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土囿宣
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1 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2011, 33(3): 干扰素 -γ 对喉癌 Hep-2 细胞增殖和凋亡的影响陈建明 * 赵菁葛莉伟 ( 杭州师范大学生命与环境科学学院, 杭州 ) 摘要体外培养的人喉癌细胞系 Hep-2 细胞用 10 ng/ml 干扰素 -γ 处理不同时间后, 利用细胞计数细胞凋亡 -DNA Ladder 分析及半定量 RT-PCR 方法, 探讨干扰素 -γ 对 Hep-2 细胞增殖及凋亡的影响并初步分析其作用分子机制结果显示, 与不处理对照细胞相比, 干扰素 -γ 处理后第 2 天起 Hep-2 细胞增殖明显变慢 ; 细胞凋亡分析显示, 干扰素 -γ 处理后 Hep-2 细胞基因组 DNA 电泳图谱呈梯状分布 ; 半定量 RT-PCR 分析显示, 干扰素 -γ 处理诱导 Hep-2 细胞 IFI16 基因表达结果表明, 干扰素 -γ 抑制 Hep-2 细胞增殖诱导 Hep-2 细胞凋亡, 其机制可能与干扰素 -γ 诱导 IFI16 基因表达有关关键词喉癌 ; 干扰素 -γ; Hep-2 细胞 ; 增殖 ; 凋亡 ; IFI16 基因喉癌是头颈部常见恶性肿瘤, 约占全身恶性肿瘤的 5.7%~7.6%, 近年来发病率有逐渐上升的趋势, 其主要病理类型为鳞状细胞癌, 目前主要治疗手段为手术放疗和化疗, 但对于中晚期喉癌患者, 预后仍不够理想且副作用太大, 病人往往难以忍受为提高喉癌患者的治愈率和生存率, 近年来人们正致力于用干扰素 (interferon, IFN) 抑制喉癌细胞的生长 [1~4] 干扰素是一种具有广泛生物活性的细胞因子, 具有抗病毒免疫调节抗细胞增殖以及诱导细胞分化等功能干扰素可分为三大类 : 白细胞干扰素 (IFN-a) 成纤维干扰素 (IFN-β) 和免疫干扰素 (IFN-g), 其中 IFN-g 来自淋巴细胞近年来发现干扰素有抗肿瘤作用, 干扰素的抗肿瘤作用以 IFN-g 为最强 [3,4] IFN-g 能够诱导人 IFI-200( 又称 HIN-200 或 p200) 蛋白家族成员 IFI16 蛋白表达, 意大利研究小组最近发现 IFI16 蛋白能抑制喉癌细胞生长 [5~8] 由此我们推测, IFN-g 能抑制喉癌细胞生长, IFN-g 可能是通过诱导 IFI16 基因表达而抑制喉癌细胞生长的本文以人喉癌细胞系 Hep-2 细胞作为研究材料, 探讨 IFN-g 对喉癌细胞增殖和凋亡的影响, 并初步分析其作用的分子机制 1 材料与方法 1.1 试剂重组人 IFN-g 购自 PeproTech 公司, 分装保存于 -80 冰箱中 RPMI-1640 培养基购自赛默飞世尔生物化学制品 ( 北京 ) 有限公司, 超级无支原体新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司, 胰蛋白酶购自碧云天公司, 细胞凋亡 -DNA Ladder 抽提试剂盒购自碧云天公司, 琼脂糖购自 BIO Basic 公司, DNA 分子量参照物购自碧云天公司, Trizol 试剂购自 BIO Basic 公司, BeyoRT cdna 第一链合成试剂盒 (RNase H) 购自碧云天公司, Taq DNA 聚合酶购自上海鼎国生物技术有限公司 1.2 细胞培养人喉癌细胞系 Hep-2 细胞及人皮肤成纤维细胞 HSF 分别购自中科院上海细胞库, 分别贴壁培养于含 10% 新生小牛血清及 1% 青链霉素的 RPMI-1640 培养基及 α-mem 培养基中, 于 37 5% CO 2 及饱和湿度的细胞培养箱中进行培养, 每隔 2~3 d 换一次液 1.3 细胞增殖分析将指数生长的 Hep-2 细胞及 HSF 细胞分别接种于 12 孔细胞培养板中, 每孔接种个细胞于 1 ml RPMI-1640 完全培养基 (Hep-2 细胞 ) 或 1 ml a-mem 完全培养基 (HSF 细胞 ) 中, 37 5% CO 2 及饱和湿度的细胞培养箱中培养过夜第 2 d 开始, Hep-2 细胞或 HSF 细胞分别用 IFN-g 处理或不处理作为对照, 本研究参照文献报道及作者的研究经验用 [9,10] 10 ng/ml IFN-g 对细胞进行处理从第 3 d 起每天收稿日期 : 接受日期 : 浙江省自然科学基金 (No.Y ) 浙江省钱江人才计划(No. 2010R10062) 和杭州师范大学实验室开放立项 (No ) 资助项目 * 通讯作者 Tel: , Fax: , jianmingchen@hznu.edu.cn

