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1 原位杂交免疫组化实验方法学索引 1 原位杂交实验的原理和杂交的严格度 (mrna 阳性模板的杂交, 基因组 DNA 阳性模板的杂交 ) 原位杂交实验的原理... F45 杂交 (Hybridisation).....F47 2 原位杂交的组织固定 ( 细胞涂片和爬片, 冰冻切片, 石蜡切片 ) 原位杂交的组织固定...F45 3 原位杂交细胞组织通透性的改变, 以便充分暴露载体 增强组织的通透性..F46 4 原位杂交的常用液体配制....F48 细胞爬片的固定...F49 5 FISH 荧光原位杂交基本的实验方法 (mrna 和基因组 DNA)....F50 6 DIG( 地高辛 ) 标记的探针原位杂交基本的实验方法 (mrna 和基因组 DNA).F52 7 免疫组化的病理制片技术的规范 H-E 技术操作规范..F53 组织化学技术操作规范 F55 免疫组化异常染色结果的评价 F60 切片时碰到的问题的原因及可能处理的方法.F67 8 免疫组化的组织固定 ( 细胞涂片和爬片, 冰冻切片, 石蜡切片 )..F55 9 免疫组化组织通透性的改变和修复, 以便充分暴露抗原.F57 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD F1

2 原位杂交实验的原理原位杂交 (ISH) 是一种可在细胞涂片 组织切片以及分裂中期染色体带中检测 DNA 或 RNA 的技术, 此方法原理是由 DNA 或 RNA 的序列与互补的标记单链 DNA/RNA 探针结合形成标记的双链杂交分子, 本技术可对组织细胞原位的待测核酸分子进行定性, 定量及定位分析 在细胞分化调节 基因定位 肿瘤遗传学 分子病理学 病毒学等领域得到广泛应用 经典的原位杂交技术包括载玻片处理, 组织细胞的固定, 探针的制备或选购, 原位杂交, 洗涤以及检测, 其中探针制备技术不属于本章专业技术, 故不作具体评叙, 略交待制备使用原则 本章节主要介绍培养细胞的原位杂交技术 ( 一 ) 原位杂交的组织固定 ( 细胞涂片和爬片, 冰冻切片, 石蜡切片 ) 原位杂交组织化学技术 (In Situ Hybridization Histochemistry, ISHH) 在固定剂的应用和选择上应兼顾到三个方面 : 保持细胞结构, 最大限度地保持细胞内 DNA 或 RNA 的水平 ; 使探针易于进入细胞或组织 DNA 是比较稳定的,mRNA 是相对稳定的但易为酶合成和降解 RNA 却绝然不同, 非常容易被降解 因此, 对于 DNA 的定位来说, 固定剂的种类和浓度并不十分重要 相反, 在 RNA 的定位上, 如果要使 RNA 的降解减少到最低限度, 那么, 不仅固定剂的种类浓度和固定的时间十分重要, 而且取材后应尽快予以冷冻或固定 在解释 ISHH 的结果时应考虑到取材至进入固定剂或冰冻这段时间对 RNA 保存所带来的影响, 因组织中 mrna 的降解是很快的 在固定剂中, 最常用的是多聚甲醛 和其它的固定剂 ( 如戊二醛 ) 不同, 多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接, 因而不会影响探针穿透入细胞或组织 其它如醋酸 - 酒精的混合液和 Bouin s 固定剂也能获得较满意的效果 对于 mrna 的定位, 我们常采用的方法是将组织固定于 4% 多聚甲醛磷酸缓冲液中 1~2h, 在冷冻前浸入 15% 蔗糖溶液中, 置 4 冰箱过夜, 次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片 组织也可在取材后直接置入液氮冷冻, 切片后才将其浸入 4% 多聚甲醛约 10min, 空气干燥后保存在 -70 如冰箱温度恒定, 在 -70 可保存数月之久不会影响杂交结果 在病理学活检取材多用福尔马林固定和石蜡包埋, 这种标本对检测 DNA 和 mrna 有时也可获得杂交信号, 但石蜡包埋切片由于与蛋白质交叉连接的增加, 影响核酸探针的穿透, 因而杂交信号常低于冰冻切片 同时, 在包埋的过程中可减低 mrna 的含量 其它固定剂如应用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷冻切片也可获得满意效果 各种固定剂均有各自优缺点, 如沉淀性 (Precipitating) 固定剂 : 酒精 / 醋酸混合液 Bouin s 液 Carnoy s 液等能为增加核酸探针的穿透性提供最佳条件, 但它们不能最大限度地保存 RNA, 而且对组织结构有损伤 戊二醛能较好地保存 RNA 和组织形态结构, 但由于和蛋白质产生广泛的交叉连接, 从而大大地影响了核酸探针的穿透性 至今, 多聚甲醛仍被公认为 ISHH 较为理想的固定剂 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD F2

3 ( 二 ) 玻片和组织切片的处理 1. 玻片的处理玻片包括盖片和载片应用热肥皂刷洗, 自来水清洗干净后, 置于清洁液中浸泡 24h, 清水洗净烘干,95% 酒精中浸泡 24h 后蒸馏水冲洗 烘干, 烘箱温度最好在 150 或以上过夜以去除任何 RNA 酶 盖玻片在有条件时最好用硅化处理, 锡箔纸包裹无尘存放 由于 ISHH 的实验周期长, 实验程序繁杂, 因此, 要应用粘附剂预先涂抹在玻片上, 干燥后待切片时应用, 以保证在整个实验过程中切片不致脱落 常用的粘附剂有铬矾 - 明胶液, 其优点是价廉易得, 但在长周期实验过程中, 粘附效果不够理想 多聚赖氨酸液具有较好的粘附效果, 但价格昂贵, 需进口 近年 Vector Lab (U.S.A.) 推出一种新的粘附剂叫 Vectorband Reagent, 每一单位包装可制备 500~700 张载玻片, 粘附效果极佳, 价格较多聚赖氨酸便宜, 制片后可长期保存应用 目前国内尚无生产, 需国外进口 天津灏洋生物提供 : 原位杂交及免疫组化防脱片载玻片 ( 氨基玻片 ) 2. 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性此步骤根据应用固定剂的种类 组织的种类 切片的厚度和核酸探针的长度而定 比如用戊二醛固定的组织由于其与蛋白质产生广泛的交叉连接就需要应用较强的增强组织通透性的试剂 增强组织通透性常用的方法如应用稀释的酸洗涤 去垢剂 (detergent) 或称清洗剂 Triton X-100 酒精或某些消化酶如胃蛋白酶 胰蛋白酶 胶原蛋白酶和淀粉酶 (diastase) 等 这种广泛的去蛋白作用无疑可增强组织的通透性和核酸探针的穿透性, 提高杂交信号, 但同时也会减低 RNA 的保护和影响组织结构的形态, 因此, 在用量及孵育时间上应慎为掌握 蛋白酶 K(Proteinase K) 的消化作用在 ISHH 中是应用于蛋白消化的关键步骤, 浓度及孵育时间视组织种类 应用固定剂种类 切片的厚薄而定 一般应用酶 k 1μg/ml( 于 0.1mol/l Tris/50mmol/L EDTA, ph8.0 缓冲液中 ),37 孵育 15~20min, 以达到充分的蛋白消化作用而不致影响组织的形态为目的 蛋白酶 K 还具有消化包围着靶 DNA 的蛋白质的作用, 从而提高杂交信号 在蛋白酶 K 消化后, 应用 0.1mol/L 的甘氨酸溶液 ( 在 PBS 中 ) 清洗以终止蛋白酶 K 的消化作用, 甘氨酸是蛋白酶 K 的抑制剂 为保持组织结构, 通常用 4% 多聚甲醛再固定 Burns 等 (1987) 报告应用胃蛋白酶 (Pepsin)20~100μg/ml( 用 0.1n HCl 配 ) 37 30min 进行消化, 所获实验结果优于蛋白酶 K 不少实验工作者在多聚甲醛固定后, 浸入乙酸酐 (acetic anhydride) 和三乙醇胺 (tri-ethanolamine) 中以减低静电效应, 减少探针对组织的非特异性背景染色 有的科研工作者除在室温下浸于上述溶液 10min 外, 还在预热 37 的 50% 甲酰胺 /2 SSC 液中预杂交 15min, 然后用 2 SSC,0.30mol/l NaAc/0.030mol/L 枸橼酸钠液中浸 15min 但 Heinz 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD F3

