出國報告(出國類別：研習)

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1 出 國 報 告 ( 出 國 類 別 : 實 習 ) 赴 日 本 北 海 道 大 學 研 習 家 禽 流 行 性 感 冒 野 鳥 跨 國 監 測 網 絡 高 病 原 性 (HPAI) 病 毒 特 性 分 析 及 進 行 研 究 現 況 交 流 服 務 機 關 : 行 政 院 農 業 委 員 會 家 畜 衛 生 試 驗 所 姓 名 職 稱 : 陳 麗 璇 助 理 研 究 員 李 婉 甄 助 理 研 究 員 派 赴 國 家 : 日 本 出 國 期 間 : 103 年 8 月 1 日 至 103 年 8 月 18 日 報 告 日 期 : 103 年 11 月 16 日

2 摘 要 本 次 赴 日 本 北 海 道 執 行 103 年 候 鳥 遷 徙 途 徑 與 家 禽 流 行 性 感 冒 風 險 預 警 之 國 際 交 流 及 新 浮 現 傳 染 病 區 域 聯 防 機 制 之 建 立 計 畫, 日 本 北 海 道 大 學 獸 醫 學 研 究 所 微 生 物 學 研 究 室 為 禽 流 感 參 考 實 驗 室 通 過 世 界 動 物 衛 生 組 織 (OIE) 認 可, 家 禽 流 行 性 感 冒 ( 禽 流 感 ) 診 斷 及 研 究 經 驗 豐 富, 且 密 切 關 注 亞 洲 地 區 禽 流 感 的 病 毒 活 動 情 形, 有 關 蒙 古 越 南 西 伯 利 亞 等 地 區 的 病 毒 活 動 範 圍 也 都 略 有 涉 獵, 而 2014 年 4 月 日 本 熊 本 縣 爆 發 H5N8 高 病 原 性 禽 流 感, 而 在 稍 早 時 間 2014 年 韓 國 於 1 月 及 4 月 皆 爆 發 H5 亞 型 禽 流 感, 因 此 不 排 除 感 染 熊 本 縣 雞 場 的 病 毒 藉 由 野 鳥 傳 播 的 可 能 本 次 連 絡 北 海 道 大 學 迫 田 義 博 教 授 得 知 對 方 已 針 對 2014 年 熊 本 縣 病 毒 進 行 一 系 列 相 關 研 究, 其 中 還 包 括 對 於 烏 鴉 的 攻 毒 試 驗, 並 同 意 本 所 研 究 人 員 共 同 參 與 另 外 討 論 野 鳥 禽 流 感 資 料 分 析, 學 習 改 良 式 神 經 氨 酸 酶 抑 制 試 驗 (NI test), 並 評 估 應 用 於 家 禽 場 血 清 監 測 之 可 行 性 亦 是 本 次 重 點 日 方 分 享 正 在 進 行 中 的 台 日 及 鄰 近 國 家 H5 亞 型 高 病 原 性 禽 流 感 病 毒 的 病 原 性 及 親 緣 性 分 析, 其 中 告 知 於 越 南 H5 活 躍 的 禽 流 感 病 毒 與 2014 年 熊 本 縣 爆 發 H5N8 病 毒 的 病 原 性 已 與 我 國 現 有 使 用 的 H5 抗 體 在 病 原 性 上 有 很 大 的 差 異, 如 使 用 我 們 現 有 的 H5 抗 血 清 可 能 會 無 法 及 時 鑑 定 這 些 病 毒, 日 方 亦 表 示 可 提 供 應 急 之 抗 體 甚 至 我 方 相 關 單 位 許 可 的 話 可 直 接 提 供 病 毒, 以 供 監 測 需 要 迫 田 義 博 教 授 詳 細 介 紹 於 禽 流 感 實 驗 室 的 生 物 安 全 第 3 等 級 動 物 實 驗 室 (Animal Biosafety Level 3, ABSL3), 包 括 設 備 的 配 置 以 及 使 用 流 程 和 取 代 淋 浴 設 備 的 應 變 作 法, 並 拜 訪 由 前 教 授 喜 田 宏 (Hiroshi Kida) 先 生 規 畫 及 擔 任 負 責 人 的 北 海 道 大 學 人 畜 共 通 疾 病 控 制 研 究 中 心, 參 觀 該 中 心 生 物 安 全 第 3 等 級 實 驗 室 (Biosafety Level 3, BSL3), 並 與 喜 田 宏 教 授 討 論 台 灣 目 前 禽 流 感 問 題 及 對 防 疫 的 建 議 1

3 目 錄 一 過 程 3 二 目 的 5 三 研 習 及 參 訪 機 構 介 紹 6 四 研 習 內 容 7 五 研 習 期 間 觀 察 與 心 得 29 六 建 議 事 項 32 七 附 件 34 附 件 一 北 海 道 大 學 2014 年 野 鳥 與 家 禽 場 之 家 禽 流 行 性 感 冒 監 測 概 況 35 2

4 一 過 程 研 習 課 程 表 : 日 期 8 月 1 日 ( 五 ) 研 習 單 位 及 內 容 桃 園 中 正 國 際 機 場 搭 機 飛 往 日 本 北 海 道 札 幌 市 (Sapporo, Hokkaido ) 新 千 歲 (New Chitose Airport) 國 際 機 場 烏 鴉 接 種 病 毒 試 驗, 接 種 研 究 人 員 及 學 生 進 行 自 我 介 紹 8 月 2 日 ( 六 ) 烏 鴉 接 種 病 毒 試 驗 觀 察, 接 種 後 第 一 天 8 月 3 日 ( 日 ) 烏 鴉 接 種 病 毒 試 驗 觀 察, 接 種 後 第 二 天 8 月 4 日 ( 一 ) 烏 鴉 接 種 病 毒 試 驗 觀 察, 接 種 後 第 三 天 犧 牲 部 份 試 驗 烏 鴉 及 處 理 採 樣 檢 體 雞 胚 胎 接 種 烏 鴉 接 種 病 毒 試 驗 觀 察, 接 種 後 第 四 天 8 月 5 日 ( 二 ) 雞 胚 胎 接 種 觀 察, 接 種 後 第 一 天 微 生 物 實 驗 室 學 生 學 術 交 流 岡 松 副 教 授 介 紹 微 生 物 實 驗 室 之 家 禽 流 行 性 感 冒 研 究 歷 史 與 發 展 烏 鴉 接 種 病 毒 試 驗 觀 察, 接 種 後 第 五 天 8 月 6 日 ( 三 ) 雞 胚 胎 接 種 觀 察, 接 種 第 二 天 OIE Ring-trial 經 驗 交 流 與 迫 田 教 授 和 岡 松 副 教 授 學 術 交 流, 討 論 台 日 家 禽 流 行 感 冒 合 作 研 究 之 進 展 及 目 前 之 成 果, 及 未 來 研 究 方 向 8 月 7 日 ( 四 ) 烏 鴉 接 種 病 毒 試 驗 觀 察, 接 種 後 第 六 天 雞 胚 胎 接 種 觀 察, 接 種 第 三 天 HA test HI test 3

5 NI test( 第 一 天 ) 8 月 8 日 ( 五 ) 烏 鴉 接 種 病 毒 試 驗 觀 察, 接 種 後 第 七 天 NI test( 第 二 天 ) 結 果 判 讀 Pestivirus 研 究 介 紹, 大 六 學 生 學 術 交 流 介 紹 目 前 微 生 物 實 驗 室 家 禽 流 行 感 冒 病 毒 H10 亞 型 8 月 9 日 ( 六 ) 烏 鴉 接 種 病 毒 試 驗 觀 察, 接 種 後 第 八 天 8 月 10 日 ( 日 ) 烏 鴉 接 種 病 毒 試 驗 觀 察, 接 種 後 第 九 天 8 月 11 日 ( 一 ) 8 月 12 日 ( 二 ) 8 月 13 日 ( 三 ) 8 月 14 日 ( 四 ) 烏 鴉 接 種 病 毒 試 驗 觀 察, 接 種 後 第 十 天 拜 訪 喜 田 宏 教 授 及 參 觀 人 畜 共 通 疾 病 中 心 烏 鴉 接 種 病 毒 試 驗 觀 察, 接 種 後 第 十 一 天 Transport medium 製 備 烏 鴉 接 種 病 毒 試 驗 觀 察, 接 種 後 第 十 二 天 大 野 池 採 集 野 鳥 糞 便 檢 體 烏 鴉 接 種 病 毒 試 驗 觀 察, 接 種 後 第 十 三 天 OIE Ring-trial 檢 測 方 法 討 論 介 紹 家 禽 流 行 感 冒 病 毒 資 料 庫 及 其 維 護 與 管 理 8 月 15 日 ( 五 ) 烏 鴉 接 種 病 毒 試 驗 結 束, 犧 牲 動 物 與 血 清 採 樣 訪 客 專 題 演 講 : 業 務 介 紹 8 月 16 日 ( 六 ) 北 海 道 野 外 實 地 考 察 8 月 17 日 ( 日 ) 北 海 道 野 外 實 地 考 察 8 月 18 日 ( 一 ) 札 幌 新 千 歲 國 際 機 場 搭 機 返 國, 晚 上 7 點 抵 達 桃 園 國 際 機 場 4