2 陈建明等 : 干扰素 -γ 对喉癌 Hep-2 细胞增殖和凋亡的影响 259 收集 3 个复孔的细胞进行细胞计数, 共计数 4 d( 第 3 d 命名为 day 1, 依此类推直到 day 4), 实验独立重复 3 次, 求出 day 1~day 4 每天处理或不处理细胞的细胞数平均值及标准差, 然后以计数天数作为横坐标 ( 即 day 0~day 4), 以对应每天的细胞数平均值作为纵坐标, 绘制细胞生长曲线图, 分析探讨 IFN-g 对 Hep-2 细胞及 HSF 细胞增殖的影响 1.4 细胞凋亡检测将指数生长的 Hep-2 细胞分别接种于四只 6 cm 细胞培养皿中, 每只培养皿接种个细胞于 4 ml RPMI-1640 完全培养基中, 37 5% CO 2 及饱和湿度的细胞培养箱中培养过夜第 2 d 开始, 用 10 ng/ml IFN-g 对四只培养皿中细胞分别处理培养 0 h 24 h 48 h 和 72 h 处理结束后胰酶消化收集细胞, 分别用细胞凋亡 -DNA Ladder 抽提试剂盒按其描述方法抽提细胞基因组 DNA, 琼脂糖凝胶电泳检测来自每个培养皿中细胞基因组 DNA 的片段化情况, 分析探讨 IFN-g 对 Hep-2 细胞凋亡的影响 1.5 半定量 RT-PCR 分析将指数生长的 Hep-2 细胞分别接种于四只 6 cm 细胞培养皿中, 每只培养皿接种个细胞于 4 ml RPMI-1640 完全培养基中, 37 5% CO 2 及饱和湿度的细胞培养箱中培养过夜第 2 d 开始, 用 10 ng/ml IFN-g 分别对培养皿中细胞处理培养 0 h 12 h 24 h 和 48 h 处理结束后消化收集细胞, 用 Trizol 试剂分别提取细胞总 RNA 并进行定量每个处理时间点各取 2 mg 细胞总 RNA, 用 cdna 第一链合成试剂盒分别逆转录合成 cdna, 各取 2 ml cdna 用 PCR 技术分别扩增 IFI16 基因及 MNDA 基因, 同时各取 2 ml cdna 用 PCR 技术扩增 β-actin 基因作为内对照 IFI16 基因引物序列上游引物 : 5 -CCA AGA CTG AAG ACT GAA-3, 下游引物 : 5 -TAG AAG AAA AAG TCT GGT GAA GTT TCC ATA CTT G-3 ; MNDA 基因引物序列上游引物 : 5 -GTC AAC TTT ACA AGC AAG CAT CT-3, 下游引物 : 5 -TCC ACT CCC CAC TAC ATC CA-3 ; β-actin 基因引物序列上游引物 : 5 -GCG GGA AAT CGT GCG TGA CAT T-3, 下游引物 : 5 -GAT GGA GTT GAA GGT AGT TTC GTG-3 PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳及溴化乙锭染色后, 在紫外灯下观察结果并拍照, 分析探讨 IFN-g 对 Hep-2 细胞 IFI16 基因及 MNDA 基因表达的影响 2 结果 2.1 IFN-γ 抑制 Hep-2 细胞增殖细胞生长曲线显示, 在人皮肤成纤维细胞 HSF 中, IFN-g 处理与不处理的细胞在增殖速度上没有明显差异 ( 图 1) 但在人喉癌细胞系 Hep-2 细胞中, 第 1 d 时 IFN-g 处理与不处理的细胞在增殖速度上没有明显差异 ; 但从第 2 天起 IFN-g 处理细胞其增殖速度明显变慢, 与相应不处理细胞相比差异具有显著性 (P<0.05 或 P<0.01); 至第 4 d 时 IFN-g 处理细胞其增殖明显受到抑制, 推测第 4 d 时 IFN-g 诱导大部分 Hep-2 细胞发生了凋亡 ( 图 2) 图 1 和图 2 分别代表三次独立重复实验的平均值和标准差, 每次实验每天收集 3 个复孔细胞进行细胞计数, 最后求出三次独立实验每天的细胞数平均值和标准差并作图由此可见, IFN-g 能抑制 Hep-2 细胞的增殖但对 HSF 细胞增殖没有影响 2.2 IFN-γ 诱导 Hep-2 细胞凋亡琼脂糖凝胶电泳结果显示, 0 h IFN-g 处理的 Hep-2 细胞其基因组 DNA 在凝胶电泳中没有呈现 DNA 片段化, 但 24 h IFN-g 处理的 Hep-2 细胞其基因组 DNA 在凝胶电泳时出现梯状条带, 并且随着 IFN-g 处理时间的延长, Hep-2 细胞其基因组 DNA 在凝胶电泳时梯状条带愈来愈明显 ( 图 3) 凋亡细胞基因组 DNA 会在核小体间发生断裂而呈 DNA 片段化, 琼脂图 1 IFN-γ 不抑制 HSF 细胞的增殖图中每个数据表示来自三次独立实验的细胞数平均值和标准差 Fig. 1 The proliferation of HSF cells was not inhibited by IFN-γ Each data was expressed as cell number mean values (means ± S.D.) obtained from three independent experiments.

