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1 國 立 中 興 大 學 植 物 病 理 學 系 Department of Plant Pathology National Chung-Hsing University 碩 士 學 位 論 文 Master Thesis 評 估 柚 子 精 油 及 檸 檬 桉 精 油 抑 制 植 物 病 原 菌 生 長 與 防 治 植 物 病 害 之 效 果 Evaluation of essential oil from pomelo (Citrus maxima Burm.) and lemon eucalyptus (Eucalyptus citriodora Hook.) on inhibition of plant pathogens and control of plant diseases 指 導 教 授.. 鍾 文 鑫 博 士 Dr. Wen-Hsin Chung 研 究 生.. 黃 建 睿 Chien-Jui Huang 中 華 民 國 一 百 零 四 年 四 月 Apr. 2015

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4 國 立 中 興 大 學 植 物 病 理 學 系 Department of Plant Pathology National Chung-Hsing University 碩 士 學 位 論 文 Master Thesis 評 估 柚 子 精 油 及 檸 檬 桉 精 油 抑 制 植 物 病 原 菌 生 長 與 防 治 植 物 病 害 之 效 果 Evaluation of essential oil from pomelo (Citrus maxima Burm.) and lemon eucalyptus (Eucalyptus citriodora Hook.) on inhibition of plant pathogens and control of plant diseases 指 導 教 授.. 鍾 文 鑫 博 士 (Dr. Wen-Hsin Chung) 研 究 生.. 黃 建 睿 (Chien-Jui Huang) 中 華 民 國 一 百 零 四 年 四 月 Apr. 2015

5 致 謝 首 先, 還 是 要 感 謝 鍾 文 鑫 老 師 多 年 來 的 指 導, 在 實 驗 不 順 利 時 仍 持 續 幫 助 我, 讓 我 得 以 完 成 學 業, 繼 續 往 前 走, 謝 謝 老 師! 回 頭 想 想, 從 我 大 學 進 實 驗 室 到 現 在 已 經 過 了 7 年, 途 中 經 歷 了 許 多 的 變 化, 許 多 的 相 識 與 離 別, 如 今 輪 到 我 要 離 開 了, 心 中 也 是 有 些 不 捨, 想 必 未 來 我 會 十 分 懷 念 這 些 時 光 吧! 這 一 路 走 來, 總 共 換 了 3 個 題 目, 換 了 兩 次 方 向, 在 每 個 題 目 當 中 都 有 學 到 一 些 新 的 東 西, 有 一 些 新 的 想 法, 而 最 後 的 這 個 題 目, 縱 然 是 完 成 得 有 點 倉 促, 但 也 真 的 在 過 程 中 學 到 很 多, 甚 至 在 未 來, 這 個 實 驗 可 能 會 變 成 我 生 活 的 一 部 分 也 說 不 定 做 實 驗 的 過 程 中, 總 是 會 觀 察 到 一 些 有 趣 的 現 象, 其 中 有 些 有 是 從 許 多 次 的 失 敗 中 發 現, 但 在 我 所 參 考 的 過 去 文 獻 中 沒 看 到 的, 舉 例 而 言, 有 些 真 菌 ( 如 :PA01 Cmep1-3 等 ) 的 孢 子 發 芽 是 非 常 需 氧 的, 如 果 用 蓋 著 的 1.5ml 微 量 離 心 管 或 凹 底 玻 片 作 實 驗, 會 發 現 管 底 和 玻 片 中 間 的 孢 子 發 芽 率 很 低 之 類 的, 有 時 真 的 只 要 改 一 個 器 材 或 換 一 個 步 驟, 實 驗 就 可 以 有 很 大 的 改 善 相 信 在 未 來, 這 些 經 驗 也 會 對 我 的 工 作 有 所 幫 助, 所 以 我 也 要 感 謝 這 些 考 驗, 不 斷 給 我 激 勵, 帶 給 我 新 的 想 法 感 謝 實 驗 室 的 各 位 在 我 求 學 過 程 中 對 我 的 建 議 以 及 幫 助, 感 謝 系 上 老 師 們 這 7 年 來 的 指 導 與 協 助, 感 謝 王 智 立 老 師 與 鍾 文 全 老 師 的 改 正, 使 這 篇 論 文 更 加 完 整, 也 謝 謝 王 昇 陽 老 師 實 驗 室 的 人 們 在 分 析 樣 本 時 給 我 的 建 議 與 幫 助, 以 及 至 今 幫 助 支 持 我 求 學 的 家 人 們, 感 謝 一 路 陪 我 走 到 這 裡 的 元 婷, 以 及 所 有 在 這 些 年 來 幫 助 過 我 的 所 有 人 們, 謝 謝 你 們!

6 摘 要 本 研 究 以 臺 灣 常 見 農 產 廢 棄 物 柚 子 皮 與 常 綠 樹 木 檸 檬 桉 落 葉 為 精 油 萃 取 材 料, 並 透 過 蒸 餾 法 萃 取 柚 子 皮 和 檸 檬 桉 落 葉 中 的 精 油, 得 知 其 精 油 含 量 分 別 為 7.2% 與 0.74% 本 研 究 分 析 兩 種 精 油 之 主 要 有 效 成 份, 指 出 柚 子 精 油 中 的 主 要 成 分 為 檸 檬 烯, 約 含 96.27%; 而 檸 檬 桉 精 油 之 主 要 成 分 為 香 茅 醛 與 香 茅 醇, 含 量 分 別 約 為 43.69% 與 17.06% 由 於 精 油 具 揮 發 特 性, 本 研 究 測 試 精 油 以 薰 蒸 的 方 式 對 9 種 植 物 病 原 真 菌 抑 制 的 效 果, 得 知 未 稀 釋 之 柚 子 精 油 可 抑 制 草 莓 灰 黴 病 菌 GBS3-93 與 GBS1-104 菌 株 菌 絲 生 長 達 92.7% 與 100.0%, 然 對 綠 黴 病 菌 Cmep1-3 菌 株 則 有 促 進 生 長 效 果 於 檸 檬 桉 精 油 測 試 結 果 得 知, 當 稀 釋 10 倍 以 下 時, 可 抑 制 所 有 供 試 病 原 菌 達 96.6%-100.0% 本 研 究 亦 測 試 含 精 油 之 PDA 培 養 基 對 供 試 病 原 菌 的 抑 制 效 果, 顯 示 含 稀 釋 100 倍 柚 子 精 油 的 培 養 基 對 小 白 菜 炭 疽 病 菌 PA01 菌 株 與 草 莓 灰 黴 病 菌 GBS1-104 和 GBS3-93 菌 株 之 生 長 抑 制 率 較 佳, 分 別 有 89.8% 81.1% 及 73.4%, 然 對 Cmep1-3 菌 株 有 促 進 生 長 現 象 另 於 PDA 培 養 基 添 加 檸 檬 桉 精 油 測 試 結 果, 得 知 添 加 稀 釋 1,000 倍 檸 檬 桉 精 油 時, 即 可 抑 制 多 數 供 試 植 物 病 原 菌 株 生 長 孢 子 發 芽 的 抑 制 測 試 方 面, 針 對 6 種 供 試 病 原 菌 菌 株 為 對 象, 結 果 顯 示 稀 釋 50 倍 以 下 的 柚 子 精 油, 對 其 中 5 種 病 原 真 菌 抑 制 效 果 達 92.6% 以 上, 然 對 Cmep1-3 菌 株 則 具 促 進 孢 子 發 芽 效 果 (>65.4%) 而 檸 檬 桉 精 油 稀 釋 至 500 倍 時, 仍 對 所 有 供 試 病 原 菌 菌 株 孢 子 發 芽 具 有 80.1% 以 上 的 抑 制 效 果 本 研 究 進 一 步 將 精 油 以 不 同 濃 度 加 入 含 1,000 mg a. i./l 亞 托 敏 之 PDA 培 養 基 中, 得 知 添 加 稀 釋 1,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 後, 可 提 升 抑 制 抗 藥 性 GBS1-104 菌 株 與 非 抗 藥 性 GBS3-93 菌 株 生 長 達 100%; 而 添 加 稀 釋 100 倍 之 柚 子 精 油, 則 可 提 升 抑 制 GBS1-104 菌 株 與 GBS3-93 菌 株 生 長 達 71.0% 與 100.0% 進 一 步 測 試 添 加 精 油 對 亞 托 敏 之 藥 效 增 加 效 果, 顯 示 稀 釋 1,000 倍 與 10,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 和 稀 釋 100 倍 之 柚 子 精 油 對 亞 托 敏 之 藥 效 皆 有 提 升 效 果, 而 以 稀 釋 1,000 i

7 倍 之 檸 檬 桉 精 油 最 佳 本 研 究 測 試 柚 子 精 油 與 檸 檬 桉 精 油 對 胡 瓜 小 白 菜 生 長 及 草 莓 植 株 之 影 響, 指 出 稀 釋 20 倍 以 上 的 柚 子 精 油 對 小 白 菜 生 長 無 明 顯 影 響, 然 稀 釋 100 倍 以 下 之 檸 檬 桉 精 油, 則 會 對 所 有 供 試 植 株 造 成 白 灰 色 斑 點 之 藥 害 本 研 究 測 試 兩 種 精 油 小 白 菜 炭 疽 病 胡 瓜 炭 疽 病 及 草 莓 灰 黴 病 的 防 治 效 果, 處 理 方 式 為 接 種 病 原 菌 前 1 小 時 與 後 1 小 時 噴 施 精 油, 結 果 得 知 於 接 種 後 1 小 時 施 用 檸 檬 桉 精 油 之 效 果 最 佳, 而 草 莓 果 實 灰 黴 病 若 於 接 種 前 處 理 稀 釋 50 倍 之 柚 子 精 油 與 稀 釋 500 倍 之 檸 檬 桉 精 油 時, 有 促 進 發 病 的 現 象 本 研 究 證 實 柚 子 與 檸 檬 桉 精 油 具 防 治 植 物 病 害 與 降 低 抗 藥 性 發 生 之 潛 力, 未 來 可 進 一 步 測 試 精 油 於 溫 室 與 田 間 提 升 亞 托 敏 藥 效 之 效 果, 以 及 篩 選 適 當 的 施 用 方 法 或 劑 型, 將 精 油 開 發 為 可 實 際 應 用 之 防 治 資 材 關 鍵 字 : 精 油 柚 子 檸 檬 桉 抗 藥 性 農 業 廢 棄 物 ii