6 二 目 的 聯 繫 北 海 道 大 學 微 生 物 實 驗 室 預 計 於 8 月 進 行 台 灣 分 讓 的 高 病 原 性 禽 流 感 病 毒 株 以 及 2014 年 於 熊 本 縣 爆 發 H5N8 高 病 原 性 禽 流 感 烏 鴉 攻 毒 試 驗 另 外 目 前 本 所 於 檢 測 病 毒 NA 亞 型 時 使 用 的 神 經 氨 酸 酶 抑 制 試 驗, 因 操 作 過 程 繁 複, 希 望 能 學 習 改 良 式 神 經 氨 酸 酶 抑 制 試 驗, 並 評 估 應 用 於 家 禽 場 血 清 監 測 之 可 行 性 而 北 海 道 大 學 對 於 野 鳥 禽 流 感 的 研 究, 因 其 病 毒 資 料 庫 豐 富 且 每 年 皆 派 研 究 人 員 至 各 國 採 樣 以 分 離 野 鳥 及 家 禽 禽 流 感 病 毒, 並 進 行 各 項 研 究 包 含 疫 苗 的 開 發, 從 檢 體 收 集 至 完 整 檢 驗 流 程 及 病 毒 分 離 率 的 分 析, 皆 是 我 們 參 考 學 習 對 象 另 了 解 精 簡 化 的 ABSL 3 實 驗 室, 包 括 設 備 的 配 置 以 及 使 用 流 程 和 取 代 淋 浴 設 備 的 應 變 作 法 交 流 台 日 及 鄰 近 國 家 H5 亞 型 高 病 原 性 禽 流 感 病 毒 的 病 原 性 及 親 緣 性 分 析 結 果, 評 估 未 來 可 能 面 臨 的 爆 發 風 險 5

7 三 研 習 及 參 訪 機 構 介 紹 北 海 道 大 學 獸 醫 學 研 究 所 (Graduate school of veterinary medicine) 疾 病 控 制 學 系 的 微 生 物 學 研 究 室, 由 已 退 休 前 教 授 喜 田 宏 (Hiroshi Kida) 先 生 建 立 的 禽 流 感 實 驗 室, 現 任 負 責 人 則 為 教 授 迫 田 義 博 (Yoshihiro Sakoda) 先 生, 另 外 准 教 授 岡 松 正 敏 (Masatoshi Okamatsu) 先 生 為 試 驗 室 家 禽 流 行 性 感 冒 相 關 研 究 的 負 責 人, 對 於 本 次 研 習 提 供 相 當 大 的 協 助 該 實 驗 室 為 OIE 認 可 禽 流 感 參 考 實 驗 室 之 一, 在 亞 洲 地 區 動 物 流 感 的 相 關 研 究 具 有 相 當 高 的 地 位, 具 備 BSL3 實 驗 室 及 ABSL3 實 驗 動 物 舍 以 供 OIE 及 國 家 禽 病 指 定 實 驗 室 所 需, 獸 醫 學 系 學 生 修 業 需 6 年, 不 論 未 來 方 向 為 臨 床 或 實 驗 室, 第 5 年 級 開 始 必 須 進 實 驗 室 為 畢 業 前 所 需 論 文 準 備, 而 密 集 的 實 驗 排 程 與 計 劃 的 除 對 學 生 有 扎 實 的 訓 練 外, 對 於 實 驗 室 而 言 亦 有 相 當 高 的 學 術 資 料 產 出, 本 次 拜 訪 2 週 的 行 程 即 參 與 了 實 驗 室 數 次 的 專 題 討 論, 討 論 項 目 明 確 精 簡 卻 可 讓 師 生 雙 方 明 確 掌 握 目 的 與 現 況 另 外 微 生 物 學 研 究 室 與 人 畜 共 通 疾 病 中 心 也 有 非 常 密 切 的 合 作 北 海 道 大 學 人 畜 共 通 疾 病 中 心 由 喜 田 宏 先 生 統 籌 規 畫 並 為 現 任 負 責 人, 於 2005 年 成 立, 該 建 築 規 畫 為 一 樓 全 為 BSL3 實 驗 室 及 ABSL 2 和 ABSL 3 實 驗 動 物 舍, 並 作 為 世 界 衛 生 組 織 (WHO) 人 畜 共 通 疾 病 的 合 作 中 心, 有 相 當 多 的 國 際 學 生 參 與 其 研 究 並 可 獲 得 學 位, 也 經 常 不 定 期 舉 行 訓 練 課 程 供 國 內 外 人 員 學 習 6

8 四 研 習 內 容 ( 一 ) 高 病 原 性 家 禽 流 行 性 感 冒 烏 鴉 攻 毒 試 驗 生 物 安 全 第 三 等 級 動 物 實 驗 室 (ABSL 3) 背 景 : 獸 醫 學 系 大 樓 的 五 樓 於 20 年 前 改 建 為 ABSL 3 實 驗 室, 分 成 A B 與 C 三 間,A 與 B 動 物 實 驗 室 以 小 鼠 試 驗 為 主, 設 備 狀 況 均 可 於 實 驗 室 外 的 監 控 設 備 獲 得 當 日 的 數 據, 並 於 進 入 動 物 實 驗 室 前 填 寫 於 紀 錄 本 C 動 物 實 驗 室 則 為 家 禽 流 行 感 冒 病 毒 進 行 病 原 性 鑑 定 最 重 要 的 地 點 現 有 23 個 隔 離 籠, 以 穿 牆 式 滅 菌 器 每 次 可 進 行 2 個 隔 離 籠 的 高 壓 滅 菌, 每 次 1.5~2 小 時, 全 數 隔 離 籠 處 理 需 費 時 一 天 以 上, 依 該 實 驗 室 裡 三 個 大 籠 架, 每 籠 架 可 承 受 9 個 隔 離 籠, 最 多 一 次 可 放 置 27 個 隔 離 籠 進 出 ABSL 3 動 物 實 驗 室 步 驟 : 1. 進 入 : (1) 穿 戴 新 隔 離 衣 及 手 套 後, 於 手 腕 上 貼 膠 帶 將 手 套 固 定 於 隔 離 衣 (2) 穿 戴 舊 隔 離 衣 及 手 套, 再 一 次 於 手 腕 上 以 膠 帶 固 定 手 套 與 隔 離 衣 (3) 依 序 穿 戴 好 口 罩 襪 套 及 護 目 眼 鏡 進 入 緩 衝 區 ( 具 密 碼 鎖 ) (4) 於 緩 衝 區 內 穿 拖 鞋 及 鞋 套, 才 能 進 入 內 門 (5) 進 入 動 物 實 驗 室 後, 先 將 滅 菌 器 裡 的 物 品 放 置 於 緩 衝 區, 或 是 處 理 乾 淨 與 已 滅 菌 事 物 收 拾 上 次 脫 下 的 隔 離 衣 與 襪 套, 分 別 以 滅 菌 袋 裝 好, 進 行 高 壓 滅 菌, 以 便 下 次 進 入 實 驗 室 再 回 收 使 用 ; 而 使 用 過 手 套 膠 帶 鞋 套 則 棄 置 7