4 Hofer 等一些著名学者却对此持有异议, 根据他们的实验和经验证明, 乙酸酐和三乙醇胺液的处理并不能起到减低背景的目的, 不能改善 ISHH 的信 / 噪比例 3. 减低背景染色和免疫细胞化学染色一样 ISHH 实验程序中, 如何减低背景染色是一个重要的问题 ISHH 中背景染色的形成是诸多因素构成的 杂交后 (Posthybridization ) 的酶处理和杂交后的洗涤均有助于减低背景染色 预杂交 (Prehybridization) 是减低背景染色的一种有效手段 预杂交液和杂交液区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖 (Dextran sulphate) 将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的, 从而减低背景染色 有的实验室在杂交后洗涤中采用低浓度的 RNA 酶溶液 (20μg/ml) 洗涤一次, 以减低残留的和内源性的 RNA 酶, 减低背景染色 4. 防止 RNA 酶的污染由于在手指皮肤及实验用玻璃器皿上均可能含有 RNA 酶, 为防止其污染影响实验结果, 在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套 所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温 (240 ) 烘烤以达到消除 RNA 酶的目的 要破坏 RNA 酶, 其最低温度必须在 150 左右 有条件的国外实验室在消毒的玻璃器皿外包以锡箔纸以利于标记和防止取出时空气污染 ( 在无高温消毒的烤箱时, 亦可用国内出产的卫生蒸汽消毒锅 ) 杂交前及杂交时所应用的溶液均需经高压消毒处理 ( 三 ) 杂交 (Hybridisation) 在 ISHH, 整个实验周期是比较长的, 实验程序也比较繁杂, 而杂交在 ISHH 整个实验中可被认为是 短兵相接 的一步 杂交前的一切准备工作如增加组织通透性都是为了在杂交这一步骤中核酸探针能进入细胞或组织与其内的靶核苷酸相结合 因此, 杂交是 ISHH 中关键的而且是最重要的一个环节 杂交是将杂交液滴于切片组织上, 加盖硅化的盖玻片 国内向正华等采用无菌的蜡膜代替硅化的盖玻片也可获得满意的实验结果 加盖片的目的是防止孵育过程中的高温 (50 左右 ) 导致杂交液的蒸发 因此, 也有为稳妥起见, 在盖玻片周围加液体石蜡封固的, 但科研工作者认为这并不十分必要, 因封固的石蜡在高温下融解反易导致杂交液的污染, 必要时可加橡皮泥封固盖片四周 硅化的盖玻片的优点是清洁无杂质, 光滑不会产生气泡和影响组织切片与杂交液的接触, 盖玻片自身有一定重量能与有限的杂交液吸附达到覆盖和防止蒸发的作用 在孵育时间较长时, 为保证杂交所需的湿润环境, 可将复有硅化盖玻片进行杂交的载片放在盛有少量 5 SSC 或 2 SSC(standard saline citrate, SSC) 溶液的硬塑料盒 ( 要能防止高温破坏 ) 中进行孵育 杂交液的成分和预杂交液基本相同, 所不同的是加入了标记的核酸探针和硫酸葡聚糖 如前所述, 杂交前的准备只是为杂交的成功奠定基础, 要获得满意的实验结果, 在 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD F4

5 杂交这一实验过程中还须注意以下的环节 探针的浓度很难事先确定每一种实验探针的浓度, 但要掌握一个原则, 即探针浓度必须给予该实验最大的信 / 噪比值 背景染色的高低也与探针浓度有关 根据国内外实验工作者的经验, 认为最佳原则应是应用最低探针浓度以达到与靶核苷酸的最大饱和结合度为目的 这和我们在免疫细胞化学试验中选择抗血清的最佳工作浓度的原则一样 探针浓度依其种类和实验需要略有不同, 根据笔者的经验及所查阅文献, 在原位杂交细胞化学中, 探针浓度为 0.5~5.0μg/ml( 即 0.5~5.0ng/μl) 根据 Heinz Hofelt 实验室经验, 对放射性标记的 dsdna 或 crna 探针, 其浓度在 2~5ng/μl Conlton 认为生物素标记探针, 其最佳浓度在 0.5~5ng/μl 科研工作者在英皇家研究生院 Polak 教授实验室应用于放射性标记 crna 探针的浓度为 0.5ng/μl, 而在非放射性标记 ( 生物素或地高辛 )crna 探针浓度为 2.5ng/μl, 放射性标记 DNA 探针浓度为 1.0ng/μl 向正华等应用地高辛标记生长抑素 crna 探针获得满意结果, 其探针浓度为 0.5ng/μl 必须强调的是, 国内外实验室都证明加杂交液的量要适当, 以 10~20μl/ 每张切片为宜 杂交液过多不仅造成浪费, 而且液量过多常易致盖玻片滑动脱落, 影响杂交效果, 过量的杂交液含核酸探针浓度过高, 反易导致高背景染色等不良后果 探针的长度一般应用于 ISHH 探针的最佳长度应在 50~100 个碱基之间 探针短易进入细胞, 杂交率高, 杂交时间短 据报告, 长 500 个碱基的探针, 其杂交时间约需 20h 左右 200~500 个碱基的探针仍可应用, 如超过 500 个碱基的探针则在杂交前最好用碱或水解酶进行水解, 使其变成短的片段, 达到实验所需求的碱基数 原位杂交的常用液体配制 1 灏洋生物试剂盒中杂交液和预杂交液的配制 去离子甲酰胺...500ml (50% 终浓度 ) 20Xssc ( 或 SSPE) 250ml (5X 终浓度 ) 50X Denhardt..100ml (5X 终浓度 ) 10%SDS..50ml (0.5% 终浓度 ) 变性鲑鱼精 DNA..100ug/ml 临用前加 硫酸葡聚糖...100g (10% 终浓度 ) 预杂交液不加 DEPC 灭活 RNA 酶的去离子水定容至 1000ml Denhardt s 液 通常配成 50 储备液 聚蔗糖 (Ficoll 400) 10g 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD F5

6 聚乙烯吡铬烷酮 (PVP). 10g 牛血清白蛋白全组份 (BSA).10g DEPC 灭活 RNA 酶的去离子水定容至 1000ml 2, 20Xssc, 2Xssc, 0.2Xssc 缓冲液的配制 氯化钠 g (20X) 柠檬酸三钠 g (20X) DEPC 灭活 RNA 酶的去离子水定容至 1000ml 2Xssc, 0.2Xssc 依次稀释 10 倍 3,0.1mol PBS 缓冲液的配制 NaCL...4 g KCL g Na2HPO4.12H2O g KH2PO g 注意 : 在 500ml DEPC 灭活 RNA 酶的去离子水中依次溶解上述试剂 ; 5.6%NaCO3 调 ph 至 7.2 左右 4, 0.1mol 枸橼酸缓冲液的配制 枸橼酸三钠.3g 枸橼酸. 0.4g DEPC 灭活 RNA 酶的去离子水定容至 1000ml 5, 0.1mol TBS 缓冲液的配制 NaCL.8.5 g Tris. 1.2g DEPC 灭活 RNA 酶的去离子水定容至 1000ml 用 0.9-1ml 乙酸调 PH 至 7.5 6, 复合消化液的配制 蛋白酶 K(Proteinase K) 的消化作用在 ISHH 中是应用于蛋白消化的关键步骤, 其浓度及孵育时间视组织种类 应用固定剂种类 切片的厚薄而定 一般应用酶 k 1μg/ml( 于 0.1mol/L Tris/50mmol/L EDTA, ph8.0 缓冲液中 ),37 孵育 15~20min, 以达到充分的蛋白消化作用而不致影响组织的形态为目的 蛋白酶 K 还具有消化包围着靶 DNA 的蛋白质的作用, 从而提高杂交信号 在蛋白酶 K 消化后, 应用 0.1mol/L 的甘氨酸溶液 ( 在 PBS 中 ) 清洗以终止蛋白酶 K 的消化作用, 甘氨酸是蛋白酶 K 的抑制剂 为保持组织结构, 通常用 4% 多聚甲醛再固定 Burns 等 (1987) 报告应用胃蛋白酶 (Pepsin)20~100 μg/ml( 用 0.1n HCl 配 )37 30min 进行消化, 所获实验结果优于蛋白酶 K 蛋白酶 K 100ug 胃蛋白酶.2mg EDTA Na g 溶于 0.1mol 枸橼酸缓冲液 100ml( 灭活 RNA 酶的去离子水配制的枸橼酸缓冲液 ) 7, 组织细胞打孔液的配制 0.1mol 枸橼酸缓冲液.99.5ml 曲拉通 X ml 8, 杂交漂洗液 (a) 2Xssc, 0.2Xssc 缓冲液中加入 0.1% 的吐温 -20 为第一次洗涤液用于预杂交和杂交后 (b)2xssc, 0.2Xssc 缓冲液不加入吐温 -20 为第二次和第三次洗涤液用于预杂交和杂交后 (c)0.1mol PBS 缓冲液中加入 0.1% 的吐温 -20 为第一次洗涤液, 第二次和第三次洗涤液不加入吐温 -20 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD F6