8 Abstract The essential oils of pomelo peel and lemon eucalyptus fallen leaves extracted by steam-distillation revealed that the essential oil content of pomelo peel and lemon eucalyptus fallen leaves was 7.2% and 0.74%, respectively. The chemical composition of the two essential oils analyzed by GC-MS showed that the major component of pomelo essential oil was limonene (96.27%) while the major components of lemon eucalyptus essential oil were citronellal (43.69%) and citronellol (17.06%). The antifungal activity of essential oils against 9 plant pathogens was tested by the volatile activity assay. The results of volatile activity assay showed that, 1X pomelo could decrease the growth of Botrytis cinerea GBS3-93 and GBS1-104 to 92.7% and 100.0%, respectively; however, it enhanced the growth of Penicillium digitatum Cmep1-3. Moreover, 10X lemon eucalyptus essential oil could decrease the growth of all tested pathogen at the rate of 96.6%-100.0%. Based on the results of poisoned food assay, which showed that PDA containing 100X pomelo essential oil could decrease the growth of Colletotrichum higginsianum PA01, B. cinerea GBS3-93 and GBS1-104 at the rate of 89.8%, 81.1% and 73.4%, but enhanced the growth of P. digitatum Cmep1-3. In contrast, PDA containing 1,000X lemon eucalyptus essential oil could completely inhibit the growth of most tested pathogens. Furthermore, the spore germination inhibiting tests showed that 50X pomelo essential oil could inhibit over 92.6% spore germination of 5 tested pathogens while facilitate spore germination of P. digitatum Cmep1-3(>65.4%). In contrast, 500X lemon eucalyptus essential oil could inhibit over 80.1% spore germination of all tested pathogens. In this study, adding 100X pomelo essential oil, or 1,000X and 10,000X lemon eucalyptus essential oil to PDA containing 1,000 mg a. i./l azoxystrobin showed enhanced efficacies on inhibiting azoxystrobin resistant and iii

9 sensitive B. cinerea isolates. This effect could also be observed in the experiment which added 100X pomelo essential oil or 1,000X and 10,000X lemon eucalyptus essential oil into PDA containing different concentrations of azoxystrobin. Phytotoxicity tests of essential oils on cucumber, Chinese cabbage and strawberry leaves showed that 20X pomelo and 100X lemon eucalyptus essential oil would damage the leaves of cucumber and strawberry. The control efficacies of anthracnose of Chinese cabbage and cucumber, and gray mold of strawberry indicated that spraying essential oils 1 hour after inoculation would reduce the disease severities of gray mold on strawberry fruit; however, spraying 50X pomelo and 500X lemon eucalyptus essential oils 1 hour before inoculation increased the disease severity. This study showed that pomelo and lemon eucalyptus essential oils are potential diseasecontrol agents to reduce the risk of fungicide-resistance. Keywords: essential oil, pomelo, lemon eucalyptus, fungicide-resistance, agriculture wastes iv

10 目 次 中 文 摘 要... i 英 文 摘 要... ⅲ 目 次... v 表 次 目 錄... ⅶ 圖 次 目 錄... ⅷ 前 言... 1 材 料 與 方 法... 5 一 供 試 菌 株 與 植 株... 5 二 精 油 萃 取... 5 三 利 用 氣 象 層 析 質 譜 聯 用 技 術 (Gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) 分 析 柚 子 精 油 與 檸 檬 桉 精 油 中 之 有 效 成 分... 6 四 測 試 柚 子 皮 與 檸 檬 桉 葉 片 精 油 對 病 原 菌 生 長 抑 制 效 果... 6 ( 一 ) 薰 蒸 效 果 測 試... 6 ( 二 ) 精 油 培 養 基 對 菌 絲 生 長 抑 制 效 果 測 試... 6 ( 三 ) 精 油 對 孢 子 發 芽 之 抑 制 效 果 測 試... 7 五 於 農 藥 中 添 加 精 油 對 具 抗 藥 性 草 莓 灰 徽 病 菌 菌 株 生 長 抑 制 效 果 測 試... 7 六 農 藥 添 加 精 油 對 於 藥 效 的 提 升 效 果 測 試... 8 七 精 油 對 植 物 生 長 的 影 響 測 試... 8 八 評 估 精 油 防 治 植 物 病 害 之 效 果... 8 ( 一 ) 於 定 溫 生 長 箱 中 精 油 防 治 小 白 菜 炭 疽 病 之 效 果 評 估... 8 ( 二 ) 於 定 溫 生 長 箱 中 精 油 防 治 胡 瓜 炭 疽 病 之 效 果 評 估... 9 ( 三 ) 於 保 濕 環 境 中 精 油 防 治 草 莓 灰 黴 病 之 效 果 評 估... 9 ( 四 ) 於 保 濕 環 境 下 精 油 防 治 草 莓 果 實 灰 黴 病 之 效 果 評 估 v

11 九 統 計 分 析 結 果 一 精 油 之 萃 取 二 柚 子 精 油 與 檸 檬 桉 精 油 中 之 有 效 成 分 分 析 三 測 試 柚 子 皮 與 檸 檬 桉 葉 片 精 油 對 病 原 菌 的 抑 制 效 果 ( 一 ) 測 試 薰 蒸 效 果 ( 二 ) 測 試 精 油 培 養 基 對 菌 絲 生 長 抑 制 效 果 ( 三 ) 測 試 精 油 對 孢 子 發 芽 之 抑 制 效 果 四 測 試 農 藥 添 加 精 油 對 具 抗 藥 性 草 莓 灰 徽 病 菌 生 長 抑 制 效 果 五 測 試 農 藥 添 加 精 油 對 藥 效 提 升 效 果 六 測 試 精 油 對 植 物 的 影 響 七 評 估 精 油 防 治 植 物 病 害 之 效 果 ( 一 ) 定 溫 生 長 箱 中 測 試 精 油 防 治 小 白 菜 炭 疽 病 之 效 果 ( 二 ) 定 溫 生 長 箱 中 精 油 防 治 胡 瓜 炭 疽 病 之 效 果 ( 三 ) 保 濕 環 境 中 精 油 防 治 草 莓 葉 部 灰 黴 病 之 效 果 ( 四 ) 於 保 濕 環 境 下 精 油 防 治 草 莓 果 實 灰 黴 病 之 效 果 討 論 參 考 文 獻 vi

12 表 次 目 錄 表 一 本 試 驗 中 使 用 之 菌 株 表 二 以 柚 子 精 油 薰 蒸 對 供 試 植 物 病 原 真 菌 之 生 長 抑 制 效 果 表 三 以 檸 檬 桉 精 油 薰 蒸 對 供 試 植 物 病 原 真 菌 之 生 長 抑 制 效 果 表 四 柚 子 精 油 培 養 基 對 供 試 植 物 病 原 真 菌 菌 絲 生 長 抑 制 效 果 表 五 檸 檬 桉 精 油 培 養 基 對 供 試 植 物 病 原 真 菌 菌 絲 生 長 抑 制 效 果 表 六 柚 子 精 油 對 供 試 植 物 病 原 真 菌 孢 子 發 芽 之 抑 制 效 果 表 七 檸 檬 桉 精 油 對 供 試 植 物 病 原 真 菌 孢 子 發 芽 之 抑 制 效 果 表 八 1,000 mg a.i./l 亞 托 敏 添 加 於 不 同 濃 度 精 油 對 草 莓 灰 徽 病 菌 菌 株 生 長 抑 制 效 果 表 九 精 油 防 治 小 白 菜 炭 疽 病 的 效 果 表 十 精 油 對 胡 瓜 炭 疽 病 的 防 治 效 果 表 十 一 精 油 防 治 草 莓 葉 部 灰 黴 病 的 效 果 表 十 二 精 油 防 治 草 莓 果 實 灰 黴 病 的 效 果 vii

13 圖 次 目 錄 圖 一 柚 子 皮 為 台 灣 主 要 的 農 業 廢 棄 物 之 一 圖 二 精 油 蒸 餾 萃 取 裝 置 示 意 圖 圖 三 柚 子 精 油 之 氣 相 層 析 圖 圖 四 柚 子 精 油 主 成 分 與 檸 檬 烯 之 質 譜 圖 圖 五 檸 檬 桉 精 油 之 氣 相 層 析 圖 圖 六 化 合 物 B 與 香 茅 醛 之 質 譜 圖 圖 七 化 合 物 D 與 香 茅 醇 之 質 譜 圖 圖 八 化 合 物 E 與 乙 酸 香 葉 酯 之 質 譜 圖 圖 九 化 合 物 F 與 丁 香 烯 之 質 譜 圖 圖 十 於 不 同 濃 度 亞 托 敏 添 加 柚 子 或 檸 檬 桉 精 油 對 抗 亞 托 敏 草 莓 灰 徽 病 菌 菌 株 (GBS1-104) 生 長 抑 制 效 果 測 試 圖 十 一 精 油 對 胡 瓜 葉 片 的 影 響 圖 十 二 精 油 對 小 白 菜 葉 片 的 影 響 圖 十 三 精 油 對 草 莓 葉 片 的 影 響 viii