9 2. 離 開 : (1) 脫 去 第 一 層 手 套 隔 離 衣 鞋 套 襪 套 及 第 二 層 手 套 的 膠 帶 ( 不 脫 手 套 ), 並 盡 可 能 站 在 第 一 層 隔 離 衣 的 內 面 上 (2) 將 地 上 一 塊 毛 巾 以 Astop 消 毒 液 浸 溼, 拖 鞋 放 置 其 上, 護 目 眼 鏡 置 於 消 毒 液 中, 待 脫 去 第 一 層 隔 離 衣 完 成 後, 才 穿 上 拖 鞋, 以 內 層 手 套 開 門, 進 入 緩 衝 區 (3) 在 內 門 尚 未 關 上 的 同 時, 把 口 罩 手 套 丟 進 實 驗 室 內 的 地 板 上, 最 後 於 緩 衝 區 內 脫 下 內 層 隔 離 衣, 亦 丟 回 實 驗 室 內 的 地 板 上, 拿 出 消 毒 液 中 的 護 目 眼 鏡, 才 能 帶 著 乾 淨 已 滅 菌 之 事 物 ( 例 如 上 次 已 滅 菌 之 廢 棄 物 或 隔 離 衣 ) 或 檢 體 離 開 三 級 動 物 實 驗 室 (4) 離 開 三 級 動 物 實 驗 室 時, 必 定 要 先 洗 手 與 優 碘 漱 口, 才 進 行 其 他 事 物 處 理 ( 例 如 回 收 之 隔 離 衣 晾 乾 襪 套 再 以 洗 衣 機 洗 淨 或 檢 體 處 理 等 ) 進 入 BSL3 實 驗 動 物 舍 前 穿 妥 兩 層 防 護 衣 物 兩 層 手 套 及 封 住 袖 口 8

10 不 得 滅 菌 之 病 毒 或 可 能 汙 染 物 以 傳 遞 桶 攜 帶 本 次 試 驗 之 野 生 烏 鴨 點 鼻 方 式 攻 毒 烏 鴉 每 次 進 出 紀 錄 試 驗 室 設 備 狀 況 試 驗 背 景 : 這 次 高 病 原 性 家 禽 流 行 性 感 冒 病 毒 熊 本 株 及 台 灣 的 雲 林 株 所 攻 毒 的 試 驗 對 象 為 烏 鴉, 由 於 烏 鴉 數 量 在 日 本 相 當 多, 並 且 頻 繁 地 出 現 或 生 活 在 城 市 中, 於 2004 年 爆 發 高 病 原 性 H5N1 時, 曾 在 死 亡 烏 鴉 身 上 檢 測 出 病 毒 這 次 試 驗 用 的 烏 鴉 於 夕 張 捕 獲, 並 經 篩 選 為 年 幼 的 烏 鴉, 由 口 腔 中 仍 有 紅 色 黏 膜 可 知 其 尚 為 未 成 年 的 烏 鴉, 試 驗 期 間 可 以 餵 飼 狗 食, 另 需 剪 羽 翅 減 低 其 活 動 力, 並 因 烏 鴉 本 質 上 聰 明 活 潑 且 精 力 旺 盛 給 予 狗 骨 頭 供 轉 移 注 意 力, 以 避 免 烏 鴉 持 續 破 壞 籠 子, 雖 是 如 此 嚴 防, 但 仍 有 烏 鴉 不 停 啄 籠 門 旁 的 橡 膠, 至 使 隔 離 籠 的 氣 密 性 有 受 損 的 可 能 雖 目 前 為 止 尚 未 泩 烏 鴉 成 功 9

11 破 壞 氣 密 功 能, 但 已 有 烏 鴉 成 功 地 破 壞 進 氣 口 之 鐵 網 與 過 濾 網 烏 鴉 常 見 兩 種 大 嘴 及 小 嘴, 其 食 性 略 有 不 同, 由 於 此 試 驗 所 使 用 之 大 嘴 烏 鴉 較 為 雜 食 性, 故 可 以 狗 食 餵 飼 試 驗 使 用 毒 株 : A/CK/TW/0502/12 (H5N2) 10 6 EID 50 /100/L 接 種 1~4 號 烏 鴉 ( 另 尋 時 間 補 做 剩 餘 4 隻 ) A/CK/Kumamoto/1-7/14 (H5N8) 10 6 EID 50 /100/L 接 種 5~12 號 烏 鴉 1. 接 種 流 程 : (1) 12 隻 烏 鴉 均 已 置 於 12 個 隔 離 籠 內 (2) 事 先 需 先 備 妥 三 個 以 上 酒 精 噴 壼 飲 用 水 狗 食 及 足 夠 的 不 锈 鋼 碗 ( 每 籠 準 備 2 個 碗 ), 生 物 安 全 操 作 櫃 中 便 需 放 置 2 個 酒 精 噴 壼 足 夠 的 Astop 消 毒 液 浸 溼 紙 毛 巾 及 滅 菌 袋 (3) 每 個 隔 離 籠 取 下, 出 氣 孔 接 管 處 先 以 酒 精 噴 之, 脫 開 接 管 處 亦 噴 之, 將 整 個 隔 離 籠 置 於 生 物 安 全 操 作 櫃 中 (4) 接 種 病 毒 時, 需 兩 人 共 同 操 作, 一 人 持 病 毒 液, 另 一 人 手 戴 厚 手 套 抓 住 禽 鳥 之 喙 與 雙 腳, 以 固 定 禽 鳥 方 便 進 行 鼻 腔 接 種 以 及 抽 血 (5) 隔 離 籠 另 需 以 Astop 消 毒 液 浸 溼 之 紙 毛 巾 清 潔 玻 璃 籠 門 以 及 氣 密 橡 膠 ( 需 手 戴 厚 手 套 ), 換 置 水 與 食 物 之 後, 使 用 過 的 不 锈 鋼 碗 及 紙 毛 巾 置 於 滅 菌 袋 中, 換 置 過 程 中 慎 防 烏 鴉 逃 脫 (6) 關 上 隔 離 籠, 需 於 隔 離 籠 四 周 及 自 己 的 雙 手 手 肘 均 勻 地 噴 灑 酒 精 ( 可 雙 手 均 持 酒 精 噴 壼 互 相 噴 之, 以 避 免 死 角 ), 再 提 至 籠 架 上 接 上 出 氣 管 10

12 試 驗 動 物 隔 離 籠 配 置 表 #1 TW #5 JP #6 JP #7 JP #8 JP #9 JP #2 TW #3 TW #4 TW # 10 JP #11 JP #12 JP 各 動 物 試 驗 時 程 動 物 編 號 於 接 種 後 3 天 犠 牲 採 樣 #1 TW #2 TW #3 TW #4 TW 持 續 觀 察 至 接 種 後 14 天 試 驗 期 間 死 亡 #5 JP #6 JP (6DPI) #7 JP #8 JP (8DPI) #9 JP #10 JP #11 JP (3DPI) #12 JP 2. 接 種 後 3 天 犠 牲 採 樣 : (1) 前 置 處 理 : 準 備 採 樣 所 需 剪 刀 鑷 子 六 孔 盤 3 ml 採 血 針 ( 內 含 0.5 ml citriacid) 筒 拭 子 檢 體 保 存 液 (transport medium) 傳 遞 箱 標 記 有 毒 株 臟 器 與 鳥 隻 編 號 的 微 量 離 心 管 (eppendorf tubes), 及 犧 牲 動 物 用 的 pentobarbital (1mL/bird) (2) 犧 牲 與 採 樣 皆 於 生 物 安 全 櫃 內 操 作, 每 毒 株 犧 牲 4 隻 烏 鴉 11

13 (3) 待 犧 牲 烏 鴉 每 隻 採 血 1 ml, 隨 後 以 pentobarbital 安 樂 死 (4) 採 咽 喉 與 瀉 殖 腔 拭 子 並 存 於 檢 體 保 存 液 (5) 每 次 只 操 作 一 隻, 每 採 完 一 臟 器 後, 器 械 以 Astop 消 毒 液 擦 拭 後 浸 泡 於 80% 酒 精 再 採 下 一 臟 器 (6) 採 樣 臟 器 : 腦 氣 管 肺 腎 結 腸 各 別 置 於 6 孔 排 不 同 格 內, 並 標 記 六 孔 盤 準 備 採 樣 器 械 準 備 六 孔 盤 盛 裝 採 下 臟 器 事 先 標 記 好 採 樣 管 當 日 犧 牲 採 樣 所 需 管 數 3. 製 做 臟 器 乳 劑 : (1) 秤 重 0.2 g 臟 器 並 置 於 均 質 機 (Multi-bead shocker) 專 用 管 中, 以 鑷 子 夾 取 鋼 球, 一 同 置 於 均 質 管 中, 以 均 質 機 啟 動 2000 rpm 持 續 15 秒 均 質 機 使 用 前, 需 注 意 管 子 放 置 平 衡 (2) 配 上 1.8 ml 檢 體 保 存 液 以 配 置 為 10% 乳 劑, 再 次 以 均 質 機 啟 動 2000 rpm 持 續 15 秒 12