7 (d)0.1mol TBS 缓冲液中加入 0.1% 的吐温 -20 为第一次洗涤液第二次和第三次洗涤液不加入吐温 , 过氧化氢封闭液 市售的过氧化氢浓度为 30%...10ml DEPC 灭活 RNA 酶的去离子水配制的 0.1mol PBS 定容至 100ml 注意 : 此液现用现配 10,4% 多聚甲醛的配制 4g 多聚甲醛定溶于 DEPC 饱和的双蒸水 100ml 中,50 度加热搅拌, 逐渐滴加 1N 氢氧化钠直至白色的多聚甲醛完全溶解,3 号定性滤纸过滤除沉淀备用 11, 细胞爬片的固定 ;37 度 0.01 mol PBS PH7.0 洗三遍置 37 度 PBS 中 分钟, 透析残留培养基 37 度 0.01 mol PBS PH7.0 洗三遍,4% 多聚甲醛固定细胞 ( 多聚甲醛需 0.01molPBS 配制 ) 室温 2 小时,0.01 mol PBS 洗三遍, 晾干 4 度保存两周 FISH 荧光原位杂交基本的实验方法 (mrna 和基因组 DNA) 基因组 DNA 荧光探针染色步骤 1, 细胞爬片 / 涂片 / 冰冻切片的复水 0.1mol 枸橼酸缓冲液浸泡冰冻切片室温 10 分钟使组织细胞恢复水性 2, 置打孔液中室温 10 分钟, 给细胞打孔以改变组织细胞的通透性使探针快速顺利的穿透细胞膜 0.1M PBS 冲洗三次 3, 50% 去离子甲酰胺 60 度 1 小时 2XssC 洗一次 2N 盐酸 30 分钟室温 PBS 洗 2 次后,95 度水浴加热 15 分钟 ( 置 0.1molPBS 中防止组织细胞干涸 ) 后, 迅速置于冰育防止 DNA 复性减低杂交信号 0.1M PBS 冲洗三次 4, 滴加复合消化工作液, 覆盖组织表面, 室温 分钟 ( 根据实验组织和实验的条件情况确定消化时间和温度, 需实验者摸索最佳条件 如条件成熟有利于杂交的顺利完成, 具体原理参照 组织细胞的通透性 和 复合消化液的配制 一章 0.1M PBS 冲洗三次 0.2Xssc 洗一次 ( 室温 3 分钟 ) 5, 滴加预杂交工作液覆盖组织 42 度湿盒孵育 4-8 小时, 注意盖上原位杂交专用盖玻片 ( 预杂交工作液反应时间, 需实验者摸索最佳条件, 如条件成熟有利于杂交后的背景降低 如预杂交工作液反应时间过长反而影响杂交信号 具体原理参照 预杂交原理 一章 6, 预杂交后的洗涤 揭去盖玻片以 0.2Xssc 室温洗三次, 每次洗涤 5 分钟 7, 滴加杂交工作液覆盖组织 42 度湿盒孵育 8-12 小时 注意 : 探针浓度和时间需实验者摸索最佳条件, 具体原理参照 探针浓度和杂交时间 一章 8, 杂交后的洗涤 揭去盖玻片以 2Xssc 37 度洗三次, 每次洗涤 5 分钟,0.2Xssc 37 度洗三次, 每次洗涤 5 分钟,0.1 mol TBS 37 度洗 3-5 次每次洗涤 5 分钟 9 荧光显色 - -- 甘油封片荧光显微镜下以激发光 nm 时观察到黄绿色荧光 如荧光强度或背景太亮时, 可以用 0.1mol PBS 多洗若干次 此荧光在 4 度避光时可以保存一年, 荧光不粹灭 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD F7

8 mrna 荧光探针染色步骤 ( 试剂配制的所有用双蒸水, 必须经 DEPC 72 小时,37 度饱和且高压消毒, 所有用具都须经,180 度 10 小时以上烘烤, 或高压灭菌 以防 RNA 酶降解阳性载体 ) 1, 细胞爬片 / 涂片 / 冰冻切片的复水 0.1mol 枸橼酸缓冲液浸泡冰冻切片室温 10 分钟使组织细胞恢复水性 2, 置打孔液中室温 10 分钟, 给细胞打孔以改变组织细胞的通透性使探针快速顺利的穿透细胞膜 0.1M PBS 冲洗三次 3, 滴加复合消化工作液, 覆盖组织表面, 室温 分钟 ( 根据实验组织和实验的条件情况确定消化时间和温度, 需实验者摸索最佳条件 如条件成熟有利于杂交的顺利完成, 具体原理参照 组织细胞的通透性 和 复合消化液的配制 一章 0.1M PBS 冲洗三次 0.2Xssc 洗一次 ( 室温 3 分钟 ) 4, 滴加预杂交工作液覆盖组织 42 度湿盒孵育 4-8 小时, 注意盖上原位杂交专用盖玻片 ( 预杂交工作液反应时间, 需实验者摸索最佳条件, 如条件成熟有利于杂交后的背景降低 如预杂交工作液反应时间过长反而影响杂交信号 具体原理参照 预杂交原理 一章 5, 预杂交后的洗涤 揭去盖玻片以 0.2Xssc 室温洗三次, 每次洗涤 5 分钟 6, 滴加杂交工作液覆盖组织 42 度湿盒孵育 8-12 小时 注意 : 探针浓度和时间需实验者摸索最佳条件, 具体原理参照 探针浓度和杂交时间 一章 7, 杂交后的洗涤 揭去盖玻片以 2Xssc 37 度洗三次, 每次洗涤 5 分钟,0.2Xssc 37 度洗三次, 每次洗涤 5 分钟,0.1 mol TBS 37 度洗 3-5 次每次洗涤 5 分钟 8, 荧光显色 - -- 甘油封片荧光显微镜下以激发光 nm 时观察到黄绿色荧光 如荧光强度或背景太亮时, 可以用 0.1mol PBS 多洗若干次 此荧光在 4 度避光时可以保存一年, 荧光不粹灭 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD F8

9 DIG( 地高辛 ) 标记的探针原位杂交基本的实验方法 一, 过氧化物酶显色系统 1, 石蜡切片脱蜡至水 : 二甲苯两次,10 分钟 / 次 ; 无水乙醇 10 分钟一次 ;90% 乙醇 10 分钟一次 ; 80% 乙醇 10 分钟一次 ;0.1M PBS 冲洗三次 ( 细胞爬片 / 涂片 / 冰冻切片可省去此步骤 ) 2, 置打孔液中室温 10 分钟, 给细胞打孔以改变组织细胞的通透性使探针快速顺利的穿透细胞膜 0.1M PBS 冲洗三次 3, 置过氧化氢封闭液室温 20 分钟, 以封闭内源性过氧化氢酶 0.1M PBS 冲洗三次 4, 滴加复合消化工作液, 覆盖组织表面, 室温 分钟 ( 根据实验组织和实验的条件情况确定消化时间和温度, 需实验者摸索最佳条件 如条件成熟有利于杂交的顺利完成, 具体原理参照 组织细胞的通透性 和 复合消化液的配制 一章 0.1M PBS 冲洗三次 0.2Xssc 洗一次 ( 室温 3 分钟 ) 5, 滴加预杂交工作液覆盖组织 37 度湿盒孵育 1-2 小时, 注意盖上原位杂交专用盖玻片 ( 预杂交工作液反应时间, 需实验者摸索最佳条件, 如条件成熟有利于杂交后的背景降低 如预杂交工作液反应时间过长反而影响杂交信号 具体原理参照 预杂交原理 一章 6, 预杂交后的洗涤 揭去盖玻片以 0.2Xssc 室温洗三次, 每次洗涤 5 分钟 7, 滴加杂交工作液覆盖组织 37 度湿盒孵育 4 小时以上 注意 : 探针浓度和时间需实验者摸最佳条件, 具体原理参照 探针浓度和杂交时间 一章 8, 杂交后的洗涤 揭去盖玻片以 2Xssc 37 度洗三次, 每次洗涤 5 分钟,0.2Xssc 37 度洗三次, 每次洗涤 5 分钟,0.1 mol TBS 37 度洗 3-5 次每次洗涤 5 分钟 9, 滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液 ( 现用现配 ) 小鼠抗地高辛生物素标记抗体浓缩液...10ul 抗体稀释液 ul 至 990ul( 抗体浓度根据杂交信号确定 ) 覆盖组织 37 度湿盒孵育 分钟 0.1M PBS 冲洗三次, 每次洗涤 5 分钟 10, 滴加高敏过氧化物酶链亲和素复合物工作液 ( 现用现配 ) 滴加高敏过氧化物酶链亲和素复合物浓缩液...10ul 抗体稀释液 ul 至 990ul( 抗体浓度根据杂交信号确定 ) 覆盖组织 37 度湿盒孵育 45 分钟 0.1M PBS 冲洗三次, 每次洗涤 5 分钟 11, DAB 显色, 光学显微镜下观察至细胞内胞浆阳性颜色与细胞外背景颜色对比度反差明显时蒸馏水洗终止反应 细胞浆显棕黄色颗粒为阳性反应 苏木素复染, 胞核为蓝色 12, 80>90%> 无水乙醇 > 二甲苯脱水, 每步须 3-5 分钟, 中性树胶封片保留 二, 碱性磷酸酶显色系统 步骤同过氧化物酶系统步骤, 但在以上第 3 步置过氧化氢封闭液省去, 第 10 步为滴加高敏碱性磷酸酶链亲和素复合物工作液, 稀释方法也相同 第 11 步显色剂为 NBT/BCIP 阳性成蓝紫色颗粒反应复染剂为核固红, 胞核为红色 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD F9

10 免疫组化的病理制片技术的规范 一 H-E 技术操作规范 1. 及时固定组织 : 应采用 10%~20% 甲醛液 (10% 甲醛液即用浓甲醛液 1 份加蒸馏水 9 份稀释 ) 固定组织, 因甲醛易氧化成甲酸, 因此多会偏酸性, 最理想的是配成中性甲醛液 巨大组织要切开固定, 小块组织的固定时间约 4 小时左右, 然后取材时修切成大小约 22 x 22mm, 厚不超过 2mm 的组织块进行脱水 取材时必须注意核对编号是否与送检单上的病理号一致, 并记录好对大体标本的描述, 取材组织的形状和数量 细胞爬片的固定 ;37 度 0.01 mol PBS PH7.0 洗三遍置 37 度 PBS 中 分钟, 透析残留培养基 37 度 0.01 mol PBS PH7.0 洗三遍,4% 多聚甲醛固定细胞室温 2 小时,0.01 mol PBS 洗三遍, 晾干 4 度保存两周 2. 脱水彻底 : 脱水液常用乙醇, 用乙醇脱水要由低浓度逐级上行至高浓度 ( 一般 70%~100% 的浓度 ), 逐步置换组织内的水份 组织在乙醇脱水时, 低浓度乙醇的时间可适当延长, 高浓度乙醇脱水时间不能过长 3. 透明充分 : 透明液多采用二甲苯, 组织脱水后转入二甲苯, 依据组织的大小 厚薄, 约置 30~90 分钟 4. 浸蜡足够 : 浸蜡多用纯净而熔点稍低 (56~58 度 ) 的石蜡, 浸蜡时采用三级或四级, 以尽量清除二甲苯 浸蜡时间依据组织大小厚薄而定, 一般为 1~2 小时 浸蜡时包埋机所设定的温度应比所用石蜡熔点稍高以保持石蜡恰在熔溶状态 这样, 组织才能取得良好的浸蜡效果 如浸蜡温度过高, 导致组织收缩, 变硬变脆, 难以切出理想切片 5. 包埋恰当 : 包埋时, 包埋石蜡的温度要比组织高 ( 约 3~5 度 ), 否则包埋冷凝后组织与包埋石蜡分离, 特别是在冷天包埋时, 动作更要迅速, 否则容易导致组织与石蜡融合不好, 影响切片 包埋是时把组织最大最平切面或所需是病灶切面向下, 对皮肤 肠管和囊壁等层次清楚的组织其切面应包含有各层组织 组织包埋完后, 要与取材时记录的组织形状和数量核对, 发现问题, 及时解决 6. 切片要薄 : 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD F10