14 前 言 近 年 來 由 於 安 全 農 業 的 概 念 逐 漸 受 到 重 視, 有 機 農 業 開 始 迅 速 發 展, 許 多 化 學 農 藥 的 替 代 品 開 始 被 開 發 與 推 廣 使 用, 如 天 然 植 物 資 材 拮 抗 微 生 物 油 劑 亞 磷 酸 等, 其 中 植 物 萃 取 液 被 認 為 是 具 有 發 展 成 防 治 試 劑 潛 力 的 一 類 天 然 植 物 資 材 (Hsieh et al., 2005) 由 於 植 物 不 具 有 自 由 移 動 的 能 力, 為 了 抵 抗 外 來 的 威 脅 與 各 種 環 境 逆 境, 許 多 植 物 演 化 出 可 產 生 多 種 具 生 物 活 性 之 二 次 代 謝 物 的 能 力 (Chiang, 2011), 而 這 些 植 物 常 被 人 們 當 作 藥 材 香 料 或 飲 料, 如 枸 杞 (Chinese wolfberry, Lycium barbarum L.) 人 參 (ginseng, Panax ginseng C.A. Meyer) 蔥 (welsh onion, Allium fistulosum L.), 蒜 (garlic, Allium sativum L.) 茶 葉 (tea tree, Camellia sinensis L.) 等 (Yeh, 1998) 植 物 萃 取 液 (plant extracts) 是 透 過 水 乙 醇 甲 醇 乙 酸 乙 酯 或 正 己 烷 等 溶 劑 將 有 效 成 分 萃 取 出 來, 在 植 物 病 害 防 治 上 的 應 用 非 常 廣 泛 (Fan, 2008) Hsieh 氏 等 人 (2005) 曾 報 導 67 種 植 物 的 水 或 50% 乙 醇 萃 取 液 對 4 種 常 見 病 原 菌 生 長 具 抑 制 效 果, 其 中 4 種 萃 取 液 對 蕙 蘭 細 斑 病 菌 (Fusarium proliferatum (Matsushima) Nirenberg ex Gerlach et Nirenberg F801) 19 種 萃 取 液 對 小 白 菜 炭 疽 病 菌 (Colletotrichum higginsianum Saccardo PA01) 7 種 萃 取 液 對 十 字 花 科 黑 斑 病 菌 (Alternaria brassicicola (Schwein.) Wiltshire ABA31) 5 種 萃 取 液 對 百 合 灰 黴 病 菌 (Botrytis elliptica (Berkeley) Cooke B066) 之 孢 子 發 芽 有 顯 著 抑 制 效 果 Fan 氏 等 人 (2008) 的 報 告 中 亦 指 出, 龍 葵 (garden nightshade, Solanum nigrum Linn.) 粗 萃 取 液 可 抑 制 A. brassicicola (ABA31 與 ABB 16) 菌 株 之 孢 子 發 芽 率 達 33-42% 另 植 物 萃 取 液 中, 有 部 分 成 分 由 於 沸 點 較 低, 易 揮 發, 因 此 可 以 用 成 本 低, 操 作 簡 易 的 水 蒸 氣 蒸 餾 法 加 以 萃 取, 而 這 類 的 物 質, 被 稱 為 植 物 精 油 (essential oil) (Lin et al., 2007) 1

15 植 物 精 油 為 一 類 由 植 物 本 身 製 造 的 揮 發 性 化 合 物, 具 有 特 殊 的 氣 味, 目 前 已 有 報 導 指 出, 精 油 在 植 物 的 防 禦 反 應 過 程 中 可 能 扮 演 重 要 角 色 (Bakkali et al., 2008), 且 某 些 精 油 具 有 殺 真 菌 (Sharma and Tripathi, 2006; Vitoratos et al., 2013; Jing et al., 2014) 殺 細 菌 (Kim et al., 1995) 及 抗 蟲 (Choi et al., 2006) 等 功 效 此 外, 精 油 也 常 被 應 用 在 日 常 生 活 中, 如 食 品 保 鮮 劑 驅 蟲 劑 及 抗 菌 劑 等 (Fisher and Phillips, 2008); 而 在 醫 學 上 亦 可 被 用 作 止 痛 劑 鎮 靜 劑 (Bakkali et al., 2008) 消 炎 藥 (Silva et al., 2003) 及 抗 氧 化 劑 (Singh et al., 2012) 目 前 大 部 分 被 使 用 的 精 油 皆 來 自 於 香 草 植 物, 這 些 植 物 由 於 葉 片 枝 條 樹 皮 等, 經 過 搓 揉 後 會 散 發 出 特 別 的 氣 味, 如 : 脣 形 花 科 的 迷 迭 香 (rosemary, Rosmarinus officinalis L.) 薰 衣 草 (lavender, Lavandula stoechas subsp. stoechas L.) 牛 至 (origanum, Origanum syriacum var. bevanii L.) (Soylu et al., 2010) 菊 科 的 洋 甘 菊 (Chamomile, Matricaria chamomilla L.) 桃 金 孃 科 的 檸 檬 桉 (lemon eucalyptus, Eucalyptus citriodora Hook.) 及 芸 香 科 的 芸 香 (ruta, Ruta graveolens Linn.) 與 柚 子 (pomelo, Citrus maxima Burm.) (Jing et al., 2014) 等 其 中, 芸 香 科 柑 橘 屬 與 桃 金 孃 科 桉 屬 植 物 的 精 油, 近 年 來 在 植 物 保 護 上 的 應 用 逐 漸 被 重 視, 且 部 分 精 油 已 被 開 發 成 保 護 製 劑 (Ramezani et al., 2002; Batish et al., 2006; Batish et al., 2008; Fisher and Phillips, 2008; Jing et al., 2014) 芸 香 科 柑 橘 屬 植 物 中 有 許 多 重 要 的 水 果, 如 橙 (orange, Citrus sinensis L.) 柚 子 葡 萄 柚 (grapefruit, Citrus paradisi MacFad.) 檸 檬 (lemon, Citrus limon L.) 等, 主 要 作 為 鮮 食 調 味 料 或 果 汁 原 料 使 用, 其 主 要 食 用 部 位 為 富 含 水 分 的 果 肉, 而 少 數 種 類 的 果 皮 可 作 為 中 藥 材 或 香 料 使 用, 然 大 部 分 仍 會 被 視 為 農 業 廢 棄 物 丟 棄 ( 圖 一 ) 事 實 上, 柑 橘 類 外 果 皮 含 有 大 量 的 糖 與 果 膠, 可 作 為 生 質 燃 料 與 果 膠 萃 取 的 原 料 ; 此 外, 果 皮 中 的 油 囊 細 胞 (oil glands) 內 含 有 大 量 精 油, 可 作 為 萃 取 精 油 的 材 料 (Ladaniya, 2008) 目 前, 柑 橘 精 油 已 被 報 導 具 有 抑 制 細 菌 生 長 (Fisher and Phillips, 2006), 並 作 為 食 物 保 鮮 劑 的 潛 力 (Fisher and 2

16 Phillips, 2008; Jing et al., 2014); 而 柑 橘 精 油 的 主 要 成 分 為 檸 檬 烯 (limonene), 具 抗 癌 能 力, 被 報 導 可 抑 制 大 鼠 體 內 腫 瘤 的 增 長 (Elegbede et al., 1984), 且 具 有 治 療 乳 癌 的 潛 力 (Miller et al., 2013) 於 農 業 應 用 上,Neeta 與 Abhishek 兩 氏 (2006) 曾 指 出,700 mg a.i./l 的 柳 橙 精 油 可 用 於 防 治 10 種 病 原 菌 所 引 起 的 儲 藏 期 病 害, 且 透 過 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 的 觀 察, 證 實 柳 橙 精 油 可 造 成 Aspergillus niger 的 菌 絲 縊 縮 與 破 壞 細 胞 壁 Kuate 氏 等 人 (2006) 的 研 究 亦 得 知, 萃 取 自 抗 柑 橘 斑 點 病 (citrus leaf and fruit spot disease) 之 柑 橘 品 種 的 精 油 可 抑 制 引 起 該 病 害 之 病 原 菌 (Phaeoramularia angolensis (T. Carvalho & O. Mendes) P.M. Kirk) 菌 絲 生 長 超 過 87%, 且 降 低 孢 子 發 芽 率 達 100% 此 外, 檸 檬 精 油 可 利 用 薰 蒸 方 式, 降 低 由 B. cinerea 所 引 起 胡 瓜 儲 藏 期 病 害 的 嚴 重 度 (Vitoratos et al., 2013) 另 依 Jing 氏 等 人 (2014) 綜 述, 柑 橘 屬 的 精 油 對 34 種 以 上 的 植 物 病 原 菌 生 長 有 抑 制 效 果, 主 要 的 抑 菌 成 分 為 檸 檬 烯, 且 依 柑 橘 種 類 的 不 同, 含 量 介 於 31% 至 97% 之 間, 而 以 柚 子 精 油 中 的 檸 檬 烯 含 量 最 高, 可 達 96.62% 柚 子 是 熱 帶 地 區 常 見 水 果, 全 球 每 年 平 均 產 量 超 過 6,000,000 公 噸, 特 別 是 在 華 人 地 區, 柚 子 是 中 秋 節 慶 的 象 徵 性 水 果,2013 年 東 亞 地 區 柚 子 產 量 高 達 3,800,000 公 噸 (Food and agriculture organization of the united nations statistics division, ) 在 台 灣, 柚 子 種 植 面 積 約 有 4,271 公 頃, 每 年 產 量 可 達 60,000 70,000 公 噸 (102 年 農 業 統 計 年 報, 且 柚 子 精 油 已 被 報 導 對 11 種 植 物 病 原 菌 有 抑 制 效 果 (Jing et al., 2014) 檸 檬 桉 (Eucalyptus citriodora Hook.) 為 桃 金 孃 科 桉 屬 的 植 物, 因 其 枝 葉 會 散 發 檸 檬 般 的 香 氣 而 得 名, 且 樹 勢 高 大, 葉 多, 枝 幹 光 滑, 生 長 快 速, 具 有 脫 落 性 的 樹 皮 為 其 重 要 特 徵 (Batish et al., 2006); 而 在 世 界 各 地 亦 常 被 作 為 紙 漿 與 香 水 的 原 料 使 用 (Akhtar et al., 2014) 於 應 用 方 面, 檸 檬 桉 精 油 被 報 導 可 用 於 輔 助 治 療 人 類 後 天 免 疫 缺 乏 症 候 群 (AIDS) 所 併 發 的 結 核 菌 (tuberculosis) 感 染 (Ramos Alvarenga et al., 2014); 在 動 物 醫 學 上 可 利 用 微 膠 囊 的 形 式, 作 為 治 療 綿 羊 腸 胃 3