3 260 研究论文生凋亡 2.3 IFN-γ 诱导 Hep-2 细胞 IFI16 基因表达半定量 RT-PCR 结果显示, IFN-g 处理后 Hep-2 细胞 MNDA 基因表达没有明显变化 ( 图 4); 而 Hep-2 细胞 IFI16 基因最初则处于低水平表达状态, 但 IFN-g 处理 12 h 后 IFI16 基因表达明显升高了, 其后随着 IFN-g 处理时间延长 IFI16 基因表达则愈来愈高 ( 图 5) 图 4 和图 5 中, 管家基因 β-actin 是半定量 RT-PCR 分析 Hep-2 细胞 IFI16 基因和 MNDA 基因表达时的内对照 MNDA 基因与 IFI16 基因同属于人 HIN-200 蛋 [5] 白家族成员, 本研究发现喉癌 Hep-2 细胞中 MNDA 基因与 IFI16 基因都处于低水平表达状态, IFN-g 处理对 Hep-2 细胞 MNDA 基因表达没有影响, 但 IFN-g 处图 2 IFN-γ 抑制 Hep-2 细胞的增殖图中每个数据表示来自三次独立实验的细胞数平均值和标准差 *P< 0.05 和 **P<0.01 分别表示与相应的不处理对照细胞相比具有统计意义 Fig. 2 IFN-γ inhibited the proliferation of Hep-2 cells Each data was expressed as cell number mean values (means ± S.D.) obtained from three independent experiments. *P<0.05 and **P<0.01 indicated statistical significance as compared to the corresponding untreated control cells, respectively. 图 4 IFN-γ 处理后 Hep-2 细胞 MNDA 基因表达没有变化泳道 1: Hep-2 细胞用 10 ng/ml IFN-γ 处理 0 小时 ; 泳道 2: Hep-2 细胞用 10 ng/ml IFN-γ 处理 12 小时 ; 泳道 3: Hep-2 细胞用 10 ng/ml IFN-γ 处理 24 小时 ; 泳道 4: Hep-2 细胞用 10 ng/ml IFN-γ 处理 48 小时 Fig. 4 MNDA gene expression was not changed in IFN-γtreated Hep-2 cells cells treated with 10 ng/ml IFN-γ for 12 h; Lane 3: Hep-2 cells treated with 10 ng/ml IFN-γ for 24 h; Lane 4: Hep-2 cells treated with 10 ng/ml IFN-γ for 48 h. 图 3 IFN-γ 诱导 Hep-2 细胞凋亡泳道 1: Hep-2 细胞用 10 ng/ml IFN-γ 处理 0 小时 ; 泳道 2: Hep-2 细胞用 10 ng/ml IFN-γ 处理 24 小时 ; 泳道 3: Hep-2 细胞用 10 ng/ml IFN-γ 处理 48 小时 ; 泳道 4: Hep-2 细胞用 10 ng/ml IFN-γ 处理 72 小时 Fig. 3 IFN-γ induced the apoptosis of Hep-2 cells cells treated with 10 ng/ml IFN-γ for 24 h; Lane 3: Hep-2 cells treated with 10 ng/ml IFN-γ for 48 h; Lane 4: Hep-2 cells treated with 10 ng/ml IFN-γ for 72 h. 糖凝胶电泳时凋亡细胞其基因组 DNA 呈现梯状条带, 我们的实验结果说明 IFN-g 能诱导 Hep-2 细胞发图 5 IFN-γ 诱导 Hep-2 细胞 IFI16 基因表达泳道 1: Hep-2 细胞用 10 ng/ml IFN-γ 处理 0 小时 ; 泳道 2: Hep-2 细胞用 10 ng/ml IFN-γ 处理 12 小时 ; 泳道 3: Hep-2 细胞用 10 ng/ml IFN-γ 处理 24 小时 ; 泳道 4: Hep-2 细胞用 10 ng/ml IFN-γ 处理 48 小时 Fig. 5 IFN-γ induced the IFI16 gene expression in Hep-2 cells cells treated with 10 ng/ml IFN-γ for 12 h; Lane 3: Hep-2 cells treated with 10 ng/ml IFN-γ for 24 h; Lane 4: Hep-2 cells treated with 10 ng/ml IFN-γ for 48 h.