14 (3) 乳 劑 倒 入 2 ml 微 量 離 心 管, 以 8000 rpm 離 心 5 分 鐘 (4) 取 上 清 液 1.5 ml 分 裝 至 3 管 已 標 示 微 量 離 心 管 保 存, 每 管 含 0.5 ml 4. 血 液 咽 喉 與 瀉 殖 腔 拭 子 處 理 : (1) 每 管 血 液 混 勻 後 分 裝 至 3 管 已 標 示 微 量 離 心 管 保 存, 每 管 含 0.5 ml (2) 拭 子 以 3000 rpm 離 心 5 分 鐘, 取 上 清 液 分 裝 至 3 管 已 標 示 微 量 離 心 管 保 存, 每 管 含 0.5 ml (3) 所 有 含 檢 體 之 微 量 離 心 管 在 進 行 下 一 步 細 胞 接 種 前, 均 需 置 於 -80 冰 箱 保 存, 每 次 進 行 一 項 檢 測 便 取 一 管 使 用 ( 二 ) 雞 胚 胎 蛋 接 種 試 驗 試 驗 背 景 : 本 次 研 習 目 的 之 一 為 學 習 改 良 版 的 神 經 胺 酶 抑 制 試 驗, 因 傳 統 的 神 經 胺 酶 抑 制 試 驗 操 作 過 程 中 需 要 使 用 相 當 多 的 玻 璃 試 管, 且 步 驟 需 煮 沸 加 熱, 對 於 操 作 上 相 當 的 不 便 且 有 潛 在 的 危 險, 迫 田 教 授 表 示 他 們 實 驗 室 目 前 常 規 操 作 的 為 改 良 版 且 不 使 用 玻 璃 管 操 作, 也 較 可 同 時 進 行 多 樣 檢 體 的 測 定 需 先 以 雞 胚 胎 蛋 進 行 病 毒 增 殖, 以 供 應 後 續 血 球 凝 集 血 球 凝 集 抑 制 及 神 經 胺 酶 抑 制 試 驗 所 需 檢 體 來 源 選 用 病 毒 株 : 4#: A/duck/Hokkaido/960/1980 (H6N2) 7#: A/duck/Hokkaido/162/2013 (H2N1) 13

15 1. 雞 胚 胎 接 種 (1) 選 用 9-11 天 的 雞 胚 胎 蛋, 照 蛋 劃 出 接 種 尿 囊 腔 的 位 置, 接 種 時 避 開 血 管 (2) 接 種 前 用 尖 錐 尿 囊 腔 上 緣 打 洞, 接 種 後 用 樹 脂 封 口 (3) 每 毒 株 各 接 種 4 顆 蛋, 以 1ml 針 筒 注 射 每 顆 每 顆 蛋 100μ L (4) 蛋 標 記 後 置 培 養 箱 35 培 養 2 天, 並 每 日 觀 察 (5) 將 蛋 置 4 冰 箱 一 天 後 收 集 尿 囊 液 接 種 後 標 記 並 封 住 洞 口 收 集 尿 囊 液 14

16 ( 三 ) 血 球 凝 集 試 驗 (Hemagglutination test; HA test) 利 用 禽 流 行 性 感 冒 病 毒 表 面 血 球 凝 集 蛋 白 (hemagglutinin) 可 與 雞 紅 血 球 可 產 生 凝 集 現 象, 於 本 次 試 驗 的 目 的 為 先 確 認 尿 囊 液 中 是 否 含 有 具 血 球 凝 集 能 力 之 病 毒, 以 進 行 後 續 試 驗 (1) 以 96 孔 微 量 測 定 盤 進 行 試 驗 (2) 每 孔 各 加 入 50 μl PBS (3) 第 1 孔 (A1~G1) 分 別 加 50 μl 尿 囊 液 陰 性 對 照 :H 列 的 第 1 不 加 抗 原 液 (4) 由 第 1 孔 開 始 進 行 50 μl 兩 倍 連 續 序 列 稀 釋, 稀 釋 之 最 後 一 孔 丟 棄 50 μl (5) 全 盤 每 孔 加 50μL 之 0.5% 雞 紅 血 球 懸 浮 液, 貼 上 膠 帶 加 以 標 示 (6) 輕 拍 盤 子 使 混 合 均 勻, 在 室 溫 中 放 置 約 30 分 鐘 血 球 對 照 孔 之 血 球 完 全 沉 降 下 來 即 可 判 讀 (7) 記 錄 HA 力 價 配 置 0.5% 雞 紅 血 球 各 孔 加 入 50μL 之 0.5% 雞 紅 血 球 15

17 ( 四 ) 血 球 凝 集 抑 制 試 驗 (Hemagglutination inhibition test; HI test) 原 理 為 利 用 已 知 的 抗 血 清 中 的 血 球 凝 集 蛋 白 抗 體 與 病 毒 的 血 球 凝 集 蛋 白 產 生 中 和 作 用, 使 病 毒 沒 有 多 餘 的 血 球 凝 集 蛋 白 可 以 使 紅 血 球 凝 集, 依 此 原 理 可 鑑 定 未 知 病 毒 / 抗 原 之 HA 亞 型, 亦 乃 為 現 今 微 生 物 研 究 所 重 要 且 基 本 的 禽 流 感 病 毒 鑑 定 法 而 HA 抗 血 清 製 備 時 需 使 用 所 有 不 同 亞 型 的 已 知 病 毒 株, 如 H1-H16 等, 因 新 城 病 也 同 樣 具 有 血 球 凝 集 能 力, 因 此 也 會 於 HI 試 驗 中, 同 時 使 用 新 城 病 抗 血 清 用 來 區 分 未 知 病 毒 是 否 為 造 成 HA 試 驗 中 血 球 凝 集 的 原 因 進 行 HI test 之 前 會 先 將 未 知 病 毒 / 抗 原 力 價 調 整 為 8 HAU ( 即 需 在 HA test 時 得 到 血 液 凝 集 力 價 為 8 倍 ) (1) 製 備 HI 試 驗 用 未 知 病 毒 / 抗 原 稀 釋 液 及 迴 歸 力 價 測 定 : 計 算 進 行 HI test 待 測 定 檢 體 總 體 積 後, 將 已 知 HA 力 價 未 知 病 毒 / 抗 原 液 以 PBS 稀 釋 為 8 HAU / 50 μl 濃 度 (2) 分 裝 25 μl PBS 至 各 列 的 第 1~10 孔 (11 與 12 排 除 外 ) (3) 分 別 加 25 μl 各 亞 型 及 ND 標 準 抗 血 清 至 A 列 各 孔 (A11 與 A12 除 外 ) (4) 從 A 列 至 H 列 方 向 進 行 25 μl 兩 倍 連 續 序 列 稀 釋, 稀 釋 之 最 後 一 列 各 丟 棄 25 μl (5) 除 排 之 外, 每 孔 加 入 25 μl 8 HAU 試 驗 用 未 知 病 毒 / 抗 原 稀 釋 液 (6) 第 11 排 供 迴 歸 檢 測 (Back titration), 第 11 排 每 孔 加 50μL PBS, 第 一 孔 加 入 50μL 試 驗 用 之 未 知 病 毒 / 抗 原 稀 釋 液, 由 第 1 孔 開 始 進 行 50 μl 兩 倍 連 續 序 列 稀 釋, 稀 釋 之 最 後 一 孔 丟 棄 50 μl 16

18 (7) 第 12 排 為 陰 性 對 照, 每 孔 加 入 50μL PBS (8) 貼 上 膠 帶, 室 溫 感 作 30 分 (9) 加 入 50μL 0.5% 之 雞 紅 血 球 懸 浮 液, 輕 微 振 盪 混 勻 後, 靜 置 室 溫 15 ~ 20 分 鐘 ( 若 病 毒 分 離 自 野 鴨 糞 便 檢 體 則 置 冰 上 30 ~ 60 分 鐘 ) (10) 當 陰 性 對 照 之 血 球 完 全 沉 降 即 可 判 讀, 可 完 全 抑 制 8 HAU 病 毒 / 抗 原 的 血 清 最 高 稀 釋 倍 數 即 為 該 標 準 抗 血 清 之 HI 力 價, 亦 即 該 標 準 抗 血 清 具 完 全 拮 抗 8 HAU 未 知 病 毒 / 抗 原 之 能 力 紀 錄 何 者 標 準 抗 血 清 具 多 少 HI 力 價 操 作 HI 待 檢 測 病 毒 冰 上 靜 置 ( 五 ) 神 經 胺 酶 抑 制 試 驗 (Neuraminidase assay, simplified) 利 用 病 毒 表 面 神 經 胺 酶 活 性 可 切 割 Fetulin 產 生 sialic acid, 將 sialic acid 經 化 學 處 理 後 在 最 後 可 於 溶 液 呈 現 透 明 或 粉 紅 色, 而 依 顏 色 判 定 sialic acid 的 存 在 與 否 而 依 此 推 測 病 毒 是 否 存 在 或 NA 活 性 有 效 而 若 有 已 備 製 之 禽 流 感 常 見 之 N1~N9 抗 血 清, 則 可 進 行 神 經 胺 酶 抑 制 試 驗, 鑑 定 禽 流 感 之 NA 亞 型 材 料 : (1) 0.2M Phosphate buffer (ph5.9) 17

