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- 荣焱 梅
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2 1-2 (Tissue Engineering) (1) ( 1-1) (cells) (signals) (scaffold) 1-1 2
3 1-2-1 (adult cell) (stem cell) (hematopoietic stem cells) (mesenchymal stem cell, MSC) (2-4) 38±4 (5,6) (7,8) 3
4 1-2-2 TGF (Transforming growth factor) BMP (Bone morphogenetic protein) (9) (10) 1988 Maniatopoulos (dexamethasone) 10-7 ~10-9 M -glycerophosphate 5~10 mm ascorbic acid (2,3) (Polypodiaceae) Drynaria fortunei (Kunze) J. Sm. (bioreactor) 4
5 (11) (orbitally mixed Petri dishes)2. (magnetically stirred flasks)3. (12) 1-2 (a) (b) (c) () ( (d) () 5
6 GGT (13) 6
7 1-3 (Scaffold) (Cells) (Signals) ( GGT) 1994 Yao (biodegradable) (tricalcium phosphate) (gelatin) (binding agent) (glutaraldehyde) (cross-linking agent) GTG (in vitro) (in vivo) (14-16) 2004 Liu (genipin) GGT (13) Jeng GGT (17) GGT 7
8 2-1 (mineral)/ (organic) 3/ (hydroxyapatite, HAP)(Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 ) (collagen) (Volkman s canals) (Haversian canals) (lamellae) (lacunae) (osteocytes) (canaliculi) 8
9 (Haversian system) (osteon) (interstitial lamellae) 2-1 (18) (trabeculae) 9
10 2-2 (osteoblast; OB) (osteocyte) (osteoclast; OC) (19,20) (shaped) (21) 2-2 (21)
11 2-2-1 (mesenchymal cell) (reticulated cells of bone marrow) (osteoprogenitor cell) ( osteoblast) (osteoid) (lacuna) (homeostasis) (22) (resorption) (formation) (multinuclear giant cell, MNGC) 100 m 2~50 (resorption bay)howship s (Howship s lacula) (23,24) 11
12 2-2-2 (25) (callus) ( ) (chondrocyte) (inductor) (osteoinduction) (template) 12
13 2-3 (cell) (blood) (tissue) (protein) (implants) (catheters) (artificial organs) (drug delivery) (toxin removal) (wound dress) (contact lenses) (biosensor) (cell carriers) (enzyme supports) (26) (non-toxicity) 2. (functionality) 3. (sterilizability) (ethylene oxide, E.O.) (gas plasma) (ozone) 4. (biocompatibility) 5. (degradability) (proliferation) (differentiation) 13
14 2-3-2 (osteoclast) (resorbing) (osteoblast) (remodeling) 6 (20) (mineralization) (delayed union) (nonunion) (27) 14
15 (28) (autologous bone) (allologous bone) (xenologous bone) 15
16 (29-32) Jones Bives (33) 1920 Albee Morrison (34) (dense blocks) (porous) (hydroxyapatite, HAP) (tricalcium phosphate, TCP) 1985 Yamamuro (35) 1988 Lin (36) DP-bioglass (osteoconductive potentiality) 16
17 1880 Gluck (37) Shapiro (38) (poly-methylmethacrylate, PMMA) (bone cement)1990 Alici (39) polyethylene (40-42) 1983 Mittelmerier (43) (collagen) 1984 Chierici (44) 17