17 線 蟲 (sheep gastrointestinal nematodes) 感 染 的 藥 劑 (Ribeiro et al., 2014) 農 業 應 用 方 面, 亦 證 實 檸 檬 桉 精 油 可 當 作 殺 真 菌 劑 (Ramezani et al., 2002) 或 殺 蟲 劑 (Batish et al., 2008) Tripathi 氏 等 人 (2008) 曾 指 出,500 mg /L 檸 檬 桉 精 油 可 完 全 抑 制 葡 萄 灰 黴 病 菌 (Botrytis cinerea Persoon) 的 生 長 達 100%;Javed 氏 等 人 (2012) 亦 指 出, 檸 檬 桉 精 油 對 Aspergillus terreus Thom A. nidulans (Eidam) G.Winter A. fumigatus Fresenius 及 A. flavus Link 等 四 種 Aspergillus 屬 的 真 菌 生 長 有 抑 制 的 效 果, 被 認 為 具 防 治 儲 藏 期 病 害 的 潛 力 此 外, 由 於 檸 檬 桉 具 有 明 顯 的 毒 他 效 應 (allelopathy), 而 此 效 應 被 認 為 與 其 精 油 成 分 有 明 顯 關 係, 故 檸 檬 桉 精 油 也 被 認 為 是 一 類 有 潛 力 的 天 然 殺 草 劑 (Batish et al., 2006) 檸 檬 桉 精 油 的 主 成 分 為 香 茅 醛 (Citronellal), 可 作 為 防 蚊 液 的 成 分 使 用 (Kim et al., 2005), 且 具 抗 真 菌 的 效 果 (Nakahara et al., 2003), 被 認 為 是 檸 檬 桉 精 油 中 主 要 具 有 殺 草 效 果 的 成 分 (Batish et al., 2006) 由 於 史 托 比 類 (strobilurin) 殺 菌 劑 的 作 用 位 置 專 一, 且 被 長 期 大 量 使 用, 其 抗 藥 性 問 題 日 趨 嚴 重 ( 其 中 亞 托 敏 (azoxystrobin) 在 台 灣 被 用 於 多 種 植 物 病 害 的 防 治, 在 草 莓 上 可 用 來 防 治 果 腐 病 (phytophthora fruit rot) ( 而 目 前 已 在 同 樣 屬 於 草 莓 果 實 病 原 菌 的 灰 黴 病 菌 (B. cinerea) 的 田 間 族 群 中 發 現 具 有 抗 藥 性 的 菌 株 (Chen, 2008) 故 尋 找 與 開 發 低 抗 藥 性 風 險 之 病 害 防 治 資 材 為 現 今 重 要 的 課 題 之 一 本 研 究 目 的 為,1 ) 蒐 集 柚 子 果 皮 與 檸 檬 桉 落 葉 等 農 業 廢 棄 物 作 為 萃 取 精 油 的 原 料, 測 試 其 對 六 種 常 見 植 物 病 原 真 菌 菌 絲 生 長 與 孢 子 發 芽 的 抑 制 效 果 ;2 ) 將 添 加 兩 種 精 油 後, 測 試 對 具 抗 史 托 比 類 藥 劑 草 莓 灰 黴 病 菌 株 生 長 之 抑 制 效 果,3 ) 進 一 步 評 估 其 對 草 莓 灰 黴 病 胡 瓜 炭 疽 病 及 小 白 菜 炭 疽 病 的 防 治 效 果 4

18 材 料 與 方 法 一 供 試 菌 株 與 植 株 本 研 究 供 試 菌 株 由 國 立 中 興 大 學 植 物 寄 生 菌 暨 菌 類 抗 藥 性 分 子 診 斷 研 究 室 與 中 興 大 學 植 物 害 管 理 研 究 室 提 供, 包 括 小 白 菜 炭 疽 病 菌 (Colletotrichum higginsianum) 菌 株 編 號 PA01 胡 瓜 炭 疽 病 菌 (C. orbiculare (Berk. & Mont.) Arx) 菌 珠 編 號 CO-51 草 莓 炭 疽 病 菌 (C. gloeosporioides (Penzig) Penzig et Saccardo) 菌 株 編 號 CSG 7-3 草 莓 灰 黴 病 菌 (Botrytis cinerea) 菌 株 編 號 GBS3-93 和 GBS1-104 茄 科 疫 病 菌 (Phytophthora capsici Leonian) 菌 株 編 號 PC 番 石 榴 瘡 痂 病 菌 (Pestalotiopsis sp.) 編 號 為 PG6-3 蘭 花 黃 葉 病 菌 (Fusarium solani f. sp. phalaenopsis (Mart.) Sacc.) 編 號 為 CPY-01A 及 香 水 檸 檬 (Citrus medica L. var. medica) 綠 黴 菌 (Penicillium digitatum (Pers.) Sacc.) 編 號 為 Cmep1-3 另 實 驗 中 供 試 植 株 為 農 友 公 司 的 三 鳳 二 號 小 白 菜 (Brassica campestris L. Chinese Group), 草 莓 (Fragaria ananassa Duchesne) 植 株 品 種 為 香 水, 果 實 品 種 為 豐 香, 胡 瓜 (Cucumis sativus L.) 品 種 為 彩 綠 二 號 本 研 究 中 精 油 萃 取 材 料 為 柚 子 果 皮 與 檸 檬 桉 葉 片, 柚 子 品 種 為 文 旦 (C. maxima Burm. f. buntan Hayata), 購 自 台 中 市 南 區 的 水 果 商 場 ; 而 檸 檬 桉 葉 片 則 蒐 集 自 國 立 中 興 大 學 校 園 內 種 植 之 檸 檬 桉 樹 二 精 油 萃 取 本 研 究 萃 取 精 油 之 方 法 修 改 自 Charles 與 Simon 兩 氏 (1990) 所 發 表 的 蒸 餾 萃 取 法, 使 用 裝 置 如 圖 二 將 100 g 的 材 料 以 磨 碎 機 打 碎, 裝 入 1 L 錐 形 瓶 中, 加 入 800 ml 的 一 次 逆 滲 透 過 濾 水 與 攪 拌 子, 將 裝 置 管 線 組 合 後 以 陶 瓷 加 熱 攪 拌 器 攪 拌 並 加 熱, 冷 卻 管 通 以 0 o C-4 o C 之 冷 水, 於 收 集 處 置 放 250 ml 錐 形 瓶, 並 置 於 冷 卻 槽 中 持 續 加 熱 2 小 時 後, 將 收 集 瓶 取 下, 置 於 4 o C 冰 箱 中 靜 置, 待 分 層 後 收 集 上 層 精 油 至 乾 淨 樣 本 瓶 中 秤 重, 並 計 算 回 收 率 5

19 三 利 用 氣 相 層 析 質 譜 聯 用 技 術 (Gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) 分 析 柚 子 精 油 與 檸 檬 桉 精 油 中 之 有 效 成 分 精 油 的 成 分 是 於 中 興 大 學 森 林 系 林 木 代 謝 體 學 暨 天 然 藥 物 開 發 研 究 室 中 之 氣 相 層 析 質 譜 儀 (gas chromatograph mass spectrometer, GC-MS) ( 型 號 :TRACE GC ULTRA-ITQ 900) 進 行 分 析 使 用 的 管 柱 為 DB-5MS 長 度 30 m 內 徑 0.25 µm 載 送 氣 體 為 氦 氣 流 速 為 1 ml/min, 分 流 比 為 1:60, 起 始 溫 度 為 50 o C 維 持 1 min, 接 下 來 以 每 分 鐘 4 o C 的 速 率 加 溫 至 180 o C, 再 改 為 每 分 鐘 15 o C 的 速 率 加 熱 至 280 o C, 並 維 持 10 mins 將 成 分 分 析 結 果 與 National Institute of Standards and Technology (NIST) 資 料 庫 進 行 質 譜 比 對, 並 和 現 有 文 獻 比 較, 以 找 出 可 能 的 有 效 物 質 四 測 試 柚 子 皮 與 檸 檬 桉 葉 片 精 油 對 病 原 菌 生 長 抑 制 效 果 ( 一 ) 薰 蒸 效 果 測 試 將 供 試 病 原 菌 先 培 養 在 馬 鈴 薯 蔗 糖 瓊 脂 培 養 基 (potato sugar agar, PSA)1-2 天 後, 以 直 徑 3 mm 的 圓 形 打 孔 器 切 取 菌 落 邊 緣 菌 絲 塊, 移 至 新 的 PSA 培 養 基 中 央, 倒 置 培 養 基, 在 培 養 基 蓋 中 央 放 置 直 徑 8 mm 圓 形 濾 紙 片, 滴 上 100 µl 未 稀 釋 之 柚 子 精 油 ( 揮 發 後 濃 度 約 為 1,176 mg /L air), 或 以 tween 20 (0.01%) 乳 化 後, 稀 釋 及 100 倍 的 柚 子 精 油 ( 揮 發 後 濃 度 約 為 118 mg /L air 59 mg /L air 24 mg /L air 及 12 mg /L air), 與 稀 釋 及 100 倍 的 檸 檬 桉 精 油 ( 揮 發 後 濃 度 約 為 118 mg /L air 24 mg /L air 及 12 mg /L air), 本 研 究 之 對 照 組 為 水 和 tween 20 (0.01%), 完 成 後 以 封 口 蠟 膜 (parafilm) 將 培 養 基 密 封 灰 黴 病 菌 B. cinerea (GBS3-93 GBS1-104) 置 於 20 o C, 其 餘 病 原 菌 則 置 於 25 o C, 於 每 日 照 光 12 小 時 之 定 溫 生 長 箱 中 培 養, 於 2 天 後 測 量 其 菌 落 生 長 大 小 本 試 驗 中 各 個 處 理 為 3 重 複, 試 驗 重 複 2 次 ( 二 ) 精 油 培 養 基 對 菌 絲 生 長 抑 制 效 果 測 試 6