19 混 合 0.4M Na 2 HPO 4 19 ml 及 0.4M NaH 2 PO 4 81 ml, 並 調 整 ph 值 到 5.9 (2) Fetuin substrate 10 ml SDW 中 加 入 500 mg fetuin, 再 加 入 10 ml 0.2M Phosphate buffer (3) Periodate reagent ( 需 避 光 ) 38 ml SDW 中 加 入 4.28g NaIO 4, 再 加 入 62 ml 磷 酸 (H 3 PO 4 ) (4) Arsenite reagent 100 ml SDW 中 加 入 10 g NaAsO 2 及 7.1 g Na 2 SO 4 最 後 加 入 0.3 ml 濃 硫 酸 * 配 製 時 請 停 止 風 扇 運 轉, 並 戴 口 罩 與 手 套 另 外 此 試 劑 含 砷, 勿 倒 入 水 槽 (5) Thiobarbituric acid reagent (TBA) 200 ml SDW 中 加 入 1.2 g Thiobarbituric acid 及 14.2 g Na 2 SO 4, 並 加 熱 至 溶 解 (6) 10 倍 稀 釋 標 準 血 清 N1-N9, NDV,S1 (Swine H1N1) 共 11 種 (7) 滅 菌 PBS (8) 微 量 離 心 管 (Eppendorf tubes, 25 tubes for 1 sample) NI test 所 需 材 料, 注 意 需 避 光 藥 劑 與 有 毒 的 砷 劑 Thiobarbituric acid 有 沉 澱 屬 正 常 現 象, 使 用 時 避 開 沉 澱 物 即 可 18

20 步 驟 : (1) 將 待 測 病 毒 液 分 別 以 PBS 稀 釋 10 倍 與 100 倍 (2) 標 記 微 量 離 心 管 對 應 的 病 毒 稀 釋 倍 數 以 及 抗 血 清 病 毒 稀 釋 液 與 10 倍 稀 釋 抗 血 清 配 置 表 N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 SN1 NDV PBS 10 倍 100 倍 (3) 於 微 量 離 心 管 加 入 10μL 待 測 病 毒 液 以 及 10μL 標 準 血 清 ( 共 22 管 ) (4) 取 1 微 量 離 心 管 不 加 病 毒 液 與 血 清, 並 各 以 同 體 積 PBS 取 代, 為 陰 性 對 照 (5) 2 微 量 離 心 管 各 加 入 不 同 稀 釋 倍 數 病 毒 液 各 10μL, 但 不 加 標 準 血 清 並 以 同 體 積 PBS 取 代, 為 陽 性 對 照 (6) 靜 置 室 溫 作 用 1 小 時 (7) 各 管 加 入 20μL Fetuin substrate solution, 混 合 均 勻 後 spin down, 管 子 均 密 封 ( 可 用 parafilm 纒 繞 ), 靜 置 37 至 隔 夜 (8) 第 二 天 各 管 加 入 20μL Periodate reagent, 靜 置 室 溫 作 用 20 分 鐘 (9) 加 入 200μL Arsenite reagent 終 止 反 應, 利 用 振 盪 器 混 勻 至 褐 色 消 失 (10) 加 入 500μL TBA 並 混 勻, 置 於 80 以 上 熱 水 浴 15 分 鐘 直 至 溶 液 顏 色 變 粉 紅 (11) 因 抗 血 清 完 全 拮 抗 病 毒 之 NA 活 性 則 顏 色 會 轉 為 透 明, 仍 有 NA 活 性 為 粉 紅 色, 活 性 較 弱 則 為 淡 粉 紅 19

21 準 備 與 標 示 所 需 微 量 離 心 管 已 10 倍 稀 釋 NI test 標 準 血 清 置 於 80 以 上 熱 水 浴 15 分 鐘 80 以 上 熱 水 浴 15 分 鐘 後 溶 液 變 粉 紅 色 注 意 事 項 : 試 驗 後 反 應 液 體 因 含 砷 劑 為 毒 性 物 質, 需 另 外 倒 出 回 收, 裝 過 的 容 器 也 要 另 外 處 理 處 理 含 砷 劑 廢 液 接 觸 過 砷 劑 物 品 需 封 口 後 才 丟 棄 20

22 結 果 : NI test 會 有 如 同 HI test 有 HA 與 NA 兩 者 交 互 影 響 的 情 況, 而 使 檢 測 結 果 果 可 能 會 有 兩 種 以 上 的 NI 反 應, 有 必 要 的 話 必 須 檢 視 標 準 血 清 並 對 照 HI 結 果 重 新 找 其 他 病 毒 株 的 NA 標 準 血 清 重 作 以 本 次 進 行 病 毒 亞 型 鑑 定 之 H2N1 為 例, 原 理 上 應 被 N1 之 標 準 抗 血 清 所 拮 抗, 因 而 與 N1 抗 體 作 用 而 無 法 呈 現 NA 活 性, 反 應 液 呈 現 透 明 色, 因 此 N1 與 SN1 反 應 管 均 呈 現 透 明 色 但 卻 出 現 N2 反 應 管 同 樣 呈 現 透 明 色, 原 因 為 該 N2 抗 血 清 備 製 時 所 使 用 之 病 毒 為 H2N2, 因 HA 與 NA 俱 為 病 毒 表 面 蛋 白, 若 HA 的 抗 原 抗 體 複 合 物 過 大 過 多 而 可 能 干 擾 或 遮 蔽 NA 活 性 呈 現 遇 到 此 類 情 形, 另 需 選 用 相 同 NA 亞 型 但 不 同 HA 亞 型 之 抗 血 清 利 用 吸 光 度 檢 測 NA 力 價 或 進 行 序 列 分 析 本 次 試 驗 操 作 目 的 為 判 定 未 知 病 毒 的 NA 亞 型, 而 在 本 所 預 計 將 應 用 為 偵 測 血 清 中 的 抗 體 種 類, 雖 然 原 理 相 同, 但 若 血 清 中 帶 有 兩 種 以 上 病 毒 抗 體 時 會 難 以 區 別 NA 亞 型 7# H2N1 檢 體 NI test 結 果 4# H6N2 檢 體 NI test 結 果 ( 六 ) Transport medium 檢 體 保 存 液 配 製 此 保 存 液 除 了 適 用 於 野 鳥 採 集 之 糞 材 之 外, 亦 適 用 於 拭 子 或 試 驗 動 物 之 臟 器 同 時 可 做 為 MDCK 細 胞 株 之 培 養 液 21

23 材 料 : MEM 粉 末 Penicillin G potassium (1,000,000 units) Streptomycin (1 g) Gentamicin sulfate (1 ml) Nystatin ( 為 預 防 黴 菌 之 藥 物, 原 始 形 態 為 粉 末, 以 0.2 g 與 SDW 4mL 及 96 ml PBS 混 合 備 用 ) Bovine Serum Albumin Fraction V (Roche,# g) 10% NaHCO3 ( 及 粉 末 狀 藥 品 ) 超 純 水 步 驟 : (1) 1.88 g 的 MEM 粉 末 溶 於 150 ml 的 超 純 水 中 (2) 加 入 下 列 藥 品 :( 無 法 以 滅 菌 器 進 行 滅 菌 者 ) Penicillin G potassium:2 瓶 ( 最 終 濃 度 為 10,000U/mL) Streptomycin:2 瓶 ( 最 終 濃 度 為 10 mg/ml) Gentamicin sulfate:1 瓶 ( 最 終 濃 度 為 0.3 mg/ml) Bovine Serum Albumin Fraction V:1 g( 最 終 濃 度 為 0.5%) Nystatin:5 ml 利 用 10% NaHCO3 調 整 ph 值 到 7.5 ( 一 開 始 可 使 用 NaHCO3 粉 末 調 整, 待 顏 色 開 始 變 化, 再 使 用 10% NaHCO3 進 行 微 調 ) 用 量 筒 將 總 量 以 超 純 水 加 到 200 ml (3) 利 用 特 殊 過 濾 玻 璃 套 組 裝 置, 接 上 真 空 幫 浦, 以 通 過 0.45 μm 過 濾 膜 的 方 式 達 到 無 菌 的 效 果 注 意 事 項 : (1) 由 於 Bovine Serum Albumin Fraction V 遇 水 會 變 黏, 因 此 配 製 檢 體 保 存 液 時, 需 選 用 廣 口 瓶, 利 於 粉 末 加 入 而 不 致 於 22