18 2-3-3 (45) (resorbability) (degradation rate) (cytotoxicity) 18
19 2-4 (self-renewal) (multi-lineage differentiation) (multipotent) (self-renewing) (cell lineage) (46) 2-3 (symmetric division) (asymmetric division) (47) (progenitor cell) (embryonic stem cells) (adult stem (adult stem cells) 19
20 (commitment) (hematopoietic stem cell) (transdifferentiation) (plasticity) 2-3 (hematopoietic stem cells) CD34 (mesenchymal stem cell, MSC) CD34 SH2SH3 CD105 20
21 2-4 (48)
22 2-5 (Polypodiaceae) (Davalliaceae) (49) 1995 Drynaria fortunei (Kunze) J. Sm (49) (50) 22
23 (51) (50) (52)
24 (49) (52) 24
25 (50) (50) 2-9 (54) (2-11) 25
26 2-10 (53) 2-11 (54) 26
27 (55) (56) ( 2-12) (56) 2-12 (57) ( 2-13) 27
28 (58) ( 2-14) (57) (58) 28
29 藁 (59) ( 2-15) (59) (60) 甙 甙 (61) 甙 甙甙 (62) 甙 甙 甙 29
30 (Genipin) (Gelatin) (Tricalcium phosphate) GGT Dexamethasoneβ-glycerolphate L-ascorbic acid 3-1 (ceramics) (polymer) (naturally occurring cross-linking reagent) (Tricalcium phosphate, TCP; Merck, Germany) (bioresorable) 1000 β 1180 α (14) β mesh µm 30
31 3-1-2 (binding agent) (fibrin) (collagen) (gelatin) (32,63) (porcine skin) (Bloom number 300, Sigma Chemical Co., USA) 50, ,000 (dalton) 85 % 10 % (swelling) % (homogeneous) 5-20 % % % (64) 31
32 3-1-3 (65-67) (cytotoxicity) (Cape Jasmine Fruit) (genipin; Challenge Bioproducts Co., Taiwan) (68) 皶 (69) (70) (71) 32
33 3-1-4 (Polypodiaceae) Drynaria fortunei (Kunze) J. Sm. 3-1 (72) 甙 甙 (73) 100 µg/m (74) S-D GGT 100 µg/ml (17) 100 µg/ml
34 (Genipin) (Gelatin) (Tricalcium phosphate) GGT (Scanning Electron Microscope, SEM) (Energy dispersive X-ray spectrometry, EDS) 2-3 GGT (in vitro test) 酶 Von Kossa s MTT GGT (SEM) (in vivo test) GGT GGT GGT 34
35 X GGT SEM EDS X SEM ALP stain Von Kossa s stain MTT assay SEM
36 3-3 (Genipin) (Gelatin) (Tricalcium phosphate) GGT GGT(porous composite of genipin cross-linked gelatin with tricalcium phosphate) GGT GGT g 500 ml 20 (Filter paper, Toyo Roshi Kaisha, Ltd. Japan) 50 ml
37 3-3-2 GGT 75 % GGT 13 (Sodium Chloride, NaCl; Gerbu, Germany) mesh µm mesh g (GGTNaCl13) 9 g 41 ml (distilled water) 75 (stirrer) 18 % 0.82 g 20 mg/ml % (gelatin-genipin mixture) 27 g 37
38 cm 0.2 cm γ (15 kgy) GGT GGT
39 3-3 GGT 3-4 GGT 39
40 3-4 GGT GGT S-3000N EDS (Porosity) 3-5 Wo Wp Wt Ww d Wp Wo = ( Ww Wo) ( Wt Wp) Wo Wp Ww Wt 40
41 Vm Vs ( ) Vs - Vm (Porosity) = 100% Vs Vs Vm