20 柚 子 精 油 與 檸 檬 桉 精 油 以 tween 20 (0.01%) 乳 化 後, 加 入 已 滅 菌 且 溫 度 約 為 40 o C 之 馬 鈴 薯 瓊 脂 葡 萄 醣 培 養 基 (potato dextrose agar, PDA) 中, 分 別 配 成 含 稀 釋 100 1,000 及 10,000 倍 柚 子 精 油 ( 濃 度 約 為 10,000 mg /L 1,000 mg /L 及 100 mg /L) 和 含 稀 釋 1,000 10,000 及 100,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 ( 濃 度 約 為 1,000 mg /L 100 mg /L 及 10 mg /L) 培 養 基 將 供 試 植 物 病 原 真 菌 之 3 mm 菌 絲 塊 接 種 至 培 養 基 上,B. cinerea (GBS3-93 GBS1-104) 菌 株 置 於 20 o C, 其 餘 菌 株 則 置 於 25 o C, 於 每 日 照 光 12 小 時 之 定 溫 生 長 箱 中 培 養,2 天 後 測 量 其 菌 落 生 長 大 小 本 試 驗 各 處 理 為 4 重 複, 試 驗 重 複 2 次 ( 三 ) 精 油 對 孢 子 發 芽 之 抑 制 效 果 測 試 將 培 養 7 天 之 C. higginsianum PA01 F. solani f. sp. phalaenopsis CPY-01A 及 P. digitatum Cmep1-3 菌 株, 與 培 養 14 天 C. gloeosporioides CSG 7-3 C. orbiculare CO-51 B. cinerea (GBS3-93 GBS1-104) 及 Pestalotiopsis sp. PG6-3 的 孢 子 分 別 以 含 6% (M/M) 蔗 糖 (sucrose) 之 無 菌 水 洗 下, 配 成 spores/ ml 的 孢 子 懸 浮 液, 於 1.5 ml 微 量 離 心 管 中 與 以 tween 20 (0.01%) 稀 釋 及 50 倍 的 柚 子 精 油 或 稀 釋 ,000 及 1,500 倍 的 檸 檬 桉 精 油 混 合 (V:V=1:1), 調 整 容 器 中 柚 子 精 油 的 最 終 濃 度 為 及 100 倍 ; 檸 檬 桉 精 油 最 終 濃 度 為 500 1,000 1,500 及 2,000 倍 均 勻 混 合 後 將 含 精 油 之 孢 子 懸 浮 液 滴 於 乾 淨 載 玻 片 上, 蓋 上 蓋 玻 片, 放 入 置 有 三 角 玻 棒 的 培 養 皿 中,B. cinerea (GBS3-93 GBS1-104) 置 於 20 o C, 其 餘 則 置 於 25 o C, 於 每 日 照 光 12 小 時 之 定 溫 生 長 箱 中, 於 24 小 時 後 記 錄 孢 子 的 發 芽 率, 並 計 算 抑 制 率 本 試 驗 中 各 個 處 理 為 3 重 複, 試 驗 重 複 2 次 五 於 農 藥 中 添 加 精 油 對 具 抗 藥 性 草 莓 灰 徽 病 菌 菌 株 生 長 抑 制 效 果 測 試 參 考 Huang 氏 (2013) 的 方 法, 將 精 油 與 市 售 23% 亞 托 敏 水 懸 劑 ( 挺 力, 貝 士 得 開 發 企 業 有 限 公 司 ) 混 合, 添 加 於 已 滅 菌 且 溫 度 約 為 40 o C 的 PDA 中, 配 成 7

21 含 亞 托 敏 有 效 成 分 1,000 mg a.i./l 且 含 稀 釋 100 1,000 及 10,000 倍 柚 子 精 油 和 含 稀 釋 1,000 10,000 及 100,000 倍 檸 檬 桉 精 油 的 培 養 基 將 抗 藥 性 的 B. cinerea GBS1-104 菌 株 與 非 抗 藥 性 的 GBS3-93 菌 株 置 於 上 述 培 養 基, 於 20 o C 每 日 照 光 12 小 時 之 定 溫 生 長 箱 中 培 養 2 天 並 記 錄 菌 絲 生 長 情 形 本 試 驗 中 各 個 處 理 為 4 重 複, 試 驗 重 複 2 次 六 農 藥 添 加 精 油 對 於 藥 效 的 提 升 效 果 測 試 將 精 油 與 市 售 23% 亞 托 敏 水 懸 劑 ( 挺 力, 貝 士 得 開 發 企 業 有 限 公 司 ) 混 合 後, 添 加 於 已 滅 菌 且 溫 度 約 為 40 o C 的 PDA 中, 配 製 成 含 亞 托 敏 有 效 成 分 及 1,000 mg a.i./l 且 含 稀 釋 100 倍 柚 子 精 油 或 含 稀 釋 1,000 及 10,000 倍 檸 檬 桉 精 油 的 培 養 基 將 抗 藥 性 的 B. cinerea GBS1-104 菌 株 接 種 於 上 述 培 養 基, 於 20 o C 每 日 照 光 12 小 時 之 定 溫 生 長 箱 中 培 養 2 天 並 記 錄 菌 絲 生 長 情 形 本 試 驗 中 各 個 處 理 為 4 重 複, 試 驗 重 複 2 次 七 精 油 對 植 物 生 長 的 影 響 測 試 取 株 齡 14 天 的 小 白 菜 與 胡 瓜 植 株 和 已 有 3~4 片 真 葉 的 草 莓, 噴 灑 3 ml 稀 釋 及 100 倍 的 柚 子 精 油 與 及 1,000 倍 的 檸 檬 桉 精 油, 將 草 莓 植 株 置 於 20 o C, 胡 瓜 與 小 白 菜 置 於 28 o C 每 日 照 光 12 小 時 之 定 溫 生 長 箱 中 生 長,7 天 後 觀 察 其 生 長 情 形 本 試 驗 中 各 個 處 理 為 3 株, 試 驗 重 複 2 次 八 評 估 精 油 防 治 植 物 病 害 之 效 果 ( 一 ) 於 定 溫 生 長 箱 中 精 油 防 治 小 白 菜 炭 疽 病 之 效 果 評 估 參 考 Hsu (2012) 所 發 表 接 種 小 白 菜 炭 疽 病 的 方 法, 取 生 長 於 28 o C, 每 日 照 光 12 小 時, 株 齡 14 天 的 小 白 菜, 接 種 濃 度 10 6 spores/ ml 小 白 菜 炭 疽 病 菌 的 孢 子 懸 浮 液 3 m l 精 油 施 用 方 式 分 別 為 接 種 病 原 菌 前 1 小 時 與 後 1 小 時 噴 灑 3 ml; 而 精 油 施 用 濃 度 為 稀 釋 50 與 100 倍 的 柚 子 精 油, 或 稀 釋 500 與 1,000 倍 8

22 的 檸 檬 桉 精 油 接 種 小 白 菜 炭 疽 病 菌 後 全 程 將 植 株 置 於 相 對 濕 度 為 95%-100% 的 透 明 塑 膠 箱 中, 以 黑 色 塑 膠 袋 套 住 避 光 24 小 時 後 拆 袋 本 試 驗 中 各 個 處 理 為 3 株, 試 驗 重 複 2 次, 接 種 第 4 天 後 記 錄 第 3 4 位 葉 的 發 病 情 形 將 發 病 程 度 分 為 0-4 級,0 級 為 無 可 見 病 斑 ;1 級 為 病 斑 面 積 佔 葉 面 積 1-10%;2 級 為 病 斑 面 積 介 於 11%-25%;3 級 為 病 斑 病 斑 面 積 介 於 25%-50%;4 級 為 病 斑 面 積 大 於 50%, 罹 病 度 之 計 算 如 下 : 第 3 位 罹 病 級 數 + 第 4 位 葉 罹 病 級 數 罹 病 度 (%) = 100 採 計 葉 片 總 數 4 ( 二 ) 於 定 溫 生 長 箱 中 精 油 防 治 胡 瓜 炭 疽 病 之 效 果 評 估 參 考 Ishii 氏 等 人 (2007) 所 報 導 接 種 胡 瓜 炭 疽 病 的 方 法, 將 生 長 於 28 o C, 每 日 照 光 12 小 時 的 定 溫 生 長 箱 中, 株 齡 14 天, 第 二 片 真 葉 完 全 展 開 的 胡 瓜 植 株, 接 種 濃 度 10 5 spores/ml 胡 瓜 炭 疽 病 菌 的 孢 子 懸 浮 液 3 m l, 精 油 施 用 方 式 分 別 為 接 種 病 原 菌 前 1 小 時 與 後 1 小 時 噴 灑 3 ml; 而 精 油 施 用 濃 度 為 稀 釋 50 與 100 倍 的 柚 子 精 油, 或 稀 釋 500 與 1,000 倍 的 檸 檬 桉 精 油 接 種 胡 瓜 炭 疽 病 菌 後 全 程 將 植 株 置 於 相 對 濕 度 為 95%-100% 的 透 明 塑 膠 箱 中, 以 黑 色 塑 膠 袋 套 住 避 光 24 小 時 後 拆 袋 本 試 驗 中 各 個 處 理 為 3 株, 試 驗 重 複 2 次, 並 於 接 種 後 第 7 天 記 錄 其 罹 病 度 將 葉 片 的 發 病 程 度 分 成 0-10 級,0.1 級 為 病 斑 面 積 小 於 1% 0.5 級 為 1-5% 1 級 為 6-10% 2 級 為 10-20% 3 級 為 21-30% 4 級 為 31-40% 5 級 為 41-50% 6 級 為 51-60% 7 級 為 61-70% 8 級 為 71-80% 9 級 為 81-90% 10 級 則 為 91% 以 上 (Ishii et al., 2007), 計 算 公 式 如 下 : 罹 病 度 (%) = ( 罹 病 級 數 該 罹 病 級 數 之 葉 片 數 ) 採 計 葉 片 總 數 ( 三 ) 於 保 濕 環 境 中 精 油 防 治 草 莓 灰 黴 病 之 效 果 評 估 9