24 吸 附 瓶 壁 上 (2) Nystatin 粉 末 會 留 滯 於 最 後 步 驟 的 過 濾 膜 上, 因 此 若 有 液 態 的 Nystatin 可 選 用 較 佳 (3) 試 驗 過 程 中 另 需 備 有 ph 校 正 儀 已 滅 菌 之 過 濾 裝 置 真 空 幫 浦 及 純 水 設 備 等 校 正 溶 液 酸 鹼 值 過 濾 玻 璃 套 組, 連 接 真 空 幫 浦 野 鳥 檢 體 採 樣 及 處 理 1. 糞 便 採 集 需 攜 帶 的 材 料 : 保 溫 箱 碎 冰 5 ml 小 採 樣 管 採 樣 木 片 夾 鍊 袋 酒 精 棉 手 套 垃 圾 袋 採 樣 時 間 地 點 : 大 野 池 位 於 北 海 道 大 學 校 園 內, 為 學 校 內 重 要 地 標 之 一, 每 年 的 9 月 到 11 月, 為 野 鳥 暫 時 的 棲 地, 因 11 月 以 後 大 野 池 面 會 結 凍, 野 鳥 會 全 數 離 開 也 因 此 每 年 微 生 物 實 驗 室 會 在 9 月 到 11 月 間, 對 大 野 池 及 北 方 一 處 名 為 稚 內 的 野 鳥 棲 地 進 行 野 鳥 家 禽 流 行 性 感 冒 病 毒 之 監 測 當 接 近 秋 冬 時, 糞 便 於 枯 草 或 薄 薄 的 雪 地 上, 會 比 較 明 顯 容 易 尋 找, 實 驗 室 人 員 在 採 樣 前 會 先 進 行 觀 察, 該 區 域 活 動 的 禽 鳥 種 類, 再 上 前 採 集 較 為 新 鮮 的 糞 材 23

25 過 程 : 本 次 於 大 野 池 岸 邊 草 叢 間 找 尋 新 鮮 野 鴨 糞 便, 挖 取 少 量 至 於 小 採 樣 管 內 密 封 後 置 於 碎 冰 帶 回 實 驗 室 處 理 研 習 期 間 時 值 夏 末 秋 初, 雖 有 數 隻 鴨 子 徘 徊, 但 大 野 池 四 周 仍 呈 現 綠 草 如 茵 的 景 色, 因 此 黃 棕 帶 綠 的 野 鴨 糞 便 在 草 地 上 並 不 明 顯 ( 白 色 的 尿 酸 含 量 亦 較 少 ), 再 加 上 有 時 尿 酸 含 量 較 多 的 烏 鴉 糞 便, 常 會 影 響 判 別, 因 此 本 次 僅 採 到 兩 件 檢 體 2. 野 鳥 糞 便 處 理 (1) 將 transport medium 加 入 含 有 野 鳥 糞 便 檢 體 試 管 中, 混 合 均 勻 (2) 於 4 下 以 轉 速 2,000 rpm 離 心 5 分 鐘 (3) 取 0.5ml 上 清 液 進 行 雞 胚 胎 蛋 接 種 池 邊 可 觀 察 到 少 數 野 鴨 採 新 鮮 糞 便 檢 體 24

26 ( 七 ) 拜 訪 喜 田 宏 教 授 及 參 觀 人 畜 共 通 疾 病 中 心 本 次 在 迫 田 教 授 介 紹 下 得 以 有 機 會 拜 訪 喜 田 宏 教 授, 喜 田 教 授 與 本 所 禽 流 感 診 斷 實 驗 室 有 相 當 深 厚 的 淵 源, 包 括 診 斷 及 禽 流 感 實 驗 的 建 立, 以 及 檢 測 所 需 的 標 準 毒 株 等 都 提 供 相 當 大 的 幫 助, 對 於 亞 洲 的 禽 流 感 歷 史 與 現 況 也 有 相 當 深 入 的 研 究 目 前 喜 田 教 授 已 於 2014 年 4 月 自 北 海 道 大 學 獸 醫 學 研 究 所 退 休, 現 任 為 人 畜 共 通 疾 病 中 心 最 高 管 理 人, 喜 田 教 授 認 為 台 灣 家 鴨 的 H5 亞 型 病 毒 是 必 需 重 視 的 監 測 項 目, 且 鴨 科 感 染 禽 流 感 病 毒 往 往 不 會 有 血 球 凝 集 抑 制 的 抗 體 力 價 上 升 情 形, 因 此 檢 體 直 接 的 進 行 分 離 或 檢 測 是 比 較 建 議 的 作 法 拜 訪 喜 田 教 授 後, 迫 田 教 授 介 紹 人 畜 共 通 疾 病 中 心, 該 中 心 規 畫 一 層 樓 作 為 生 物 安 全 等 級 3 實 驗 室, 以 方 便 地 下 室 相 關 管 線 連 接, 重 型 機 具 擺 放 以 及 實 驗 動 物 進 出, 中 心 的 出 入 口 設 有 門 禁 管 制, 且 進 出 各 實 驗 室 均 需 以 感 應 卡 解 鎖, 依 不 同 動 物 體 型 規 畫 有 不 同 房 舍 及 專 用 出 入 口, 每 間 房 舍 有 備 有 監 視 器 與 遠 端 電 力 控 制 開 關, 地 下 室 則 為 空 氣 及 水 處 理 系 統, 另 外 於 中 心 之 外 有 大 型 供 電 系 統 以 供 斷 電 時 維 持 所 需, 最 高 可 維 持 約 一 天 整 棟 中 心 的 電 力, 因 電 力 是 維 持 負 壓 也 就 是 生 物 安 全 的 相 當 重 要 的 一 部 分, 因 此 備 援 電 力 被 視 為 相 當 重 要 的 一 環 人 畜 共 通 疾 病 中 心 的 面 積 很 大, 一 樓 設 有 許 多 第 三 等 級 動 物 實 驗 室 第 三 等 級 實 驗 室 與 第 二 等 級 動 物 實 驗 室, 因 此 在 閒 置 的 時 期, 還 可 分 區 關 閉 ( 包 括 負 壓 維 持 系 統 ) 與 分 區 消 毒, 以 彈 性 使 用 及 節 省 能 源 另 外 人 畜 共 通 疾 病 中 心 周 邊 也 由 喜 田 教 授 爭 取 計 畫, 以 開 始 建 設 第 二 三 座 人 畜 共 通 疾 病 中 心, 預 計 於 2015 年 4 月 完 工 對 於 三 級 實 驗 室 的 規 畫, 迫 田 教 授 認 為 一 開 始 的 規 畫 就 決 定 了 後 續 的 使 用 與 維 護 費 用, 若 在 經 費 充 份 的 情 形 之 下, 依 三 級 實 驗 室 25

27 的 設 備 需 求 與 規 定 進 行 建 設 是 最 好 的 選 擇 因 此 在 規 劃 之 前 必 須 審 慎 評 估 日 後 的 需 要 經 費 的 來 源 試 驗 室 大 小 主 要 實 驗 內 容 管 線 配 置 廢 水 處 理 等 相 當 多 因 素 人 畜 共 通 疾 病 中 心 迫 田 教 授 介 紹 實 驗 室 監 控 系 統 及 管 理 人 實 驗 室 外 耗 材 與 準 備 區 人 畜 共 通 疾 病 中 心 備 源 發 電 設 備 BSL3 動 物 實 驗 室 地 下 室 氣 體 液 體 處 理 管 線 與 機 具 配 置 26