11 要把刀架上的切片清除角调至 2~5 度, 在此角范围内, 才能切出良好蜡片 使用一次性刀片, 可转动刀座上的弧形刻度盘选取最合适的刻度 ( 该合适刻度并不等于真正的切片清除角 ) 切片前要把切片机上有关的各螺旋拧紧, 如没有拧紧或包埋少组织蜡块过硬时就会出现跳片, 使蜡片成一截厚一截薄 切片的厚度应为 3~4μm, 对一些组织如淋巴结 鼻咽和扁桃体, 切片的厚度应为 2~3μm 7. 贴片烤片 : 切出的蜡片应放在恒温贴片盆内展开, 并根据所用包埋石蜡的温度调节水温在 42~46 度左右 为了利于展平蜡片, 可先把蜡片放在一缸缸约 10~15% 乙醇内, 然后用玻片再将蜡片移至恒温贴片盆, 由于水的表面张力比乙醇大, 蜡片由乙醇移至水后就很容易展平 贴片时再注意 定点 和 定向 最后即可置入约 60~65 度的烤片箱内烤 15~30 分钟, 也可放在热板上烘干, 蜡片就可牢固地粘附在载玻片或盖玻片上 8. 切片在染色前必须脱蜡干净 : 未完全脱蜡的组织切片, 染色后组织和细胞模糊不清 脱蜡要用两级或三级脱蜡剂如二甲苯, 时间为 10~20 分钟, 应视所用二甲苯的新旧以及室温情况而定 脱蜡时间宁可长些, 不应过短 9. 苏木素染液一定要配好 : 苏木素液配制的好坏, 决定染色的优劣 苏木素配制有多种配方, 关键在于氧化 如加氧化汞作氧化剂时, 要防止氧化过度, 同时注意形成的氧化膜污染切片 加碘酸钠作氧化剂时, 就无需把苏木素液煮沸 要配制自然成熟的苏木素则不需加氧化剂, 但要较长时间才能氧化成熟 不同苏木素染液的染色时间为 5~20 分钟, 自然氧化成熟的苏木素液染色时间可以更长 10. 掌握好盐酸酒精的分化 : 这是一个重要环节 分化时间的长短视组织的性质, 切片的厚薄, 苏木素染色的深浅来决定, 一般是 1~2 秒, 若切片不分化或分化不足, 组织着色过深使核浆的景界不清楚 ; 若分化过度, 胞核过淡不清晰 用 Mayer`s 苏木素染色, 通常都不分化 盐酸酒精分化后, 切片留有酸液, 易使切片褪色 另一方面苏木素经流水冲洗来促兰 流水冲洗一般需 15~30 分钟 如要说短时间, 可用碱性的促蓝液代替流水冲洗 11. 曙红染色要适宜 : 曙红是作为对比染色, 染色时不应染的太红, 也不能染得太淡, 否则红兰对比不鲜明 每 200ml 曙红水溶液加一滴冰醋酸可起促染作用, 如加酸太多, 可使曙红沉淀而慢慢失效 曙红水溶液易发霉, 每缸曙红液加入甲醛液 1~2 滴有防霉作用 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD F11

12 12. 切片脱水透明要彻底 : H-E 染色后, 要彻底脱水透明, 才能进行树胶封盖, 成为永久标本 如果脱水透明不彻底, 封片后呈白色雾状, 镜下模糊不清, 过一段时间染片就褪色 脱水要经过多次无水乙醇, 也可使用石炭酸二甲苯进行脱水 如采用后者, 染片要经过多次二甲苯以除去石炭酸 13. 封胶要求中性, 浓度适宜 : 酸性的树胶可使胞核褪色, 如树胶放置时间过长, 因氧化而变酸 国产树胶偏酸, 易使切片褪色 树胶过浓, 封片时容易导致气泡, 树胶过稀, 封片时使胶外溢, 影响美观 14. 在整个染色过程中不让切片干涸 : 切片完全干涸, 会使组织收缩 割裂, 形成所谓 龟裂 现象 也会使部分细胞核透明不良, 看起来像黑色的细胞核 H-E 切片的质量要求一张高质量的 HE 切片要做到 : 1. 切片完整 贴片恰当 2. 切片较薄而均匀 3. 无皱折 4. 无刀痕 5. 染色清晰 核浆分明 透明度好 6. 无固缩 龟裂 污染 7. 封胶适当 玻片清洁 8. 字体端正 号码清楚二 组织化学技术操作规范组织化学技术制片与一般的制片基本相同, 但在操作上有其特殊的要求 ( 一 ) 组织化学技术对组织细胞前处理的要求 1. 组织切片方法根据所检测物质的性质及所采用的染色方法, 组织切片分为冷冻切片和石蜡切片 ( 培养的细胞也可分为细胞涂片 细胞冷冻切片和细胞石蜡切片 ) 在冷冻切片中, 组织细胞的各种成份丢失最少, 但形态结构差, 可溶性物质弥散 ; 石蜡切片中组织细胞的许多特殊物质减少甚至丢失, 酶活性降低甚至失去活性, 但形态结构好, 所需显示的物质定位清晰 2. 组织的固定无论用于冷冻切片的组织, 取材越新鲜越好, 以保持生物体的原状, 使细胞内的化学成份尽可能保存下来 组织取材后应立即进行冷冻切片, 切片可于 -20 度或 -80 度保存 若作 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD F12

13 石蜡切片, 组织取材后即进行固定, 因所检测的物质不同选用不同的固定液及固定时间 最常用的固定方法是用固定液浸泡组织 固定液有多种, 不同的固定液具有不同的作用, 至今还没有一种固定液能用于所有染色的组织固定, 最常用 用途最广的是甲醛液 欲保存固定肝糖原则不能用甲醛固定液, 需要用酒精固定液, 如,Gender 或 Cranky 氏固定液 在组织固定过程中, 不能溶解细胞内的化学物质, 使所显示的物质不会出现移位现象, 定位准确 如用酒精性固定液固定肝糖原, 会将糖原颗粒推向细胞的一边, 称为 极化现象, 属于一种人为改变, 对定位有影响, 在观察时应注意 ( 二 ) 组织化学染色方法的基本要求 1. 组织化学染色方法要有较高的特异性, 能特异地显示所需要观察的物质组织化学染色与常规 HE 染色不同, 每种组化反应都需要某种特殊的染料 试剂或底物, 需要一定的染色时间和 ph 环境, 使该反应对所显示的物质具有一定的专属性 在染色的操作过程中, 应采用已知含有或不含有所显示的物质的标本进行阳性和阴性对照, 以证实该方法的特异性和操作的准确性 2. 组织化学染色方法要具有一定敏感性, 方法越是敏感, 越能检测组织细胞中含量少的物质 3. 组织化学染色在组织或细胞内所产生的反应产物必须具有一定的颜色, 该颜色越鲜艳 越深越好 显示一种物质可有不同的染色方法, 阳性反应有不同的颜色, 选用的方法应使阳性物颜色鲜艳, 深色, 而复染的底色要浅淡, 这样对比才清晰, 易于观察及照相 4. 组织化学染色最后显示出来的物质要具有稳定性, 尽可能不被制片过程中所用的化学试剂所影响 在染色过程中, 避免使用减弱 破坏或溶解阳性物的试剂 如, 着染苏丹的脂肪要用水溶性胶封片, 不能经二甲苯透明和中性树胶封片 组织化学技术的某些方法还存在着不能完善的地方, 如要保持较好的组织细胞形态结构, 使被检测的物质定位准确, 则需要用石蜡切片染色, 但组织在制作石蜡切片的固定 脱水和包埋过程中, 被检测的物质会受到破坏甚至消失 如在石蜡切片中, 肾组织的酸性磷酸酶活性仅保留 20%; 心肌的琥珀酸脱氢酶则全部失去活性 在肝糖原染色中用 10% 甲醛液固定肝组织可使肝糖原完全溶解消失, 改用酒精性固定液可保存肝糖原, 但由于固定液渗透作用, 使肝糖原颗粒出现移位 极化现象 用冷冻切片可保存大量的酶, 糖原丢失极少, 又不会出现 极化现象, 但组织形态结构及阳性物质定位较差 此外, 冷冻切片容易出现冰晶, 破坏原有的组织结构, 影响观察 有些存在于组织细胞中的化学物质较为复杂, 往往需要用多种染色方法来进行鉴别, 如用 AB(PH2.5) 法可显示一般的粘液 ; 要区分中性和酸性粘液需要用 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD F13