4 陈建明等 : 干扰素 -γ 对喉癌 Hep-2 细胞增殖和凋亡的影响 261 理后 Hep-2 细胞 IFI16 基因表达则明显升高了, 说明 IFN-g 能特异性诱导 Hep-2 细胞 IFI16 基因的表达 3 讨论恶性肿瘤的治疗传统上分为手术放疗和化疗三种方法前两种方法只对局限性肿瘤有效, 而化学疗法则副作用太大, 病人往往难以忍受因此, 近年来兴起的综合疗法倍受关注, 干扰素治疗肿瘤就是其中最重要的一种干扰素抗肿瘤的作用机理可能有 : (1) 抑制肿瘤细胞增殖诱导肿瘤细胞凋亡 ; (2) 抑制癌基因表达 ; (3) 免疫调节作用 ; (4) 抑制肿瘤病毒繁殖 ; (5) 抑制肿瘤血管生成等 [3,4] 对中晚期喉癌患者, 由于传统治疗方法其疗效并不理想, 为提高喉癌患者的治愈率和生存率, 目前人们正尝试用干扰素来抑制喉癌细胞的生长 [11] IFN-g 是三类干扰素中抗肿瘤作用最强的一类, 但目前关于 IFN-g 是否能抑制喉癌细胞的生长还不清楚最近, 意大利研究小组发现, 干扰素诱导的 IFI16 蛋白能抑制喉癌细胞的生长 [6~8] 已知 IFI16 蛋白能被 IFN-g 诱导表达, IFI16 蛋白在许多肿瘤细胞中表达低下 [5,12] 因此, 我们推测, IFN-g 能抑制喉癌细胞的生长, IFN-g 可能是通过诱导 IFI16 基因蛋白表达而抑制喉癌细胞生长的本文以人喉癌细胞系 Hep-2 细胞作为研究材料, 根据文献报道使用 10 ng/ml 重组人 IFN-g 对 Hep-2 细胞进行处理细胞增殖研究结果发现, 人皮肤成纤维细胞 HSF 其增殖不受 IFN-g 的影响, 但喉癌 Hep-2 细胞在 IFN-g 处理 48 h 后其增殖速度明显变慢, 说明 IFN-g 对喉癌细胞增殖有特异性抑制作用 ; Hep-2 细胞在 IFN-g 处理至 96 h 时其增殖明显受到抑制, 推测可能是 IFN-g 诱导大部分 Hep-2 细胞发生了凋亡 ; 凋亡研究结果发现, IFN-g 处理 24 h 时 Hep-2 细胞基因组 DNA 在凝胶电泳时出现梯状条带, 随着 IFN-g 处理时间延长 Hep-2 细胞基因组 DNA 梯状条带愈来愈明显, 说明 IFN-g 能诱导喉癌细胞发生凋亡 ; MNDA 基因与 IFI16 基因同属于人 HIN-200 蛋白家族成员 [5], 半定量 RT-PCR 研究结果发现, Hep-2 细胞中 MNDA 基因与 IFI16 基因都处于低水平表达状态, IFN-g 不影响 Hep-2 细胞 MNDA 基因表达但能特异性诱导 IFI16 基因表达 IFI16 基因是系统性红斑狼疮的易感基因 [12] 但近年来有研究证据表明, IFI16 基因还能对多种肿瘤细胞的生长起抑制作用, 目前发现 IFI16 基因能抑制前列腺癌细胞乳腺癌细胞骨肉瘤细胞 [6~8,13~15] 及喉癌细胞的生长本研究结果发现, IFN-g 能特异性抑制喉癌细胞增殖并诱导喉癌细胞发生凋亡, 喉癌细胞中 IFI16 基因本身表达低下, 但 IFN-g 能诱导喉癌细胞 IFI16 基因表达由于文献报道 IFI16 基因能抑制喉癌细胞生 [6~8] 长, 由此, 我们推测 IFN-g 可能通过诱导 IFI16 基因表达来抑制喉癌细胞增殖并诱导喉癌细胞凋亡, 至于该途径中是否还有其它蛋白参与? 它们的变化又如何? 这些问题我们将在今后的研究中作进一步探索本研究结果为 IFN-g 运用于临床中晚期喉癌治疗提供了实验依据及理论基础, 为 IFN-g 广泛运用于喉癌临床治疗奠定了基础参考文献 (References) 1 Gil Z, Fliss DM. Contemporary management of head and neck cancers. Isr Med Assoc J 2009; 11(5): Chow CW, Tabrizi SN, Tiedemann K, Waters KD. Squamous cell carcinomas in children and young adults: a new wave of a very rare