28 詳 述 實 驗 室 廢 水 與 氣 體 動 線 人 畜 共 通 疾 病 中 心 1 樓 實 驗 區 試 驗 區 與 非 試 驗 區 示 意 圖 ( 八 ) 病 毒 庫 及 禽 流 感 線 上 資 源 利 用 北 海 道 大 學 建 立 線 上 病 毒 資 料 庫, 內 容 蒐 集 有 病 毒 株 完 整 資 料, 包 括 時 間 地 點 動 物 別 病 毒 力 價 亞 型 與 及 因 序 列 等, 並 結 合 google map 標 示 來 源 地 點, 另 外 還 於 病 毒 株 保 存 庫 實 體 建 立 連 結, 因 此 可 於 線 上 查 詢 庫 存 情 形 及 儲 存 位 置 而 資 料 庫 亦 收 藏 相 關 研 究 論 文 著 作, 並 可 在 病 毒 株 資 料 附 有 論 文 連 結 以 便 搜 尋 線 上 資 料 庫 並 設 有 權 限 分 級, 由 最 高 權 限 管 理 者 決 定 資 料 開 放 程 度, 一 班 學 生 在 校 內 可 查 詢 約 80% 資 料 庫 內 容, 而 校 外 連 線 者 可 查 詢 約 50% 資 料 內 容 病 毒 各 段 基 因 序 列 設 有 篩 選 功 能, 可 以 HA, NA 亞 型 篩 選 並 只 列 出 所 要 找 的 片 段 基 因 對 於 日 後 分 析 工 作 相 當 有 利 岡 松 準 教 授 並 介 紹 病 毒 保 存 庫 的 配 置 與 管 理, 每 一 株 病 毒 皆 詳 細 建 檔, 並 依 常 用 和 長 期 保 存 用 分 置 於 不 同 區 域, 以 免 病 毒 活 溫 度 變 動 或 反 覆 冷 凍 解 凍 而 降 低 活 性, 然 而 線 上 系 統 僅 供 查 閱, 故 當 學 生 取 用 27

29 病 毒 後 線 上 的 庫 存 數 量 並 不 會 馬 上 隨 之 更 動, 而 是 每 半 年 或 一 年 需 個 別 清 點, 工 程 相 當 浩 大, 偶 爾 也 會 發 現 有 病 毒 株 僅 剩 極 少 庫 存 的 情 況, 仍 是 目 前 管 理 上 較 為 不 便 的 地 方 資 料 庫 入 口 資 料 分 類 為 病 毒 庫 與 研 究 文 獻 病 毒 資 料 庫 以 一 般 校 外 使 用 者 可 查 詢 的 權 限, 部 分 病 毒 附 有 採 樣 地 點 google map 標 示, 以 及 定 序 情 況 與 動 物 試 驗 結 果 28

30 五 研 習 期 間 觀 察 與 心 得 本 次 研 習 期 間, 迫 田 教 授 邀 請 我 們 參 加 為 生 物 實 驗 室 各 次 專 題 討 論, 演 講 者 不 論 師 生 都 以 英 文 演 說, 教 授 表 示 他 們 很 希 望 能 以 國 際 合 作 的 部 分 訓 練 學 生 不 會 害 怕 或 逃 避 使 用 英 文 而 學 生 除 了 在 演 說 之 外 對 於 外 國 研 習 人 員 也 會 主 動 接 觸 與 協 助, 且 北 海 道 大 學 微 生 物 實 驗 室 目 前 每 年 皆 安 排 研 究 人 員 包 括 準 教 授 或 博 士 班 學 生 至 蒙 古 越 南 等 地 採 樣 部 分 大 學 學 生 也 會 於 暑 期 至 與 實 驗 室 有 合 作 的 泰 國 或 其 他 國 家 實 驗 室 研 習 或 進 行 研 究 迫 田 教 授 也 提 到 日 本 獸 醫 的 修 業 所 需 時 間 為 六 年, 畢 業 後 的 資 格 等 同 國 內 其 他 科 系 的 碩 士, 學 生 在 畢 業 之 前 必 須 完 成 畢 業 研 究 論 文 報 告, 因 此 在 大 五 大 六 兩 年 就 必 須 進 入 實 驗 室 開 始 相 關 研 究, 不 論 未 來 工 作 是 否 決 定 以 臨 床 或 實 驗 室 為 主 烏 鴉 試 驗 中 主 要 負 責 人 原 為 岡 松 正 敏 準 教 授, 另 外 還 有 大 五 學 生 小 笠 原 浩 平 參 與 迫 田 教 授 與 岡 松 準 教 授 與 我 們 分 享 目 前 幾 株 亞 洲 高 病 原 性 禽 流 感 毒 株, 包 含 台 灣 2012 年 H5N2 與 2014 年 熊 本 縣 等 毒 株 的 研 究 計 劃 進 度 與 成 果, 值 得 一 提 的 是 於 抗 原 性 分 析 的 結 果, 以 台 灣 分 讓 北 海 道 大 學 的 A/ck/TW/0502/12 A/ck/TW/A703-1/08 毒 株 其 抗 原 性 差 異 與 本 次 爆 發 於 熊 本 縣 的 毒 株 差 異 相 當 大 而 另 外 親 緣 性 分 析 上 熊 本 縣 的 HA 基 因 序 列 落 在 clade 2.3.4, 因 此 推 測 以 目 前 我 們 所 使 用 的 抗 血 清 可 能 對 於 偵 測 clade 甚 至 clade 會 較 有 困 難, 因 這 兩 群 毒 株 來 源 都 在 我 們 鄰 近 國 家 發 生, 需 謹 慎 看 待 可 以 的 話 先 備 好 足 以 應 付 緊 急 狀 況 的 標 準 血 清 而 在 資 訊 交 流 過 程 可 發 現, 對 於 每 一 株 重 要 病 毒 株, 實 驗 室 都 會 例 行 性 且 很 有 計 畫 的 完 成 基 礎 的 資 料, 包 括 動 物 試 驗 如 雞 隻 靜 脈 內 注 射 致 死 率 試 驗 或 點 鼻 試 驗 ( 雞 鴨 烏 鴉 ) 基 因 定 序, 親 緣 性 分 析 抗 原 性 分 析 等, 以 作 為 後 續 研 究 的 基 礎 資 料 關 於 野 鳥 監 測 的 部 份, 北 海 道 大 學 獸 醫 學 研 究 所 微 生 物 實 驗 29

31 室 進 行 野 鳥 家 禽 流 行 性 感 冒 監 測 歷 來 已 久, 範 圍 遍 布 東 亞 及 東 南 亞, 包 括 俄 羅 斯 西 伯 利 亞 ( 東 區 西 區 及 遠 東 區 ) 蒙 古 中 國 青 海 越 南 活 禽 市 場 澳 洲 美 國 阿 拉 斯 加 及 日 本 北 部 統 計 自 1991 至 2013 為 止, 一 共 採 集 49,320 檢 體, 並 成 功 分 離 1,285 株 家 禽 流 行 性 感 冒 病 毒 雖 然 並 非 每 年 進 行 各 國 野 鳥 採 樣, 需 依 該 年 度 是 否 獲 取 計 劃 經 費 支 持 而 定, 但 仍 成 果 豐 碩 另 外 北 海 道 大 學 對 於 野 鳥 採 樣 的 部 分 也 希 望 能 達 成 收 集 到 HA 16 亞 型 與 NA 9 種 亞 型 的 所 有 組 合, 也 就 是 144 種 病 毒, 以 利 相 關 的 疫 苗 研 究 活 動 在 野 鳥 檢 體 的 病 毒 高 分 離 率 也 是 我 們 感 興 趣 的 部 分, 岡 松 準 教 授 表 示, 他 們 採 集 時 間 以 秋 天 且 以 候 鳥 密 集 活 動 的 地 區 為 重 點, 例 如 每 年 9 月 在 蒙 古 的 Uvs lake 周 邊, 一 次 前 往 採 樣 時 間 約 3 天, 採 集 約 2000 支, 回 實 驗 室 後 馬 上 進 行 後 續 處 理, 通 常 都 有 相 當 豐 富 的 收 獲 該 實 驗 室 收 集 之 病 毒 亞 型 共 計 74 種, 另 外 以 病 毒 重 組 及 反 向 遺 傳 方 式 完 成 流 行 感 冒 病 毒 不 同 亞 型 之 資 料 庫 並 將 所 有 病 毒 株 背 景 資 料 病 原 性 抗 原 性 及 庫 存 量 以 網 頁 網 站 方 式 供 大 眾 查 詢 病 毒 資 料 庫 的 抗 原 特 性 分 析 另 有 特 殊 功 能, 尤 其 對 疫 苗 種 毒 株 的 選 擇 很 重 要, 疫 苗 種 毒 株 除 了 選 擇 抗 原 性 相 近 者, 尚 需 考 量 該 病 毒 株 是 否 具 高 增 殖 性 目 前 為 止, 該 實 驗 室 已 利 用 此 病 毒 庫 挑 選 野 鳥 分 離 株 做 為 疫 苗 種 毒 株, 能 成 功 保 護 人 的 全 球 性 H1N1, 及 2013 年 大 陸 發 生 的 H7N9, 以 及 家 禽 的 H9 與 H6 流 行 性 感 冒 病 毒 北 海 道 大 學 負 責 北 日 本 的 野 鳥 禽 流 感 監 測 計 畫, 在 野 鳥 遷 徙 季 節 時 是 實 驗 室 最 忙 碌 的 時 候, 一 週 可 能 要 處 理 的 野 鳥 檢 體 數 量 可 達 1000 件, 有 相 當 多 的 學 生 及 工 作 人 員 投 入 此 部 分 研 究, 在 本 次 操 作 雞 胚 胎 接 種 過 程 中 發 現, 對 方 使 用 的 雞 胚 胎 蛋 即 使 接 種 野 鳥 糞 便 來 源 的 檢 體 也 不 容 易 死 亡, 即 使 接 種 劑 量 高 達 0.5mL 30