14 AB-PAS 染色法 ; 酸性粘液中要区分硫酸粘液和唾液酸粘液要用 HID-AB 染色法 免疫组织化学技术操作规范 ( 一 ) 组织切片的要求免疫组织化学技术适用于冷冻切片和石蜡切片, 部分抗体只能用于冷冻切片, 大部分抗体可用于石蜡切片, 适用于石蜡切片也适用于冷冻切片 冷冻切片能很好地保存组织抗原, 抗原丢失少, 但形态结构差, 定位不很清晰 ; 石蜡切片组织形态结构好, 定位清晰, 但在组织的固定脱水包埋过程中容易破坏组织抗原, 使抗原的免疫活性有所降低 ( 二 ) 组织的固定组织经过固定可保存组织原有的形态结构, 防止组织抗原弥散, 常用的固定液为 10% 甲醛液, 最好选用 10% 中性甲醛液, 固定时间为 4~6 小时 固定时间不足, 组织结构不佳, 组织抗原弥散 ; 固定时间过长, 可封闭或破坏组织抗原 ( 三 ) 载玻片的处理组织切片贴在载玻片上进行免疫组织化学染色, 由于染色工程操作步骤及冲洗次数较多, 容易出现脱片现象, 因此将载玻片涂胶或硅化是必要的 较常用较好的是采用 APES 硅化玻片 ( 四 ) 组织切片前处理 ( 免疫组化组织通透性的改变和修复, 以便充分暴露抗原 ) 经甲醛液固定, 石蜡包埋的组织在固定过程中, 组织中的抗原蛋白与甲醛产生交联, 使得组织中抗原的决定簇被封闭, 抗体难以和抗原充分结合 因此要进行组织切片前处理, 目的是打开组织抗原蛋白与甲醛的交联, 暴露组织抗原, 以提高组织抗原的检出率 组织切片前处理 ( 也称抗原修复 ) 常用的主要有以下方法 : 1. 胰蛋白酶消化 : 将切片置入胰蛋白酶消化液 ( 0.2% 胰蛋白酶, 0.1% 氯化钙水溶液 ph 7.8) 消化 30 分钟,37 2. 微波加热 : 将切片置入 0.01 mol/l 柠檬酸缓冲液 (ph6.0) 内, 用微波炉最大功率加热 10 分钟, 自然冷却 3. 水煮法 : 将切片置入蒸馏水内, 加热至沸腾持续 10 分钟, 自然冷却 4. 高压锅加热法 : 用高压锅加热 0.01 mol/l 柠檬酸缓冲液 (ph6.0) 至沸腾, 放入切片, 盖紧高压锅盖, 继续加热至减压阀喷气, 计时 90 秒钟至 2 分钟, 自然冷却 5. 联合处理法 : 按上述方法先进行胰蛋白酶消化, 然后再进行水煮法或微波加热法或高压加热法 是否进行切片前处理要按第一抗体说明书的要求, 切片前处理通常可以提高免疫组化染色的阳性率, 但并非所有的抗体染色均需要前处理 切片前处理不当会出现 : 假阳性 假阴性或阳性定位改变 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD F14

15 ( 五 ) 内源性过氧化物酶的消除组织中的粒细胞 单核细胞及红血球等存在内源性过氧化物酶, 可与显色剂 DAB AEC 起反应而造成假阳性, 因此, 在显色前要把这些内源性过氧化物酶消除, 方法是用 3% 过氧化氢 ( 用 % 甲醇配 ) 作用 15 分钟 操作可以在加一抗之前也可以在加一抗之后 ( 六 ) 内源性生物素的消除组织细胞中存在着内源性生物素, 在应用与卵白素结合或生物素标记抗体的免疫组化检测系统检测组织细胞中的抗原时, 内源性生物素容易与 ABC 法中的卵白素 (avidin) 或 S-P (LSAB) 法中的链霉菌抗生物素蛋白 (streptavidin) 结合, 引起假阳性 因此在加一抗之前或在加一抗之后需要消除内源性生物素 消除内源性生物素的方法有 :(1) 用鸡蛋清或卵白素封闭 (2) 采用不含卵白素或生物素的免疫组化检测系统检测如 Envision/Elivision 二步法和 EPOS 一步法等 ( 七 ) 高敏感免疫组化染色方法的选用免疫组织化学技术的特点之一是敏感性高, 就是能把抗原抗体结合物特异性地放大 目前, 免疫组化染色方法有一步法, 二步法和三步法 一般来说, 抗体与抗体的连接步骤少, 特异性高, 敏感性低 ; 反之, 连接步骤多, 特异性低, 敏感性高 但是, 不同公司生产的试剂盒, 技术由于不断地改进和提高, 在特异性和敏感性方面各有特点 各实验室可以根据自己的实际情况对照比较, 合理选用 目前应用最广泛的是 S-P(LSAB) 三步法和 Envision / Elivision 二步法 同一种染色方法, 因检测试剂盒的不同其敏感性不同, 第一抗体的稀释度也不同 ( 八 ) 酶标抗体系统中的酶与显色剂在 LSAB 等常用免疫组化方法中, 与抗体连接的酶主要有辣根过氧化物酶 (HRP) 和碱性磷酸酶 (AP), 显色剂有 DAB AEC 固红和固蓝等 在 HRP 系统用 DAB 和 AEC 等作显色剂, DAB 显色阳性物呈棕色,AEC 呈红色 ;AP 系统用 NBT/BCIP, 固红和固蓝作显色剂, 固红显色阳性物呈红色, 而固蓝呈蓝色 DAB 显色形成的沉淀物最稳定和不易褪色, 较为常用, 用其是致癌物, 故要避免接触皮肤和污染环境 ( 九 ) 实验对照为证实抗体和检测试剂盒效价是否可靠, 染色操作是否正确, 一般需要进行实验对照, 以避免试剂失效或操作失当而出现假阴性和假阳性, 确保染色结果的可靠性 1. 阳性对照 : 选用已知染色中度阳性以上的组织切片染色, 阳性切片应呈阳性, 此外组织中的内对照也是很好的阳性对照 初学者应设阳性对照 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD F15

16 2. 阴性对照 : 选用已知染色阴性的组织切片染色, 其结果应为阴性, 一般来说, 阴性对照和阳性对照同时进行, 或其中有阳性染色结果时才有意义 ( 十 ) 抗体的保存和稀释抗体应于低温保存, 第一抗体可分成少包装于 -20 度保存, 使用时存放在 4 度, 不宜反复存放于 4 度和 -20 度之间 检测试剂盒一般存放于 4 度, 不宜于 -20 度保存, 如长时间不用可存放于 -20 度, 解冻使用后则不能再存放于 0 度以下, 因为反复冻融使得与抗体结合的酶容易分解, 导致检测的敏感度降低 浓缩的抗体在染色前应根据说明书要求或自行摸索出的最佳工作浓度进行稀释 日常工作量不多时, 可将抗体稀释至 1:5~20, 染色前再稀释成工作液 浓缩液抗体保存的时间较长, 反之稀释后的抗体保存的期限较短, 如使用即用型抗体, 经过一定时间后应注意其效价时否有所降低, 避免出现假阴性染色 抗体稀释液可用 0.01mol/L PBS ph7. 4, 在 PBS 中加入 1%BSA 和 1% 正常稀释后的稀释抗体, 对减轻非特异性背景染色有所帮助 ( 十一 ) 染色结果的观察阳性结果应定位在细胞中相应的部位, 在细胞膜表达的抗原阳性结果应定位在细胞膜上, 在其他部位的阳性反应均为非特异性染色 不当的抗原修复会导致抗原在组织细胞中定位的改变 根据所检测抗原的不同, 抗原分别定位在 :(1) 细胞膜, 如 LCA 和 UCHL1 等 ;(2) 细胞质, 如 Keratin 和 Lysozyme 等 ;(3) 细胞核, 如 PCNA 和 ER 等 ( 十二 ) 免疫组织化学染色后的对比染色背景免疫组织化学染色后需要对比染色细胞核, 以将组织细胞结构显示出来, 使免疫组织化学染色结果定位清晰 免疫组织化学染色结果根据显色剂的不同而不同, 有棕色 蓝色和红色, 对比染色细胞核的颜色也因染液不同而不同, 一般有蓝色 ( 苏木素 ) 绿色( 甲基绿 ) 和红色 ( 核固红 ) 三种 应根据颜色对比清晰的原则进行搭配, 常用的是 DAB 显色呈棕色 Mayer`s 苏木素复染细胞核呈蓝色 ( 十三 ) 染色操作注意事项 1. 石蜡切片脱蜡要彻底 2. 第一抗体分为单克隆 ( 鼠抗 ) 和多克隆 ( 兔抗 ) 抗体, 检测试剂盒中的第二抗体也有分为抗鼠和抗兔抗体, 不能连接错, 否则一抗 二抗连接不上而导致假阴性的染色结果 最好比选用即是抗鼠又是抗兔的抗体 3. 抗体孵育时间随孵育温度升高而减少, 但一般不超过 37 度 一般一抗置于 4 度孵育过夜较佳 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD F16