23 草 莓 灰 黴 病 之 接 種 是 將 生 長 於 溫 室, 氣 溫 約 o C, 每 日 照 光 12 小 時, 已 有 4-5 片 真 葉 的 草 莓 植 株, 接 種 濃 度 10 6 spores/ml 草 莓 灰 黴 病 菌 B. cinerea GBS1-104 的 孢 子 懸 浮 液 3 m l 精 油 施 用 方 式 分 別 為 接 種 病 原 菌 前 1 小 時 與 後 1 小 時 噴 灑 3 ml; 而 精 油 施 用 濃 度 為 稀 釋 50 與 100 倍 的 柚 子 精 油, 或 稀 釋 500 與 1,000 倍 的 檸 檬 桉 精 油 接 種 後 將 植 株 置 於 透 明 塑 膠 箱 中, 以 黑 色 塑 膠 袋 套 住 避 光 48 小 時 並 拆 袋, 實 驗 進 行 時 氣 溫 約 o C, 塑 膠 箱 中 相 對 濕 度 保 持 在 95%-100% 本 試 驗 中 各 個 處 理 為 3 株, 試 驗 重 複 2 次 並 於 第 14 天 觀 察 植 株 發 病 情 形, 將 發 病 程 度 分 為 0-4 級,0 級 為 無 可 見 病 斑 ;1 級 為 病 斑 面 積 佔 葉 面 積 1-5%;2 級 為 病 斑 面 積 介 於 5%-25%;3 級 為 病 斑 病 斑 面 積 介 於 25%-50%;4 級 為 病 斑 面 積 大 於 50% (Konishi et al., 2010), 計 算 公 式 如 下 ; 罹 病 度 (%) = ( 罹 病 級 數 該 罹 病 級 數 之 葉 片 數 ) 採 計 葉 片 總 數 ( 四 ) 於 保 濕 環 境 下 精 油 防 治 草 莓 果 實 灰 黴 病 之 效 果 評 估 參 考 Zhang 氏 等 人 (2007) 接 種 草 莓 果 實 灰 黴 病 之 方 法, 選 用 重 量 4-10 g, 果 直 徑 2-3 cm, 果 長 cm 之 草 莓 果 實, 以 3 mm 打 孔 器 於 果 實 側 面 製 造 2 mm 深 的 傷 口, 滴 入 10 6 spores/ml 的 草 莓 灰 黴 病 菌 B. cinerea GBS1-104 孢 子 懸 浮 液 15 µl 精 油 施 用 方 式 分 別 為 接 種 病 原 菌 前 1 小 時 與 後 1 小 時 對 果 實 傷 口 處 噴 灑 1 ml, 而 精 油 施 用 濃 度 為 稀 釋 50 與 100 倍 的 柚 子 精 油, 或 稀 釋 500 與 1,000 倍 的 檸 檬 桉 精 油 接 種 後 將 果 實 置 於 相 對 濕 度 為 95%-100% 的 透 明 塑 膠 袋 中, 置 於 20 o C 無 光 照 的 定 溫 生 長 箱 中 本 試 驗 中 各 個 處 理 為 3 顆, 試 驗 重 複 2 次, 於 3 天 後 記 錄 發 病 情 形, 將 發 病 程 度 分 為 0-4 級,0 級 為 無 可 見 病 斑 ;1 級 為 病 斑 直 徑 小 於 0.5 cm;2 級 為 病 斑 直 徑 介 於 cm;3 級 為 病 斑 直 徑 介 於 cm;4 級 為 病 斑 直 徑 大 於 1 cm, 計 算 公 式 如 下 ; 罹 病 度 (%) = ( 罹 病 級 數 該 罹 病 級 數 之 果 數 ) 總 採 計 果 數

24 九 統 計 分 析 本 研 究 所 得 之 實 驗 數 據 以 SPSS Statistics 統 計 軟 體 進 行 分 析, 並 以 Tukey s HSD 法 分 析 比 較 各 處 理 間 之 差 異 11

25 結 果 一 精 油 之 萃 取 以 蒸 餾 萃 取 法 萃 取 柚 子 皮 與 檸 檬 桉 葉 片 之 精 油, 結 果 得 知, 市 售 文 旦 柚 子 皮 100 g 可 萃 取 出 約 7.20 g 柚 子 精 油 ; 另 外 自 100 g 檸 檬 桉 葉 片 中, 可 萃 取 到 約 0.74 g 的 檸 檬 桉 精 油 二 柚 子 精 油 與 檸 檬 桉 精 油 中 之 有 效 成 分 分 析 透 過 GC-MS 分 析 精 油 成 分 的 結 果, 證 實 於 柚 子 精 油 之 氣 相 層 析 圖 譜 的 流 洗 時 間 9.23 min 處 有 一 明 顯 的 訊 號, 占 總 積 分 面 積 約 96.27%( 圖 三 ), 比 對 其 質 譜 圖 與 分 子 量, 判 斷 該 化 合 物 為 檸 檬 烯 (limonene) ( 圖 四 ) 於 檸 檬 桉 精 油 之 氣 相 層 析 圖 譜 之 流 洗 時 間 及 min 處 有 6 個 明 顯 的 訊 號, 稱 之 化 合 物 A B C D E F, 分 別 占 總 積 分 面 積 約 8.91% 43.69% 6.25% 17.06% 12.56% 及 4.50%( 圖 五 ), 其 中 B D E 及 F 透 過 比 對 其 質 譜 圖 與 分 子 量, 判 斷 這 些 化 合 物 分 別 為 香 茅 醛 (citronellal) ( 圖 六 ) 香 茅 醇 (citronellol) ( 圖 七 ) 乙 酸 香 葉 酯 (citronellyl acetate) ( 圖 八 ) 及 石 竹 烯 (caryophyllene) ( 圖 九 ), 而 化 合 物 A 與 C 則 無 法 透 過 比 對 其 質 譜 圖 與 分 子 量 來 判 定 為 何 種 化 合 物 三 測 試 柚 子 皮 與 檸 檬 桉 葉 片 精 油 對 病 原 菌 的 抑 制 效 果 ( 一 ) 測 試 薰 蒸 效 果 於 培 養 基 蓋 內 側 滴 上 柚 子 精 油, 以 薰 蒸 方 式 測 試 精 油 對 供 試 病 原 真 菌 之 生 長 抑 制 效 果, 結 果 得 知, 除 對 Cmep1-3 菌 株 不 具 抑 制 能 力 外, 對 其 餘 供 試 菌 株 之 生 長 抑 制 效 果 與 處 理 濃 度 成 正 相 關 性 ( 表 二 ) 處 理 未 稀 釋 之 柚 子 精 油 100 µl 對 GBS3-93 與 GBS1-104 菌 株 菌 絲 生 長 抑 制 率, 分 別 為 92.7% 與 100.0%; 對 PA01 菌 株 菌 絲 生 長 抑 制 率 為 75.9%; 而 對 其 他 病 原 真 菌 生 長 抑 制 率 則 介 於 0%- 12