42 3-4-2 (cross-linked glatin) (water uptake ability) (swelling ratio) 1.5 cm 0.2 cm GGT GGT (Wo) 20 ml 50 ml (Wt) Wt Wo (Swelling Ratio) = 100% Wo Wt Wo 42
43 mm ml (Wo) 50 ml 20 ml 37 5 % CO (Wt) (Degradable Weight Loss Ratio) ( Wo Wt) = 100% Wo Wo Wt 43
44 3-4-4 SEM EDS GGT (SEM) (EDS) GGT GGT 1/2 (PBS) % 15 (HCP-2 Critical Point Dryer, HITACHI, Japan)( 3-6) (E-1010 Ion Sputter, HITACHI, Japan)( 3-7) (S-3000N Scanning Electron Microscope, HITACHI, Japan)( 3-8) (EX-200, Energy dispersive X-ray spectrometry, EDS, Horiba, Japan) 44
45 3-6HCP E S-3000N 45
46 (mesenchymal stem cell, MSC) (bone marrow stromal cell) (34) 46
47 L-DMEM (low-glucose Dulbecco s modified eagles medium;gibco, USA)10 % (fetal bovine serum, FBS)1 % (antibiotics; penicillin G, 100 U/ml; streptomycin, 0.1 mg/ml; amphotericin B, 0.25 mg/ml) (sodium bicarbonate, NaHCO 3 )3.7 g/l 500 ml 2 1 L 1 (stir) 1 L (laminar flow) 800 ml 1 L L-DMEM 3.7 g 10 ml ml ml 1 L (1000 ml) 0.22µm 500 ml 4 47
48 M Dexamethasone10 mm β-glycerolphate 50 µg/ml L-ascorbic acid DMEM (high-glucose Dulbecco s modified eagles medium;gibco, USA)10 % 1 % (sodium bicarbonate, NaHCO 3 ) 3.7 g/l sodium pyruvate 0.11 g/l 500 ml 2 1 L 1 (stir) 1 L 800 ml 1 L DMEM 3.7 gsodium pyruvate 0.11 g 10 ml Dexamethasone 10-8 M ml 10-3 M (Micropipet) 10 µl 10-3 M Dexamethasone 10-8 M2.16 g β-glycerolphate 0.05 g L-ascorbic acid ml ml 1 L (1000 ml) 0.22 µm 500 ml 4 48
49 g GGT GGT GGT (spinner flask) GGT GGT (Ketamin 10 ml/50 mg/ml ) (Rompun, Bayer, Germany)11 0.8~1.5 ml/kg 70 % Lidocaine (2 ml/ 10 mg/ml )1.0~1.2 ml (Agglutex injection, Heparin Sodium 5,000 Unit/ml ) 20 5 ml T-75 (Flask) 37 5 % CO 2 (Incubator) ml T rpm 49
50 T-75 (Pipet-aid) 5 ml (phosphate buffer solution, PBS, Sigma, USA) 1 ml 0.25 % Trypsin/EDTA (Sigma, USA) 2-3 Trypsin/EDTA 5 ml 15 ml 1500 rpm
51 (A) (B) (C) (D) (E) (F) 3-9 (A) (B) (C) (D) (E) (F) 51
52 (A) (B) (C) 3-10 (A) 4 (B) 6 8 (C) 12 (scale bar=20 µm) 52
53 3-5-2 (in vitro) 酶 (Alkaline phosphatase stain)von Kossa s MTT SEM 酶 Von Kossa s MTT () () L-DMEM DMEM 3 9 ml 1 ml 100 µg/ml PBS 0.25 % Trypsin/EDTA 6 () () 3 2 ml
54 酶 酶 酶 Sigma Alkaline Phosphatase Kit 86-R (Fix Solution) 酶 (Alkaline Phosphatase Stain Solution) 25 ml Citrate solution65 ml (Acetone)8 ml 37 % (Formaldehyde) 100 ml 酶 50 ml 45 ml ml Sodium Nitrite Solution 1 ml FRV-Alkaline Solution 15 ml 2 diazonium salt solution diazonium salt solution 45 ml 1 ml Naphthol AS-BI Alkaline Solution (PBS) 酶 15 2 Hematoxylin Solution