17 4. 滴加抗体应完全覆盖组织, 避免引起组织边缘效应 5. 由于一种染色方法, 因试剂盒的不同其敏感性不同, 第一抗体的稀释度也不同 6. 不当的组织切片前处理有可能出现假阳性或假阴性的结果 7. 组织的周边 刀痕 皱折等部位往往呈阳性反应, 但绝大多数都是非特异性染色 8. 染色结果呈阴性并非都是抗原不表达, 要考虑是否与组织中的抗原受到破坏有关 9. 组织切片背景深与下列因素有关 : (1) 第一抗体浓度太高或孵育时间过长, 温度过高 (2) 显色剂 DAB 浓度过高或 H2O2 太多 (3) 正常血清封闭之后 滴加第一抗体之前用了 PBS 洗 (4) 抗体纯度不高 (5) 抗体孵育切片后冲洗不干净 ( 十四 ) 抗体的保存和稀释抗体应于低温保存, 第一抗体可分成小包装于 -20 保存, 使用时存放在 4, 不宜反复存放于 4 和 -20 之间 检测试剂盒一般存放于 4, 不宜于 -20 保存, 如长时间不用可存放于 -20, 解冻使用后则不能再存放于 0 以下, 因为反复冻融使得与抗体结合的酶容易离解, 导致检测的敏感度降低 浓缩的抗体在染色前应根据说明书要求或自行摸索出的最佳工作浓度进行稀释 日常工作量不多时, 可将抗体稀释至 1:5-20, 染色前再稀释成工作液 浓缩液抗体保存的时间较长, 反之稀释后的抗体保存的期限较短, 如使用即用型抗体, 经过一定时间后应注意其效价是否有所降低, 避免出现假阴性染色 抗体稀释液可用商品化的抗体稀释液, 也可以用 0.01mol/L PBS( ph7.4), 在 PBS 中加入 1%BSA 和 10% 正常血清后稀释抗体, 对减轻非特异性背景染色有所帮助 免疫组化异常染色结果的评价良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的前提 由于免疫组化染色过程中存在很多步骤, 每一个步骤都可能影响到染色的最终结果, 因此, 要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事 虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题, 但从染色的结果看, 一般可分为两类 : 无色片 ( 即无阳性信号 ) 和 噪音 染色片 ( 有阳性信号 ) 一 无色片染色结束后, 切片中见不到任何阳性信号 这是常规工作中比较常见的现象, 出现这种现象, 有两种可能 : 1. 真阴性结果 : 整个染色过程没有出现问题, 组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD F17

18 2. 假阴性结果 : 即此阴性结果不是真实的反映 假阴性结果又可分为两种情况 : (1) 切片中根本就不包含所预期检测的组织或细胞 出现这种情况, 要么是选择错了切片或抗体选错了 (2) 染色过程中的某一或某些环节出了问题 比如, 组织未进行抗原修复, 有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达 ; 或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体 ; 或一抗失效, 虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程, 但偶尔也遇到突然失效的情况, 抗体长期不用和 / 或已超过有效期是主要的原因 也可见于染色过程中漏掉了某一环节, 如忘记加二抗或三抗, 或用了两次二抗而缺少了三抗, 或配制 DAB 时没加过氧化氢 解决上述问题的唯一办法是写好实验记录 解决阴性染色的问题非常简单, 就是设立 阳性对照 如果阳性对照有了表达, 说明染色的全过程和所有试剂都没有问题 如果此时测试片仍为阴性, 便是真实的阴性, 说明组织或细胞没有相应的抗原表达 反之, 如果阳性对照没有着色, 表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题 应一一寻找原因 阳性对照包括两种, 一种称为 自身对照 或 内部对照, 这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原, 如正常淋巴结中存在 T 和 B 细胞抗原,CD20 或 CD3 都应该有表达 自身对照是一种比较理想的对照, 对照和测试组织或细胞都在同一张切片中, 都处于相同的试验条件下, 结果更可靠也更具有可比性 在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分, 这样有利于对比 另一种称为 外部对照, 有时在测试的切片中不存在已知的抗原, 如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤, 需要用 HMB45 或 Mart-1 来检测, 在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原, 如果病变出现阳性反应结果, 尚能提示是恶黑, 但是如果出现阴性结果, 就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原, 还是技术问题 因此, 应另外设立一个已知的阳性对照 这种在测试组织之外的阳性对照称为 外部对照 在实际工作中需要设立外部对照的情况很多, 如果每一种抗体都要选不同的阳性对照, 工作量会很大 为了解决这个问题, 目前国内外有单位将多种不同组织集成在一起, 制成多组织切片 腊肠 春卷 切片 组织芯片等, 其连续切片储备待用, 需要时取出一张便可作为阳性对照 另外, 比较简单的方法, 是采用阑尾作为阳性对照, 因为与人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多, 如有上皮 淋巴组织 平滑肌 间质 神经 血管 间皮等 一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体 抗体未覆盖上测试组织 : 当多块散开的小组织染色时, 可能漏掉某块组织染色 二 噪音 染色片免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色, 这些非正常的着色 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD F18

19 称为 噪音 染色 噪音 染色种类繁多, 产生的原因也多种多样 1. 整片着色整片着色是指整个切片全都染上了颜色, 着色的强度可深可浅, 总之, 分不清那些组织是阳性那些组织是阴性 出现这种现象的原因有 :(1) 抗体浓度过高 : 一抗浓度过高是常见的原因之一 解决办法是, 每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试, 使每一抗体个体化, 找到适合自己实验室的理想工作浓度, 既使是即用型的抗体也应如此, 不能只简单的按说明书进行染色 (2) 抗体孵育时间过长或温度较高 : 解决办法是, 严格执行操作规程, 最好随身佩带定时器, 及时提醒, 避免因遗忘而造成时间延长 现在流行的二步法 (Polymer) 敏感性很高, 要求一抗孵育的时间不是传统的 1 小时, 而是 30 分钟, 因此, 要根据染色结果进行调整 (3)DAB 变质和显色时间太长 :DAB 必需现用现配, 如有沉渣应进行过滤后再用 配制好的 DAB 不应存放时间太长, 因为在没有酶的情况下, 过氧化氢也会游离出氧原子与 DAB 产生反应而降低 DAB 的效力, 剩余的 DAB 应进行无毒处理后废弃, 不要再次使用 DAB 的显色在显微镜下监控, 达到理想的染色程度时立即终止反应, 切片多时要严格控制每张切片的显色时间 避免 DAB 显色时间过长 (30 分为宜 ) (4) 组织变干 : 修复液溢出后未及时补充液体 染色切片太多 动作太慢 忘记滴液 滴液流失等都是造成组织变干的原因 解决的办法是操作要认真仔细, 采用免疫组化笔如 DAKO 笔或 PAP Pen 或指甲油或树胶在组织周围画圈, 可以有效的避免液体流失, 也能提高操作速度 (5) 切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长 ( 大于 24 小时 ) (6) 一抗失效 质量差的多克隆抗体 : 注意抗体的有效期, 过期的抗体要么不显色要么背景着色 用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较 2. 切片边缘着色切片边缘着色 ( 边缘效应 ) 也是一种常见的现象 主要原因有 :(1) 组织边缘与玻片粘贴不牢, 边缘组织松脱漂浮在液体中, 每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致 解决办法 : 制备优质的载玻片 ( 如用 APES 或多聚赖氨酸 ), 切出尽量薄的组织切片, 不厚于 4 微米, 组织的前期处理应规范, 尽量避免选用坏死较多的组织 (2) 切片上滴加的试剂未充分覆盖组织, 边缘的试剂容易首先变干, 浓度较中心组织高而致染色深 解决办法 : 试剂要充分覆盖组织, 应超出组织边缘 2 mm 用免疫组化笔时, 为了避免油剂的影响, 画圈应距组织边缘 3-4 mm 3. 阴阳脸 着色指组织一半着色一半无着色, 形成交界清晰或不甚清晰的两种染色结果 其成因是试剂仅覆盖了部分组织而不是全部 如加试剂后未让试剂流散开而集中在部分组织上 通常应该 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD F19

20 在加完试剂后, 仔细看一遍, 是否有的组织未被试剂完全覆盖, 如有这种情况, 用吸头将试剂水平引流开使之将组织全部覆盖 另外, 染片盒不平, 切片倾斜, 虽然开始试剂已全部覆盖了组织, 但后来试剂流向一边, 部分组织未被试剂覆盖 对于这种问题, 只要留心或想到了很容易发现, 也很容易解决 有时, 用免疫组化笔画圈时, 划线太靠近或画到了组织上, 由于笔油的力学原理, 试剂不能达到靠近划线附近的组织 还有气泡也可引起阴阳分明的着色, 只是不着色区域是圆形, 由于气泡中含气, 试剂被推到周围, 因此, 气泡中心的组织不着色 解决办法是滴加试剂时手法要轻, 有气泡时用吸头捅破 4. 灶片状着色切片中着色区东一块西一块, 呈灶片状分布, 出现这种问题的原因有 :(1) 裱片时水未排尽, 在局部形成气泡使组织突起, 染色时试剂渗入后不易洗尽, 显色过深所致 解决办法是, 漂片盒里的气泡应去尽, 晾片热台不能平放, 应有 45 度左右的斜度, 利于水流走和蒸发 (2) 坏死组织灶, 组织坏死后细胞破坏 酶的释放 蛋白游离 分解, 复杂的肽链残段 ( 如 Fc 段 ) 可能与一抗或 / 和二抗结合导致最终着色 解决办法是在选择染色切片时应避免选择坏死组织较多的切片 (3) 制作 APES 胶片时, 胶的浓度太高, 干燥后在玻片上留下白色小点, 显色时白色小点着色 5. 间质着色着色部位主要在间质, 间质着色的原因很多, 如抗体与组织中的蛋白质因蛋白疏水基团相互作用形成非特异性的连接而着色, 加一抗前的血清封闭这一步就是为了避免非特异型的结合 又如血清中的免疫球蛋白常常渗出到组织间质, 很容易与抗体结合, 造成间质着色, 特别是 lambda 和 kappa 染色时 当甲状腺胶质外溢到组织间质时, 做甲状腺球蛋白染色也会出现间质着色 抗体不纯或抗体被污染也可出现间质着色, 我们曾遇到 CD20 抗体不纯, 除了染上 B 细胞外还染上了间质 6. 细胞浆着色胞浆着色是所有 杂音 染色中最具有欺骗性的着色, 着色区局限在细胞内, 间质无着色, 看上去与真实的免疫反应着色几乎一样, 很难区别 胞浆里含有较多的蛋白质, 因此, 很多非特异性的染色除了见于间质也可以出现在胞浆中 这种原因造成的着色, 可以通过血清封闭解决 还有因内源酶造成的着色, 如血红蛋白 ( 红细胞 ) 肌红蛋白( 肌细胞 ) 细胞色素 ( 粒细胞 单核细胞 ) 过氧化氢酶( 肝 肾 ), 这些可用过氧化氢进行封闭 巨噬细胞吞噬各种抗原物质或 Fc 片断而出现胞浆着色, 这种着色不易避免, 但可以通过形态学辨认出巨噬细胞而引起重视 内源性生物素的着色最具有欺骗性, 因为它广泛的存在于组织细胞中, 我们研究结果显示 : 冰冻组织中存在内源性生物素, 经福马林固定石蜡包埋后生物素被封闭, 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD F20

