不过阳性对照片是严格按照病理操作规范进行前期处理, 且实验证实该阳性对照片抗原保存良好可以进行免疫组化实验, 作为阳性对照片使用 参考值( 参考范围 ) 本试剂盒为定性检测使用, 无定量参考值 镜下观察的结果参考如下 : 阴性 : 组织内预期细胞中未见棕黄色着色 阳性 : 组织切片中特定细胞的细胞膜上见有棕黄色着色 检测结果的解释 1 抗原修复 孵育时间 温度的修改或应用其他方法均有可能得出错误结果 2 在每一次染色过程中, 必须使用阳性对照片和空白对照试剂, 否则结果不可采用 3 当在室温下保存时, 样本应该在组织封存到载玻片上 3 个月内染色 否则可能由于时间长久, 组织中抗原的退变产生假阴性结果 4 如果阳性组织对照不能显示适当的阳性染色, 则说明操作错误, 此批实验测试样本的结果应认为是无效的 检测方法的局限性 免疫组化用于病理诊断是一个多步的诊断过程, 需要有正确试剂的选择 组织的选择 固定和处理, 切片的准备及染色结果解释的专业培训 染色前组织的处理过程能直接影响染色效果 不恰当的固定 冰冻 熔化 清洗 烘干 切片或被其他组织或液体污染都可能造成假阳性, 抗体定位不准确或假阴性结果 异常的结果出现有可能是由于固定和包埋方法的不同, 或组织内部的不规则 过度或不足的复染都可能影响结果的正确解释 任何阳性染色或阳性染色缺失的临床解释都必须参考其临床描述 细胞形态学和其他组织病理学背景 任何染色或其缺失的临床解释都必须以形态学上的研究和正确的对照以及其他诊断试验作为补充 这是一个合格病理医生的责任, 他要熟悉抗体 试剂和方法, 这样才能正确的解释所染色的样本 染色试验必须由一家认证过的实验室进行, 且要在一个对染色切片的评分有责任心并能保证有阳性对照试验同时进行的病理医生的领导下进行 而测试结果及诊断价值也应由病理医生结合临床及其他检查结果加以综合分析和判断 试剂可能会在先前未测试过的组织上呈现预料不到的反应 就算在测试过的组织群中出现预料不到反应的可能性也不能完全消除, 这是由于肿瘤或其他病态的组织中抗原表达在生物学上具有的可变性 假阳性的结果可能会由于蛋白或底物反应产物的非免疫学结合造成的 它们也可能会由 4