26 47.0% 稀 釋 10 倍 之 柚 子 精 油, 對 GBS3-93 GBS1-104 及 PA01 菌 株 菌 絲 生 長 抑 制 率 皆 明 顯 降 低, 分 別 為 53.0% 43.0% 及 30.9%; 而 對 其 他 病 原 真 菌 之 抑 制 率 則 介 於 0.0%-10.0% 稀 釋 20 倍 之 柚 子 精 油 對 所 有 供 試 病 原 菌 之 抑 制 率 介 於 0.0%-21.0%; 而 當 柚 子 精 油 稀 釋 50 倍 後, 對 所 有 供 試 病 原 真 菌 之 生 長 抑 制 皆 無 顯 著 效 果 本 研 究 得 知, 柚 子 精 油 對 Cmep1-3 菌 株 生 長 無 抑 制 效 果, 反 而 可 促 進 菌 株 生 長 於 檸 檬 桉 精 油 薰 蒸 測 試 結 果 得 知, 稀 釋 10 倍 之 檸 檬 桉 精 油, 對 所 有 供 試 植 物 病 原 真 菌 生 長 抑 制 效 果 佳 ( 表 三 ), 其 中 對 GBS3-93 GBS1-104 PA01 CO- 51 PC Cmep1-3 及 CPY-01A 菌 株 之 生 長 抑 制 率 達 100.0%, 而 對 CSG7-3 與 PG6-3 菌 株 生 長 抑 制 率 稍 低, 分 別 為 96.6% 與 96.8% 稀 釋 50 倍 之 檸 檬 桉 精 油 對 GBS1-104 菌 株 生 長 抑 制 率 仍 有 100.0%, 然 對 Cmep1-3 CPY-01A CO-51 PC PA01 及 GBS3-93 菌 株 生 長 抑 制 率 則 介 於 51.0%-93.3%; 另 對 CSG7-3 PG6-3 菌 株 生 長 抑 制 率 分 別 為 29.6% 與 45.0% 稀 釋 100 倍 之 檸 檬 桉 精 油, 對 GBS1-104 與 GBS3-93 菌 株 生 長 抑 制 率 仍 有 76.8% 與 89.0%, 然 對 其 他 病 原 菌 之 生 長 抑 制 率 則 介 於 0.0%-39.8%( 表 三 ) ( 二 ) 測 試 精 油 培 養 基 對 菌 絲 生 長 抑 制 效 果 測 試 柚 子 精 油 培 養 基 對 各 供 試 病 原 真 菌 之 生 長 抑 制 效 果, 結 果 如 表 四 所 示 含 稀 釋 100 倍 柚 子 精 油 培 養 基, 對 PA01 GBS1-104 GBS3-93 PC PG6-3 及 CSG7-3 等 菌 株 生 長 抑 制 效 果 較 佳, 分 別 為,89.8% 81.1% 73.4% 77.9% 69.1% 及 55.8%, 而 對 CPY-01A 與 CO-51 僅 有 35.5% 與 17.2% 的 抑 制 效 果 ; 當 柚 子 精 油 稀 釋 1,000 倍 及 10,000 倍 後, 對 所 有 供 試 病 原 真 菌 生 長 抑 制 率 介 於 0.0%-38.7%, 抑 制 效 果 不 顯 著 另 柚 子 精 油 培 養 基 對 來 自 香 水 檸 檬 之 綠 黴 菌 Cmep1-3 菌 株 之 生 長 抑 制 無 效 果, 且 可 促 進 其 生 長, 各 稀 釋 濃 度 之 促 進 率 介 於 17.5%-48.6% 13

27 於 檸 檬 桉 精 油 測 試 結 果 如 表 五 所 示 稀 釋 1,000 倍 檸 檬 桉 精 油 對 各 供 試 病 原 真 菌 之 生 長 抑 制 率 介 於 72.2%-100.0%, 對 GBS1-104 GBS3-93 CSG7-3 PA01 CO-51 PC 及 CPY-01A 菌 株 之 生 長 抑 制 率 可 達 100.0%; 然 稀 釋 10,000 倍 後 之 精 油 對 供 試 菌 株 生 長 抑 制 效 果 明 顯 降 低, 除 對 CSG7-3 與 PC 仍 有 82.5% 及 56.3% 外, 其 餘 菌 株 生 長 抑 制 率 介 於 0.0%-33.6%; 另 稀 釋 100,000 倍 後 之 精 油 則 對 所 有 供 試 病 原 真 菌 生 長 抑 制 率 介 於 0.0%-43.0%, 效 果 不 顯 著 ( 三 ) 測 試 精 油 對 孢 子 發 芽 之 抑 制 效 果 將 含 蔗 糖 之 孢 子 懸 浮 液 與 精 油 混 合 後 培 養 於 玻 片 上, 測 試 精 油 對 孢 子 發 芽 之 抑 制 效 果, 結 果 如 表 六 所 示 稀 釋 10 倍 之 柚 子 精 油 可 抑 制 PA01 GBS1-104 CSG7-3 CPY-01A 及 PG6-3 菌 株 孢 子 發 芽, 抑 制 率 介 於 98.2%-100.0% 稀 釋 20 倍 之 柚 子 精 油 可 抑 制 PA01 GBS1-104 CSG7-3 CPY-01A 及 PG6-3 菌 株 孢 子 發 芽, 抑 制 率 介 於 98.3%-100.0% 稀 釋 50 倍 之 柚 子 精 油 可 抑 制 PA01 GBS1-104 CSG7-3 CPY-01A 及 PG6-3 菌 株 孢 子 發 芽, 抑 制 率 介 於 92.6%-99.7% 稀 釋 100 倍 之 柚 子 精 油 可 抑 制 PA01 GBS1-104 CSG7-3 及 PG6-3 菌 株 孢 子 發 芽, 抑 制 率 介 於 70.9%-98.6% 另 本 研 究 得 知, 柚 子 精 油 對 Cmep1-3 菌 株 孢 子 發 芽 無 抑 制 效 果, 反 而 有 促 進 發 芽 的 效 果 於 檸 檬 桉 精 油 測 試 結 果 如 表 七 所 示 稀 釋 500 倍 之 檸 檬 桉 精 油 可 抑 制 GBS1-104 CPY-01A PG6-3 及 CSG7-3 菌 株 孢 子 發 芽 達 98.2% 98.3% 99.0% 及 100.0%; 對 Cmep1-3 與 PA01 菌 株 孢 子 發 芽 抑 制 率 為 80.1% 與 82.7% 稀 釋 1,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 可 抑 制 GBS1-104 與 CSG7-3 菌 株 孢 子 發 芽 達 99.6% 與 100.0%; 對 CPY-01A Cmep1-3 PA01 及 PG6-3 菌 株 孢 子 發 芽 抑 制 率 則 為 83.5% 83.3% 68.2% 及 59.8% 稀 釋 1,500 倍 之 檸 檬 桉 精 油 可 抑 制 GBS1-104 與 CSG7-3 菌 株 孢 子 發 芽, 抑 制 率 達 98.6% 與 88.4%; 對 CPY-01A Cmep1-3 PA01 及 PG6-3 菌 株 孢 子 發 芽 抑 制 率 為 84.9% 74.5% 72.1% 及 59.0 稀 釋 2,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 可 抑 制 GBS1-104 CPY-01A 及 CSG7-3 菌 株 孢 子 發 芽 達 14

28 97.3% 78.5% 及 78.5%; 對 Cmep1-3 PA01 及 PG6-3 菌 株 孢 子 發 芽 抑 制 率 分 別 為 68.7% 51.8% 及 45.3% 四 測 試 農 藥 添 加 精 油 對 具 抗 藥 性 草 莓 灰 徽 病 菌 生 長 抑 制 效 果 於 1,000 mg a. i. /L 亞 托 敏 中 添 加 柚 子 精 油, 測 試 對 灰 黴 病 菌 抗 藥 性 菌 株 (GBS1-104) 生 長 效 果, 結 果 如 表 八 所 示 添 加 稀 釋 100 倍 1,000 倍 及 10,000 倍 之 柚 子 精 油 對 抗 藥 性 GBS1-104 菌 株 生 長 抑 制 率 分 別 為 71.0% 40.7% 及 39.0%; 而 對 非 抗 藥 性 菌 株 (GBS3-93) 生 長 之 抑 制 率 分 別 為 100.0% 66.0% 及 65.2% 於 檸 檬 桉 精 油 測 試 結 果 指 出, 添 加 稀 釋 1,000 倍 10,000 倍 及 100,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 對 抗 藥 性 GBS1-104 菌 株 生 長 抑 制 率, 分 別 為 100.0% 52.0% 及 44.6%; 對 GBS3-93 菌 株 生 長 之 抑 制 率 分 別 為 100.0% 75.7% 及 62.2%( 表 八 ) 將 上 述 結 果 與 只 含 亞 托 敏 之 處 理 組 比 較, 得 知 亞 托 敏 添 加 稀 釋 100 倍 之 柚 子 精 油 後, 可 提 升 亞 托 敏 對 GBS1-104 與 GBS3-93 之 抑 制 率 達 29.9% 與 37.7% 稀 釋 1,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 可 提 升 亞 托 敏 對 GBS1-104 與 GBS3-93 之 抑 制 率 達 58.9% 與 37.7%; 而 稀 釋 10,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油, 則 可 提 升 亞 托 敏 對 GBS1-104 與 GBS3-93 之 抑 制 率 達 11.0% 與 13.4% 本 研 究 後 續 以 稀 釋 100 倍 柚 子 精 油 和 稀 釋 1,000 倍 與 10,000 倍 檸 檬 桉 精 油 進 行 藥 效 提 升 試 驗 五 測 試 農 藥 添 加 精 油 對 藥 效 提 升 效 果 將 濃 度 及 1,000 mg a. i. /L 之 亞 托 敏 與 稀 釋 100 倍 柚 子 精 油 或 稀 釋 1,000 倍 與 10,000 倍 檸 檬 桉 精 油 混 合 後, 添 加 至 PDA 培 養 基, 測 試 對 抗 藥 性 菌 株 GBS1-104 生 長 之 抑 制 效 果, 結 果 如 圖 十 所 示 添 加 稀 釋 100 倍 之 柚 子 精 油 後, 亞 托 敏 藥 劑 對 GBS1-104 菌 株 之 生 長 抑 制 率 分 別 提 升 為 25.6% 21.6% 15.0% 33.2% 及 51.2%; 而 添 加 稀 釋 10,000 倍 檸 檬 桉 精 油 後, 亞 托 敏 藥 劑 對 GBS1-104 菌 株 之 生 長 抑 制 率 分 別 提 升 為 26.3% 25.8% 43.7% 42.6% 15