21 加热抗原修复后造成内源性生物素暴露, 内源性生物素暴露的强度在不同的组织有所不同, 从弱阳性 (+) 到强阳性 (+++), 内源性生物素在组织中的分布形式, 既有散在分布也有弥漫分布, 主要以颗粒状形式存在于胞浆中, 内源性生物素广泛存在于上皮源性组织, 特别是腺上皮组织, 亦存在部分非上皮组织, 内源性生物素不仅存在人体组织也存在大鼠组织, 内源性生物素暴露的强弱与修复液有关, 其强度增加依次为 : 柠檬酸 EDTA EGTA, 热抗原修复暴露的内源性生物素可被鸡蛋清封闭, 非生物素检测系统 Polymer 两步法 (EliVision EnVision) 可避免生物素干扰 7. 细胞核着色不适当的组织处理可以出现细胞核着色, 如组织在二甲苯里浸泡时间太长 ( 如从星期五浸泡到下星期一 ) 缓冲液中浸泡时间太长 组织变干 微波修复液的 ph 值和修复时间不当或修复过程中修复液留下得太少, 未没过组织等 解决办法是严格按照操作常规进行工作 操作规范规范化操作是病理制片质量的保证, 而量化的管理增加了病理制片质量的稳定性 所谓规范化, 就是在操作过程中, 对使用试剂种类 ph 值 浓度 温度 时间以及操作的手法都有详细的规定, 尽可能的减少人为的影响, 减少变量, 减少影响制片质量的条件 特别是在做分子技术时, 更应严格按操作规则做 所谓量化, 就是把以前经验的东西用量来判定 比如说我们更换脱水试剂, 一般都是要等组织不好切了才换, 这样总有几天片子质量不好 ; 也有的是几天到了就换, 组织多时脱水液的水份就多, 后面几天可能组织就脱不好 ; 组织少了脱水液倒了很浪费, 我们通过几年的实验, 发现组织的量和试剂的更换时间有一定的规律, 用量来控制脱水的更换时间更具科学性 还有苏木素 伊红也是如此 要想搞好制片质量, 各地必须建立质控组织, 通过技术交流和行政监督的手段, 促进病理技术的发展, 做好每一步 例如常规切片的注意事项 : 1. 取材取材的好坏, 直接影响切片的质量 取材时, 首先要有一把锋利的取材刀, 在切割组织时要避免取材刀来回拖拉, 切取的组织块厚薄要均匀, 一般厚度以 0.2 ~0.3cm 为适, 较容易发脆的组织如甲状腺 肝脏 血块 淋巴结 大块癌组织等可适当厚一点, 而脂肪组织 肺组织 纤维性肿瘤 平滑肌瘤等致密的或试剂不易渗入的组织应取薄一些 ; 淋巴结应修掉两侧球冠, 并尽量剔除周围的脂肪组织 在取材中还应十分注意组织内是否有缝线或骨组织, 如碰到不可避免的钙化组织, 应与技术室讲明, 在切取纤维组织 肌肉组织 胃肠道时, 应注意纤维及肌肉的走向, 取材时尽可能按与纤维平行走向切取为佳 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD F21

22 2. 固定固定是工作的第一步, 也是在整个制片过程中无法补救的一步 所谓 固定, 就是组织离体后, 用各种办法使其细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构和位置的过程 固定的目的是为了防止组织细胞自溶与腐败, 防止了细胞内的酶对蛋白质的分解作用, 使细胞内的各和成分如蛋白质 脂肪 碳水化合物或酶类转变为不溶性物质, 以保持原有的结构与生活时相仿 另外, 组织固定后, 均呈一定的硬化状态, 增加组织韧性, 而且不易变形, 有利于以后的组织处理 所以组织一旦离体必需及时固定, 固定液的量应为组织的 5 倍 固定的关键主要与固定的及时性 固定液的选择 固定液的浓度 固定的温度和时间有关 最常用的固定液为 10% 福尔马林 10% 福尔马林由于受到福尔马林的质量 使用时的挥发和取材时带入的水分影响, 浓度被降低致组织固定不足, 而高浓度的福尔马林, 降低了对组织的穿透性, 形成周围固定好而中央固定不到的现象 以酸性 12~15% 的福尔马林最佳 大标本 (2cm 厚 ) 一般需要 6~12 个小时, 小标本一般需要 3~6 个小时 ; 当室温低 18 时, 可在 37 以下的温箱内加温 4~6 个小时 由于 HE 染色最佳着色 ph 为 3.5~4.5, 中性福尔马林对苏木素染色有一定影响, 细胞核容易发灰, 核染色质不佳 所以, 尽管中性福尔马林对抗原有很好的保存作用, 但酸性福尔马林对绝大多数抗原来说也有很好的保存作用, 所以在没有特别处理的情况下常规 H-E 用 12~15% 酸性福尔马林也可以 ( 每 100 毫升 12~15% 福尔马林液内加 5 毫升冰醋酸 ) 骨髓 结缔组织固定以 Bouin 液为佳, 经 Bouin 液固定后的组织必须流水冲洗 4 小时以上 有条件的单位可根据不同要求选用二种或二种以上的固定液 ; 少数单位还可建立组织冷冻库, 以便适应各种特殊的处理要求 3. 水洗固定后水洗 (10~20 分钟 ), 通常被很多人所忽视, 而水洗不彻底, 容易造成脱片和染色不鲜艳 对需做免疫组织化学的组织, 更不应当忽视 福尔马林不利于组织块内抗原的保存 4. 脱水和透明所谓脱水就是利用脱水剂将组织内的水分置换出来, 以利于有机溶剂的渗入, 这一过程称为脱水 脱水是否彻底, 直接关系到组织是否能充分透明, 而脱水过度 ( 原因是组织在纯酒精内时间过久, 发生组织质地发生变化 ) 容易造成组织发脆 造成组织发脆的原因还有加温 ( 温度超过 35 ) 脱水剂内加有丙酮 浸蜡用的石蜡中二甲苯过多等等 一般认为组织发脆跟高浓度酒精有关, 而忽视了与低浓度的酒精关系, 其实低浓度的酒精具有强大的穿透力, 比纯酒精更容易渗透到组织块内部使之脱水, 组织如果在低浓度酒精里充分脱水, 在高 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD F22

23 浓度酒精里只需脱去从低浓度到高浓度之间的水份, 因此, 仅需短时间就可完成, 如果这时不缩短纯酒精的时间, 便会引起组织发脆 ; 如果脱水时加温, 使用丙酮, 还可引起组织收缩, 并影响免疫组织化学的标记 为了使石蜡浸入到组织块内, 必须经过一种既能与脱水剂混合, 又能与石蜡相溶的媒介物质, 这个过程称透明 目前最好的透明剂是二甲苯 很多人认为二甲苯极容易使组织发脆, 这个观点很片面, 在常温下, 如果不是时间过长 ( 超过 24 小时以上 ) 二甲苯并不会引起组织过份发脆, 相反会使某些组织结构比较质韧的组织 : 比如子宫肌瘤等相当好切 ), 但是当二甲苯温度超过 35 以后, 极易引起组织发脆 所以, 大小标本最好分开脱水, 一般情况下, 大标本脱水时间 ( 室温 18 ) 以 80% 酒精 2 小时 95% 酒精 (2 道 ) 各 1 个半小时至 2 小时 纯酒精 (3 道 ) 各 1 个半小时至 2 小时, 二甲苯 (2 道 ) 各 分钟为宜 ; 小标本脱水时间应相应缩短 脱水时间长短, 与室温高低有密切的相关 室温在 12~15 时, 可作为一个临界温度范围 当室温高于此温度范围时, 组织容易脱水, 可适当缩短脱水时间 ; 而室温低于该温度范围时, 应适当延长脱水时间 ( 如能保证在一个恒定的温度下最佳 ) 更换试剂, 应以量为基础, 定量更换, 不能等到切片不好时再去更换 否则, 至少会有 2~3 批组织切片不好 根据我科经验, 如试剂用量为 500ml, 每 500 个蜡块更换一次为宜 5. 浸蜡组织透明后, 在熔化的石蜡内浸渍的过程称为浸蜡 用其他浸透剂 ( 如火棉胶 明胶等 ) 渗入组织内部的过程可称为浸透或透入 浸蜡温度过高 ( 超过 60 ), 在蜡内加入二甲苯蜡或由于透明时带进的二甲苯过多, 都会导致组织发硬, 还会使组织内的抗原受到破坏 ; 所以作者主张浸蜡用的石蜡熔点在 56 ( 三道 ), 第一道 : 石蜡 30 分钟 ; 第二道 : 石蜡 90 分钟 ; 第三道 : 石蜡,90 分钟 浸蜡温度控制在 56~58 左右 ( 第一道也可用硬脂酸石蜡 1:3 混合浸蜡, 不仅可软化组织, 特别适用于比较韧 硬的组织, 而且由于硬脂酸是弱酸性的, 对细胞核有媒染作用, 核浆比鲜明, 但容易脱片 ; 同时对疏松组织容易散片 ) 有条件的可以每天打开第一道石蜡的盖子, 让二甲苯挥发 浸蜡所用的石蜡如有杂质尽可能过滤, 以防附在组织上, 造成切片刀刀口受损, 或切片破碎和划痕增多 6. 包埋用包埋剂来支持组织的过程称包埋 最常用的是石蜡包埋法 包埋的关键一是平整, 二是方位 要求在包埋时, 应采用镊子轻压组织块拱起部份, 使之平贴于底部, 通常采用组织的最大面包埋 囊壁 管腔组织应竖直包埋 小块多颗组织, 应尽量放在一起, 并保证在一个平面上 修去两边的余蜡 ( 所谓的两边, 指切片时与切片刀垂直的两侧 ) 包埋时还应注意有无缝线, 纸絮, 如有一定要去除 胃黏膜活检标本, 不能按一般的规律取最大包埋面, 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD F23