55 Von Kossa s Von kossa s (silver nitrate, AgNO 3 ) (calcium phosphate, Ca 3 (PO4) 2 ) 5 % (silver nitrate solution) 5 g (silver nitrate, AgNO 3 ) 100 ml 5 % (sodium thiosulfate solution) 5 g (sodium thiosulfate, Na 2 S 2 O 3 ) 100 ml Nuclear fast red 0.1g Nuclear fast red 100 ml 5 % (Aluminum Sulfate) thymol 3 2 % (glutaraldehyde) % 60 W % Nuclear fast red
56 MTT MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) dehydrogenase MTT-formazan (acid/alcohol-0.04 N HCl in isopropanol)formanzan ELISA reader(mrx Microplate Reader, Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, USA) 570 nm 650 nm (survival) (proliferation) MTT formazan formazan MTT -20 MTT (USB, Amersham Life Science) 50 mg 15 ml 10 ml PBS MTT 0.22 µm (Millipore, USA) 15 ml 4 formazan (acid/alcohol-0.04 N HCl in isopropanol) 50 ml 2 ml 1 N HCl 48 ml (isopropanol ) cells/welln=6 100 ml 10 µl MTT 4 formazan well 200 µl formazan 56
57 10 formazan ELISA reader 570 nm 650 nm MTT cells/well well 180 µl N=5 2 2 MTT 4 formazan ELISA reader 570 nm 650 nm MTT 57
58 GGT 12 4 GGT SEM (spinner flask) PBS % Trypsin/EDTA cells/ml GGT 12 (12-well plate) 500 µl( cells) GGT GGT 12 GGT GGT 58
59 (Bioreactor) 70 rpm rpm (75) 3-11 (A) (B) 3-11 (A) (B) spinner flask 59
60 GGT 124 1/2 (Scanning Electron Microscope, SEM) 1/2 GGT GGT 1/2 (PBS) % % 15 (HCP-2 Critical Point Dryer, HITACHI, Japan) (E-1010 HITACHI, Japan) S-3000N GGT 124 1/2 1/2 2 2 % 60
61 3-5-3 GGT GGT GGT 2. 1 GGT 3. 2 GGT 4. 4 GGT GGT 2. 1 GGT 3. 2 GGT 4. 4 GGT 8 X GGT GGT 61
62 (Ketamin 10ml/50 mg/ml ) (Rompun 25 mlbayer, Germany)11 0.8~1.5 ml/kg 70 % Lidocaine (2 ml/ 10 mg )1.0~1.2 ml 5 cm 1.5 GGT ml (Cephalosporin Cephazolin Sodium 1 gm/vial ) 30 mg/kg
63 (A) (B) (C) (D) (E) (F) 3-12 (A) (B) (C) (D) (E) (F) 63
64 ( 3-13) (Urethane1, 1 g/10 ml, Sigma, USA) 4 ml 8 ml 2.5 cm 2.0 cm 10 % (formaldehyde)
65 % 48 (TBD-1, Rapid Decalcifier, Thermo Shandon, USA) % 15 65
66 4-1 66
67 % 4-1 GGT 1.18±0.10 GGT GGT 82.07±1.51 % GGT % 4-1 GGT 1.18±0.10 GGT (%) 82.07±
68 4-1-2 (free volume) (38) 4-1 GGT GGT GGT GGT 甙 (Naringin, C 27 H 32 O 14, M.W.=580.53)( 4-2) (Genipin, C 11 H 14 O 5, M.W.=580.53)( 4-3) 4-1 GGT GGT 68
69 4-2 甙 GGT 24 GGT 69
70 4-1-2 GGT GGT GGT GGT (12 ) 10 % GGT 5 3. GGT GGT GGT 70
71 (A) GGT 50 (B) GGT 100 GGT GGT µm mesh µm 71
72 (A) (B) 4-5 GGT (A) GGT 50 (B) GGT
73 4-1-5 GGT GGT 4-2 GGT Element App Intensity Weight% Weight% Atomic% C K O K P K Ca K Nb L totals
74 4-2 (in-vitro) (in-vivo) 酶 (alkaline phosphatase stain)von Kossa s MTT GGT X GGT 74
75 酶 酶 (alkaline phosphatase stain) 酶 4-7 酶 4-8 酶 4-9 酶