32 時 亦 是 如 此, 且 相 當 羨 慕 的 是 因 日 本 雞 隻 血 清 皆 無 禽 流 感 病 毒 抗 體, 因 此 即 使 SPF 雞 蛋 的 生 產 來 不 及 供 應 野 鳥 季 節 時 所 需, 也 有 普 通 蛋 雞 場 可 供 應, 甚 至 一 週 供 應 一 萬 顆 都 不 是 問 題, 價 錢 也 相 當 便 宜, 一 顆 價 格 約 在 0.5 美 金, 日 本 要 求 養 雞 場 必 須 為 禽 流 感 病 毒 血 清 抗 體 陰 性, 對 於 汰 換 SPF 種 雞 以 強 化 子 代 上 也 較 為 容 易, 可 供 應 良 好 品 質 的 試 驗 用 動 物 另 外 日 本 的 家 禽 場 禽 流 感 主 動 監 測 的 方 式 為 家 禽 血 清 不 得 檢 出 抗 體, 一 旦 抗 體 陽 性 場 就 必 須 限 制 移 動, 每 月 採 樣 監 測 直 到 未 檢 出 抗 體 3 個 月 後 才 可 解 除 移 動 管 制, 日 本 今 年 主 動 監 測 禽 流 感 病 毒 與 血 清 抗 體 部 份 至 8 月 為 止, 均 為 陰 性 ( 見 附 件 一 ), 這 也 是 為 什 麼 在 本 年 熊 本 縣 爆 發 疫 情 後 日 本 可 以 在 短 時 間 內 解 除 疫 區 狀 態 的 成 功 原 因 31

33 六 建 議 事 項 本 次 研 習 中 對 於 神 經 胺 酶 抑 制 試 驗 應 用 於 監 測 血 清 的 部 分 件 建 議 以 研 究 為 主, 應 用 於 田 野 間 血 清 檢 體 上 則 較 不 建 議, 因 台 灣 禽 場 田 間 影 響 變 數 太 多, 常 致 使 無 法 判 定 回 到 最 根 本 的 應 以 家 禽 血 清 抗 體 成 為 陰 性 為 最 終 目 標 與 喜 田 教 授 討 論 後, 家 鴨 禽 流 感 的 部 分 也 是 必 須 小 心 的 部 分, 以 本 次 熊 本 縣 發 生 的 H5N8 為 例, 該 病 毒 與 韓 國 爆 發 株 相 近, 微 生 物 實 驗 室 接 種 鴨 隻 試 驗, 發 現 鴨 隻 都 會 存 活, 由 於 韓 國 爆 發 的 是 鴨 隻, 顯 得 難 以 發 覺 病 毒 存 在, 而 日 本 發 生 於 雞 場, 會 造 成 雞 隻 死 亡, 比 較 容 易 查 覺 病 毒 的 擴 散 與 分 布 因 此 對 鴨 隻 的 監 測 應 提 高 警 覺, 然 而 台 灣 的 鴨 隻 面 臨 的 除 了 外 來 的 H5 病 毒 威 脅, 亦 有 台 灣 雞 場 以 及 台 灣 本 土 鴨 隻 特 有 的 H5N2, 而 鴨 隻 感 染 病 毒 後 也 無 法 以 血 球 凝 集 抑 制 的 抗 體 力 價 呈 現, 因 此 對 鴨 隻 的 主 動 監 測 應 儘 可 能 直 接 進 行 病 毒 分 離 或 檢 測 今 年 與 北 海 道 大 學 獸 醫 學 研 究 所 微 生 物 實 驗 室 一 同 參 與 OIE Ring Trial, 研 習 期 間 進 行 家 禽 流 行 性 感 冒 病 毒 的 即 時 反 轉 錄 聚 合 酶 鏈 反 應 (real-time RT-PCR, rrt-pcr) 以 及 傳 統 反 轉 錄 聚 合 酶 鏈 反 應 (RT-PCR) 檢 測 方 法 的 經 驗 交 流 雙 方 均 表 示 目 前 缺 乏 一 套 優 質 的 rrt-pcr 引 子 與 探 針 可 以 完 全 檢 測 全 世 界 的 H5 或 H7, H5 與 H7 基 因 分 別 需 分 2 套 引 子 與 探 針, 以 涵 蓋 歐 亞 群 與 美 洲 群 的 家 禽 流 行 性 感 冒 病 毒 而 本 次 試 驗 檢 體 中 有 1 株 難 以 區 別 之 H7 基 因, 無 法 以 現 有 參 考 實 驗 室 推 薦 之 rrt-pcr 系 統 檢 出, 而 微 生 物 實 驗 室 引 進 越 南 國 家 獸 醫 診 斷 中 心 一 組 引 子 與 探 針 取 代 原 歐 亞 群 H7 的 rrt-pcr, 目 前 已 可 檢 出 所 有 H7 基 因 該 組 引 子 與 探 針, 亦 慷 慨 地 與 我 方 分 享, 而 我 方 使 用 之 傳 統 RT-PCR 引 子 亦 與 日 方 共 享 對 於 野 鳥 檢 體 有 相 當 高 的 分 離 率, 除 了 在 春 秋 於 候 鳥 遷 徙 路 32

34 徑 上 的 停 留 站 加 強 採 樣 之 外, 採 候 鳥 而 非 留 鳥 糞 便 檢 體 新 鮮 程 度 與 是 否 經 曝 曬 過 久 等 因 素, 對 於 檢 體 的 保 存, 採 集 後 盡 快 處 理 並 馬 上 接 種 胚 胎 蛋, 或 許 對 於 分 離 率 有 幫 助 儲 備 其 他 亞 洲 發 生 中 高 病 原 性 病 毒 的 標 準 血 清 甚 至 可 能 的 話 活 病 毒 株 對 於 監 測 也 是 相 當 重 要 的 一 環, 因 抗 血 清 屬 消 耗 性 產 品, 建 議 以 開 放 輸 入 活 病 毒 以 自 行 製 造 抗 血 清 較 為 理 想 且 一 般 研 究 單 位 對 於 分 讓 重 要 病 毒 大 多 為 保 守 態 度, 北 海 道 願 意 如 此 大 方 分 享 相 當 難 得 本 次 前 往 北 海 道 大 學 研 習 相 當 難 得 的 是 有 關 仍 在 進 行 中 的 資 訊 對 方 仍 願 意 大 方 分 享, 且 牽 涉 到 台 灣 病 毒 株 的 部 分 是 以 合 作 的 方 式 進 行 討 論, 由 其 提 到 家 鴨 病 毒 監 測 方 式 與 病 毒 抗 原 分 析 的 問 題 是 我 們 必 須 特 別 留 意 的 部 分, 迫 田 教 授 也 希 望 未 來 雙 方 可 以 持 續 維 持 密 切 的 合 作, 以 強 化 養 禽 場 的 防 疫 以 及 相 關 的 研 究 活 動 33

35 七 附 件 附 件 一 北 海 道 大 學 2014 年 野 鳥 與 家 禽 場 之 家 禽 流 行 性 感 冒 監 測 概 況 34

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