tumor? J Pediatr Surg 2007; 42(12): 曾洁萍, 余勤, 梁茂植, 段俊国干扰素抗肿瘤作用研究进展现代预防医学 2008; 35(18): 朱颖慧, 朱兰才, 刘然义, 黄文林干扰素 -γ 治疗肿瘤的研究进展肿瘤学杂志 2008;14(1): 赵菁, 陈建明, 邱明, 应奇才干扰素诱导的 IFI-200 蛋白家族研究进展杭州师范大学学报 ( 自然科学版 ) 2009; 8(5): Azzimonti B, Pagano M, Mondini M, De Andrea M, Valente G, Monga G, et al. Altered patterns of the interferon-inducible gene IFI16 expression in head and neck squamous cell carcinoma: immunohistochemical study including correlation with retinoblastoma protein, human papillomavirus infection and proliferation index. Histopathology 2004; 45(6): De Andrea M, Gioia D, Mondini M, Azzimonti B, Renò F, Pecorari G, et al. Effects of IFI16 overexpression on the growth and doxorubicin sensitivity of head and neck squamous cell carcinoma-derived cell lines. Head Neck 2007; 29(9): Mazibrada J, De Andrea M, Rittà M, Borgogna C, Dell eva R, Pfeffer U, et al. In vivo growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma by the Interferon-inducible gene IFI16. Cancer Lett 2010; 287(1): Kim EJ, Park JI, Nelkin BD. IFI16 is an essential mediator of growth inhibition, but not differentiation, induced by the leukemia inhibitory factor/jak/stat pathway in medullary thyroid carcinoma cells. J Biol Chem 2005; 280(6): Xin H, Pereira-Smith OM, Choubey D. Role of IFI 16 in cellular senescence of human fibroblasts. Oncogene 2004; 23(37):

5 262 研究论文 11 周立辉, 李湘平, 刘雄干扰素抗肿瘤机制及其在头颈部肿瘤中的应用中国医学文摘耳鼻咽喉科学 2006; 21(5): Choubey D, Deka R, Ho SM. Interferon-inducible IFI16 protein in human cancers and autoimmune diseases. Front Biosci 2008; 13: Alimirah F, Chen JM, Davis FJ, Choubey D. IFI16 in human prostate cancer. Mol Cancer Res 2007; 5: Aglipay JA, Lee SW, Okada S, Fujiuchi N, Ohtsuka T, Kwak JC, et al. A member of the Pyrin family, IFI16, is a novel BRCA1- associated protein involved in the p53-mediated apoptosis pathway. Oncogene 2003; 22(55): Zhang Y, Howell RD, Alfonso DT, Yu J, Kong L, Wittig JC, et al. IFI16 inhibits tumorigenicity and cell proliferation of bone and cartilage tumor cells. Front Biosci 2007; 12: Influences