76 (A) (B) (C) 4-7 酶 (A)1 (B)2 (C)4 (scale bar=20 µm) 76
77 (A) (B) (C) 4-8 酶 (A)1 (B)2 (C)4 (scale bar=20 µm) 77
78 (A) (B) (C) 4-9 酶 (A)1 (B)2 (C)4 (scale bar=20 µm) 78
79 Von Kossa s Von kossa s (multilayer) (confluency) (A) (B) (C) (A) (B) (C) (C) 2 3 (B) (C) 234 Von kossa s 79
80 (A) (B) (C) (A) (B) (C) (scale bar=20 µm) 80
81 (A) (B) (C) (A) (B) (C) (scale bar=20 µm) 81
82 Von Kossa s 4-13 Von Kossa s 2 (A ) 3 (B ) 4 (C ) 4-14 Von Kossa s 2 (A ) (B ) (C )
83 (A) (B) (C) 4-12 Von Kossa s (A)2 (B)3 (C)4 (scale bar=20 µm) 83
84 (A) (B) (C) 4-13 Von Kossa s (A)2 (B)3 (C)4 (scale bar=20 µm) 84
85 (A) (B) (C) 4-14 Von Kossa s (A)2 (B)3 (C)4 (scale bar=20 µm) 85
86 MTT MTT 4-15 ()/well formazan (O.D nm) x= y x ()/well y: formazan (O.D nm) 4-15formazan V.S ELISA reader 570 nm 650 nm ( 4-16) 86
87 (SEM) GGT spinner flask 124 1/2 ( 4-17) 1 2 (4-18) 4 (4-19) GGT 87
88 (B) SEM (A)100 (A)
89 SEM (2500 ) SEM (2500 ) 89
90 / (A) (B) (A)100 (B)200 (scale bar=10 µm) 90
91 4-2-2 GGT GGT 124 X GGT GGT ( 4-21) ( 4-22) ( 4-23) ( 4-24) GGT 91
92
93 4-23 GGT GGT 8 93
94 X GGT X-ray 4-25 GGT X-ray 4-26 GGT 4-3 GGT 17 % 1 (23 %)2 (28 %)4 (32 %) GGT 24 % 1 (28 %)2 (33 %)4 (38 %) 94
95 NB M HB (A) NB HB M (B) 4-25 GGT X-ray (A) (B) (C) (D) HB NB M 95
96 NB M HB (C) NB HB M (D)
97 NB M HB (A) NB M HB (B) 4-26 GGT X-ray (A) (B) (C) (D) HB NB M 97
98 NB M HB (C) NB M HB 4-26 (D) GGT 17 GGT
99 GGT GGT GGT 4-28 GGT (erythrocytes) GGT 4-29 GGT GGT GGT 99
100 ITF M HB (A) OB (B) 4-27 (A)30 (B)500 HB M ITF OB 100
101 M (A) RBC (B) 4-28 GGT (A)100 (B)1500 M RBC 101
102 HB M ITF (A) D C (B) 4-29 GGT (A)30 (B)500 (C (D)1500 HB M ITF 102
103 (C) 4-29 (D) 103
104 GGT GGT 4-30 GGT (A)40 (B)(C)400 GGT (fibrous tissue) GGT 4-31 GGT (A) (B)40 (C) GGT (A)40 (B)100 (C)
105 4-33 GGT (A)40 (B)100 (C)400 GGT 4-34 GG X-ray 105
106 C M NB HB B Fibrous Tissue (A) NB (B) NB (C) 4-30 GGT (A)40 (B)(C)400 HB M NB 106
107 NB M HB (A) M NB (B) NB (C) 4-31 GGT (A)(B)40 (C)400 HB M NB 107
108 M HB (A) NB (B) GGT NB (C) 4-32 GGT (A)40 (B)100 (C)400 HB M NB GGT 108
109 M (A) BLT (B) BLT (C) 4-33 GGT (A)40 (B)100 (C)400 M GGT BLT 109 GGT
110 M HB (A) NB (B) NB GGT (C) 4-34 GGT (A)(B)40 (C)40 HB M NB GGT 110
111 (Cells) (Signals (Scaffold) ( GGT) GGT GGT GGT 80 % 12 SEM EDS 酶 Von Kossa s 酶 酶 MTT GGT spinner flask 124 SEM GGT 111
112 GGT GGT X-ray SEM GGT - 112
113 GGT 113
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材料與方法
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