5 红血球和细胞色素 C 造成的 产品性能指标 特异性对一系列正常组织和相关恶性病变组织进行特异性细胞膜染色研究, 正常组织结果如下 : 大脑 (0/3) 小脑(0/3) 肾上腺(0/3) 卵巢(0/3) 胰腺 (0/3) 甲状旁腺 (0/3) 垂体 (0/3) 睾丸(0/3) 甲状腺(0/3) 乳腺 (0/3) 脾 (3/3) 扁桃体 (3/3) 胸腺(3/3) 骨髓 (3/3) 肺 (0/7) 心脏 (0/3) 食管 (0/3) 胃 (3/3) 小肠(3/5) 结直肠(2/3) 肝脏 (0/3) 唾液腺(0/3) 肾 (0/3) 前列腺(0/3) 子宫(0/6) 膀胱(0/3) 骨骼肌(0/3) 皮肤 (0/3) 外周神经(0/3) 间皮细胞(0/3) 相关恶性病变组织结果如下 :B 细胞淋巴瘤 (5/5) T 细胞淋巴瘤 (4/5) 霍奇金淋巴瘤 (4/5) 恶性黑色素瘤 (0/5) 结肠腺癌 (1/5) 横纹肌肉瘤 (0/5) 肺腺癌(0/5) 肺鳞癌(0/5) 子宫内膜间质肉瘤(0/5) 纤维肉瘤(0/5) 用 CD45 阳性对照片 ( 扁桃体 ) 进行检测, 三份 CD45 阳性对照片 ( 扁桃体 ) 中所有类型的淋巴细胞细胞膜上观察到黄色或棕黄色着色 ; 而血管内皮, 平滑肌细胞 纤维细胞 上皮细胞上未观察到任何黄色或棕黄色着色 用空白对照试剂取代鼠抗人 CD45 免疫组化单克隆抗体配合 CD45 阳性对照片 ( 扁桃体 ) 进行检测, 三份 CD45 阳性对照片 ( 扁桃体 ) 中所有类型的淋巴细胞细胞膜上应显示阴性结果 敏感度用 CD45 弱阳性对照片 ( 扁桃体 ) 进行检测, 三份 CD45 弱阳性对照片 ( 扁桃体 ) 中所有类型的淋巴细胞细胞膜上观察到浅黄色着色, 且颜色无明显差异 批内差在同一批次的产品随机抽取 20 盒样本采用阳性质控品进行检测, 然后在上述 20 盒的样本随机抽取一盒, 对相同质控品连续检测 20 次, 检测结果均为阳性 批间差随机抽取 3 批试剂盒的样本, 每批试剂盒抽样数 3 盒, 对每份样本采用阳性内部质控物进行检测, 检测结果均为阳性 注意事项 1 本品仅用于体外诊断, 不做其它用途 2 需专业人员使用 3 其中鼠抗人 CD45 免疫组化单克隆抗体 酶标羊抗小鼠 / 兔 IgG 聚合物, 阳性对照片均来自生物资源, 对其应处理应符合相关要求 4 应用适当的防护措施, 以避免试剂同皮肤和眼睛接触 5 此试剂盒是否应用于非福尔马林固定组织还未得到证实 6 不要用其它生产商试剂盒内试剂或阳性对照片来代替本试剂盒内试剂或阳性对照片 7 试剂含有叠氮钠作为防腐剂, 叠氮钠可以和铅铜反应而形成易爆炸的金属叠氮化合物 为防止金属叠氮化合物的形成, 应用大量的水冲洗以免其堆积 8 据有关研究试剂盒中的 DAB 有致癌潜在可能, 在使用过程中要严格执行规范的实验操作方法 显色前带好手套, 穿好工作服, 整个实验过程要求仔细迅速, 尽量减少 DAB 接触时间, 工作人员与实验台保持一定的距离 DAB 显色完后, 及时将所使用的手套 移液器枪头等一次性处理污染物包装好放置于容器内, 用硫酸加以处理 若在试验过程中不小心将 DAB 溅到或者沾到皮肤, 立即用流动的水进行持续冲洗 参考文献 1. Nicholas D. Huntington, David M. Tarlinton. CD45: directand indirect government of immune regulation[j]. Immunology Letters,2004, 94: 吴秉铨, 刘彦仿. 免疫组织化学病理诊断 [M]. 北京 : 北京科学技术出版社,

6 3. 王淑琴, 黄风昌, 李红芬, 纪小龙. 免疫组化在常规病理诊断中的应用 [J]. 中国试验诊断学,1998,2(6): 智俐, 贾军乐. 免疫组化技术中抗原修复的应用 [J]. 包头医学院学,2006,22(02): 唐伟国主编. 医学检验诊断试剂的制备与应用 [M]. 上海 : 上海科学技术文献出版社, 许良中, 杨文涛. 免疫组织化学反应结果的判断标准 [J]. 中国癌症杂志,1996,6(04): 生产企业 福州迈新生物技术开发有限公司地址 : 福州市工业路北段 550 号洪山科技园 2 号楼四层邮编 : 电话 : 传真 : 网址 : 医疗器械生产企业许可证编号 闽食药管械生产许第 号 医疗器械注册证书编号 国食药监械( 准 ) 字 2013 第 号 产品标准编号 YZB/ 国 说明书批准及修改日期 2013 年 8 月 5 日 6

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