of IFN-γ on the Proliferation and Apoptosis of Laryngeal Carcinoma Hep-2 Cells Jian-Ming Chen*, Jing Zhao, Li-Wei Ge (College of Life and Environment Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou , China) Abstract human laryngeal cell line Hep-2 cells were cultured and treated with 10 ng/ml IFN-γ for different time. After IFN-γ treatment, cell counting, cell apoptosis-dna ladder analysis and semi-quantitative RT- PCR methods were used to explore the influences of IFN-γ on the proliferation and apoptosis of Hep-2 cells and its preliminary molecular mechanism was analyzed simultaneously. The cell growth assay result showed that from the second day on Hep-2 cells treated with IFN-γ proliferated obviously slower than the untreated control cells. Cell apoptosis analysis showed that the genomic DNA of Hep-2 cells displayed as the DNA ladder pattern in gel electrophoresis when the Hep-2 cells were treated with IFN-γ. Semi-quantitative RT-PCR analysis showed that the expression of IFI16 gene was induced in Hep-2 cells after treated with IFN-γ. Based on the above results, it was concluded that IFN-γ could inhibit Hep-2 cells proliferation and induce Hep-2 cells apoptosis, and the mechanism for IFN-γ inhibiting Hep-2 cells proliferation and inducing Hep-2 cells apoptosis is probably related to the IFN-γinduced IFI16 gene expression. Key words laryngeal carcinoma; IFN-γ; Hep-2 cells; proliferation; apoptosis; IFI16 gene Received: August 13, 2010 Accepted: December 23, 2010 This work was supported by the Natural Science Foundation of Zhejiang Province (No.Y ), the Qianjiang Talented Person Project of Zhejiang Province (No.2010R10062) and the Approved Laboratory-opening Project of Hangzhou Normal University (No ) *Corresponding author. Tel: , Fax: , jianmingchen@hznu.edu.cn

学刊封面2012第2期

学刊封面2012第2期中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2012, 34(2): 146 153 http://www.cjcb.org IFI16 基因外来表达对喉癌细胞 Hep-2 的影响陈建明 * 赵菁邱明 ( 杭州师范大学生命与环境科学学院, 杭州 310036) 摘要将 RT-PCR 扩增得到的 IFI16 基因构建到真核表达质粒 pvr1012 中, 得到