24 应采取窄面竖起包埋 包埋的蜡更应过滤, 留有杂质的石蜡, 容易造成污染或刀口受损 蜡的熔点应在 56~58 之间选择, 不提倡在冬天使用软蜡 因为用软蜡包埋的蜡块, 到了夏天, 会粘在一起, 不利于资料的保存, 而且即使在冬天, 用硬蜡包埋的蜡块也比用软蜡包埋的蜡块要好切 7. 切片切片的第一步必需粗切 粗切的厚度大约在 10~50 微米左右, 质地较硬的组织或较小的组织应再薄一些, 粗切致组织全部暴露后, 才进行细切 细切至组织块表面均匀一致, 无白点后, 再把切的蜡片放入温水中 切片时要求用力均匀 柔和, 摇速不易过快或过慢 过快会导致切片厚薄不均, 机器磨损 ; 过慢会使切片增厚 切片厚度一般为 3~5 微米 切片的要求是完整 薄 均匀 切下的片膜其大小形状应与组织块一致 在切片放蜡块时, 应注意组织包埋的方向, 组织的层次, 纤维 肌肉等的走向应与切片刀平行, 较难切的部分应放在上面, 如皮肤的表皮, 肿块的包膜, 胃肠道的浆膜等, 这样可以减少组织的断裂现象 操作切片机时应用力均匀, 避免用力过重 对脱钙组织 骨髓, 以及已知的钙化组织, 应选用固定的刀口, 以减少其他部位出现缺口的可能性 在使用毛笔展片时要防止笔丝进入刀口, 因为每切到一根笔丝, 就会增加一个缺口 切片厚度一般为 4~6 微米, 有人认为 : 只要切片机刻度标着几个微米, 切出来的片子就是几个微米 其实不然, 当切片刀不锋利, 或切片时速度不匀, 或切的较慢时, 切的片子都会变厚, 只有在切片刀十分锋利 切片匀速的情况下, 才能真正保证其厚度 切片时碰到的问题的原因及可能处理的方法 : (1) 组织发脆 : 一般是脱水 透明 浸蜡时间过长 温度过高, 并与组织本身质地也有关, 在切片时, 边切边用嘴向蜡片吹气, 可能会好些 或用 10-50% 乙酸 (2) 切片卷起, 可能是刀不锋利, 或刀锋在另一面, 或刀角度过大, 切片太厚等等 (3) 蜡片弯曲 : 可能是刀锋不均, 切片刀与蜡块不平行 (4) 透明 浸蜡时间过长 温度过高, 并与组织本身质地也有关 (5) 厚薄不均 : 可能是刀 刀座及蜡块未夹紧, 组织太硬, 或切片机主轴太向前, 或切片机已磨损 (6) 切片出现裂痕 : 可能是刀有缺口, 石蜡内有杂质, 组织内有钙化 骨片或有线结, 也可能会有棉纸纤维等 (7) 切片不连片, 切不下片, 切片很厚, 或者切片后蜡块发白, 内陷 : 组织脱水不佳 补救办法 : 可先将蜡块溶解, 取出组织, 放入加热水浴的丙酮内 (80 ),30~60 分钟, 再进行透明浸蜡包埋切片, 也许会好一点 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD F24

25 8. 展片与捞片展片水温应在 42 至 47 之间, 这主要和包埋蜡的熔点有关, 水温过高, 会引起组织细胞散开, 水温过低, 切片皱摺无法摊平 包埋蜡中如有二甲苯, 也会造成石蜡溶解现象 而用一次性刀片切的片子, 一碰到热水, 片子上的皱摺就无法再展开, 解决方法 : (1) 可以在切片时边切边向蜡片吹气, 这样的片子就会非常平整, 放到热水里就会自然展开, 比较方便快捷, 但这样的片子会略微厚一点 ; (2) 在切完片子后, 先把切片放在 30% 酒精水溶液中, 让酒精的张力自动把皱摺展开, 然后再将切片移到热水, 这样的片子会较薄 ; 如酒精浓度过高, 容易引起切片破碎, 出现裂隙, 像脂肪之类细胞间粘附性较小的组织一碰到酒精就会散开, 故不能用此法 最后捞片时玻片要干净, 要选择那些完整 无皱摺的切片, 粘贴于玻片中 1/3 和下 1/3 的中间 9. 烤片和脱蜡烤片, 一般在 60 的温箱内烤片 0.5~1 小时左右, 温度过高, 会引起切片细胞收缩 ; 时间太短 ( 少于 20 分钟 ), 容易造成脱片 脱蜡也相当重要, 如果脱蜡不干净, 切片不易着色或着色不匀, 所以, 脱蜡用的二甲苯要经常更换, 一般用 3 道二甲苯, 每 500ml 液体, 处理 500 张切片后更换一次为宜 当室温低于 18 时, 必须将切片从温箱拿出后立即放入二甲苯中脱蜡, 或将二甲苯放入温箱内预热 (37 左右 ) 脱蜡, 最高不得超过 60 然后经高浓度的酒精到低浓度的酒精洗去二甲苯, 至水 10. 染色苏木素染色时间要根据染料的新旧 温度 切片的类型而定, 一般为 5-15 分钟 经水略洗后, 用盐酸酒精分化, 分化程度必须用显微镜控制 分化水洗后, 可用温水或自来水蓝化, 并充分水洗 ( 流水冲洗 5 分钟以上 ), 以防盐酸残留导致切片褪色 不提倡使用碱性溶液 ( 释氨水 肥皂水等 ) 促蓝, 尽管蓝化效果很好, 但从实践的结果来看, 用碱性溶液促蓝的切片不能长期保存, 容易褪色 最后入伊红复染 (5-20 秒 ) H-E 染色的关键在于深浅适度, 对比鲜明, 一般有经验的, 肉眼就能判断, 但偶而也会出现失误, 所以用显微镜控制是最保险的方法 其关键的步骤在于苏木素染好后的分化及蓝化过程, 在蓝化结束后, 应在显微镜下观察细胞核着色是否合适, 核结构是否清晰, 胞浆内是否有残留的苏木素等等 染色理想的切片在显微镜下应是 : 细胞核与细胞浆应蓝红相映, 鲜艳美丽 ; 核浆对比明显, 核膜及核染色质颗粒清晰可见 11. 脱水和封片切片脱水应从低浓度的酒精到高浓度的酒精,80% 酒精 1 道,95% 酒精 2 道, 纯酒精 2 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD F25

26 道,( 正丁醇 1 道 ), 二甲苯 2 道 浓度低的酒精比浓度高的酒精更容易脱水, 但也容易使伊红退色, 故脱水时间可短一点, 每道 3-5 分钟, 纯酒精每道 10 分钟 为增加酒精与二甲苯的相融性, 可在二甲苯前面增加一道正丁醇 ; 石碳酸 - 二甲苯液也有此效, 但用石碳酸时如不洗净, 可引起切片退色, 不利于切片久存, 故不作推荐 切片经二甲苯透明后, 用中性树胶封固 为增加切片的透明度, 防止细胞收缩 龟裂或切片出现黑色结晶样小点 所以切片必须湿封, 不得用温箱烤干或电吹风吹干后干燥封片 在南方冬春 霉雨季节, 封片时要防止口鼻呼出的气体接触到切片 ; 在天气较潮湿的日子里, 不宜一次将多张切片取出待封, 以免切片 还潮, 形成透明不佳, 出现云雾状水珠 脱水剂的更换也应有一定的时间规定 一般是每 500ml 液体, 处理 500 张切片后更换一次为宜 封片树胶不能过稀, 封片时树胶要均匀充满盖玻片且树胶不及外溢为佳 要将组织全部覆盖, 也不能有气泡 最后, 粘贴标签, 标签必须贴于玻片上, 编号书写清楚, 最好能打印 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD F26