29 及 51.7% 另 添 加 稀 釋 1,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油, 於 所 有 測 試 濃 度 之 亞 托 敏 培 養 基 中, 皆 可 100% 抑 制 GBS1-104 菌 株 生 長 顯 示 稀 釋 100 倍 柚 子 精 油 和 稀 釋 1,000 倍 與 10,000 倍 檸 檬 桉 精 油 皆 有 提 升 藥 效 之 效 果 六 測 試 精 油 對 植 物 的 影 響 將 乳 化 後 之 精 油 噴 於 胡 瓜 小 白 菜 及 草 莓 植 株, 測 試 精 油 對 植 物 影 響, 結 果 分 別 如 圖 十 一 圖 十 二 及 圖 十 三 所 示 稀 釋 20 倍 之 柚 子 精 油 對 胡 瓜 與 草 莓 葉 片 有 明 顯 白 色 病 斑 之 藥 害 ; 而 稀 釋 50 倍 與 100 倍 之 精 油, 則 對 供 試 植 株 無 明 顯 藥 害 稀 釋 100 倍 之 檸 檬 桉 精 油, 對 所 有 供 試 植 物 葉 片 皆 可 引 起 白 化 病 斑 之 藥 害 ; 而 稀 釋 500 倍 與 1,000 倍 之 精 油, 則 對 各 供 試 植 株 無 明 顯 藥 害 故 後 續 植 物 病 害 防 治 實 驗 中, 以 稀 釋 50 倍 與 100 倍 之 柚 子 精 油 和 稀 釋 倍 數 500 倍 與 1,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 作 為 防 治 濃 度 七 評 估 精 油 防 治 植 物 病 害 之 效 果 ( 一 ) 定 溫 生 長 箱 中 測 試 精 油 防 治 小 白 菜 炭 疽 病 之 效 果 測 試 接 種 病 原 菌 1 小 時 前 噴 灑 精 油 防 治 小 白 菜 炭 疽 病 之 結 果, 得 知 處 理 稀 釋 50 倍 與 100 倍 柚 子 精 油 後, 小 白 菜 罹 病 度 分 別 為 33.3% 與 37.5%; 另 處 理 稀 釋 500 倍 與 1,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 之 小 白 菜 罹 病 度 皆 為 37.5% ( 表 九 ) 本 研 究 中 接 種 病 原 菌 1 小 時 前 處 理 0.01% tween 20 之 小 白 菜 罹 病 度 為 75.0% 於 接 種 病 原 菌 1 小 時 後 噴 灑 精 油 防 治 小 白 菜 炭 疽 病 之 結 果, 得 知 處 理 稀 釋 50 倍 與 100 倍 柚 子 精 油 後, 小 白 菜 罹 病 度 分 別 為 50.0% 與 58.3%; 處 理 稀 釋 500 倍 與 1,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 後, 小 白 菜 罹 病 度 分 別 為 25.0% 與 33.3% ( 表 九 ) 本 研 究 中 接 種 病 原 菌 1 小 時 後 處 理 0.01% tween 20 之 小 白 菜 罹 病 度 為 70.8% ( 二 ) 定 溫 生 長 箱 中 精 油 防 治 胡 瓜 炭 疽 病 之 效 果 16

30 測 試 於 接 種 病 原 菌 1 小 時 前 噴 灑 精 油 防 治 胡 瓜 炭 疽 病 的 結 果, 指 出 處 理 稀 釋 50 倍 與 100 倍 柚 子 精 油 後, 胡 瓜 植 株 罹 病 度 分 別 為 4.2% 與 3.7%; 處 理 稀 釋 500 倍 與 1,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 後, 胡 瓜 植 株 罹 病 度 皆 為 9.3% ( 表 十 ) 本 研 究 中 接 種 病 原 菌 1 小 時 前 處 理 0.01% tween 20 之 胡 瓜 植 株 罹 病 度 為 17.5% 於 接 種 病 原 菌 1 小 時 後 噴 灑 精 油 防 治 胡 瓜 炭 疽 病 的 結 果, 指 出 處 理 稀 釋 50 倍 與 100 倍 柚 子 精 油 後, 胡 瓜 植 株 罹 病 度 分 別 為 5.0% 與 3.2%; 處 理 稀 釋 500 倍 與 1,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 後, 胡 瓜 植 株 罹 病 度 分 別 為 6.3% 與 12.7% ( 表 十 ) 本 研 究 中 接 種 病 原 菌 1 小 時 後 處 理 0.01% tween 20 之 胡 瓜 植 株 罹 病 度 為 10.0% ( 三 ) 保 濕 環 境 中 精 油 防 治 草 莓 葉 部 灰 黴 病 之 效 果 測 試 於 接 種 病 原 菌 1 小 時 前 噴 灑 精 油 防 治 草 莓 葉 部 灰 黴 病 之 結 果, 得 知 處 理 稀 釋 50 倍 與 100 倍 柚 子 精 油 後, 草 莓 植 株 罹 病 度 分 別 為 72.2% 與 77.8%; 處 理 稀 釋 500 倍 與 1,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 後, 草 莓 植 株 罹 病 度 分 別 為 66.7% 與 69.4% ( 表 十 一 ) 本 研 究 中 接 種 病 原 菌 1 小 時 前 處 理 0.01% tween 20 之 草 莓 植 株 罹 病 度 為 72.2% 於 接 種 病 原 菌 前 或 後 1 小 時 噴 灑 精 油 防 治 草 莓 葉 部 灰 黴 病 之 結 果, 得 知 於 接 種 後 處 理 稀 釋 50 倍 與 100 倍 柚 子 精 油 後, 草 莓 植 株 罹 病 度 分 別 為 30.6% 與 50.0%; 處 理 稀 釋 500 倍 與 1,000 倍 檸 檬 桉 精 油 後, 草 莓 植 株 罹 病 度 分 別 為 25.0% 與 16.7% 本 研 究 中 接 種 病 原 菌 1 小 時 後 處 理 0.01% tween 20 之 草 莓 植 株 罹 病 度 為 77.8% ( 表 十 一 ) ( 四 ) 於 保 濕 環 境 下 精 油 防 治 草 莓 果 實 灰 黴 病 之 效 果 測 試 於 接 種 病 原 菌 1 小 時 前 噴 灑 精 油 防 治 草 莓 果 實 灰 黴 病 之 結 果, 得 知 於 接 種 1 小 時 前 處 理 稀 釋 50 倍 與 100 倍 柚 子 精 油 後, 草 莓 果 實 罹 病 度 分 別 為 79.2% 與 54.2%; 處 理 稀 釋 500 倍 與 1,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 後, 草 莓 果 實 罹 病 度 17

31 分 別 為 83.3% 與 41.7% ( 表 十 二 ) 本 研 究 中 接 種 病 原 菌 1 小 時 前 處 理 0.01% tween 20 之 草 莓 果 實 罹 病 度 罹 病 度 為 62.5% 於 接 種 病 原 菌 1 小 時 後 噴 灑 精 油 防 治 草 莓 果 實 灰 黴 病 之 結 果, 得 知 處 理 稀 釋 50 倍 與 100 倍 柚 子 精 油 後, 草 莓 果 實 罹 病 度 分 別 為 41.7% 與 33.3%; 處 理 稀 釋 500 倍 與 1,000 倍 之 檸 檬 桉 精 油 後, 草 莓 果 實 罹 病 度 分 別 為 25.0% 與 29.2% ( 表 十 二 ) 本 研 究 中 接 種 病 原 菌 1 小 時 後 處 理 0.01% tween 20 之 草 莓 果 實 罹 病 度 為 87.5% 18

32 討 論 本 研 究 利 用 蒸 餾 萃 取 法, 萃 取 新 鮮 文 旦 柚 皮 和 檸 檬 桉 落 葉 中 的 精 油, 得 知 文 旦 柚 皮 和 檸 檬 桉 落 葉 中 精 油 含 量 分 別 為 7.20% 與 0.74% Tsai 氏 (2005) 曾 報 導, 新 鮮 的 文 旦 柚 果 皮 以 蒸 餾 法 萃 取, 可 萃 得 1.62% 的 精 油, 較 本 研 究 之 回 收 率 低 比 較 本 研 究 所 使 用 的 方 法 與 Tsai 氏 (2005) 之 方 式, 得 知 Tsai 氏 未 將 材 料 打 碎, 且 使 用 常 溫 水 作 為 冷 卻 水 前 人 研 究 指 出, 精 油 屬 高 揮 發 性 的 化 合 物 (Lin et al., 2007), 且 儲 存 在 果 皮 中 的 油 囊 細 胞 內 (Ladaniya, 2008), 本 研 究 中 使 用 之 柚 子 皮 於 蒸 餾 前 先 以 均 質 機 打 碎, 可 破 壞 植 物 組 織, 使 精 油 釋 出 量 增 加 ; 且 研 究 中 之 萃 取 裝 置 使 用 0 o C-4 o C 冷 卻 水, 可 增 加 精 油 凝 結 效 率, 降 低 蒸 餾 時 的 逸 散, 導 致 精 油 之 萃 取 效 率 較 Tsai 氏 佳 檸 檬 桉 精 油 萃 取 方 面, 根 據 Batish 氏 等 人 (2006) 的 報 導,100 g 檸 檬 桉 枯 葉 所 含 精 油 量 約 2.36 ml, 較 本 研 究 中 所 萃 得 的 量 ( 約 0.82 ml) 高 ;Batish 氏 等 人 (2006) 所 使 用 之 落 葉 為 褐 色 且 尚 未 開 始 被 分 解 的 葉 片, 而 萃 取 方 法 亦 與 本 研 究 相 似 前 人 研 究 曾 指 出, 植 物 精 油 含 量 會 因 環 境 逆 境 而 增 加, 如 藿 香 薊 (Kong et al., 2002); 另 根 據 Jing 氏 等 人 (2014) 綜 述, 檸 檬 葉 與 果 皮 中 的 精 油 量 與 成 分, 會 隨 栽 培 區 域 與 氣 候 不 同 而 改 變, 指 出 環 境 會 影 響 植 物 精 油 含 量 比 較 Batish 氏 等 人 (2006) 所 萃 取 檸 檬 桉 精 油 量 與 本 研 究 萃 取 之 檸 檬 桉 精 油 量 之 差 異, 得 知 Batish 氏 等 人 (2006) 之 檸 檬 桉 葉 片 取 自 印 度 的 昌 迪 加 爾 (Chandigarh), 當 地 年 雨 量 約 為 979 mm/yr, 且 降 雨 之 76% 集 中 於 6-9 月, 其 餘 月 分 降 雨 皆 低 於 50 mm ( 而 台 灣 台 中 地 區 年 雨 量 約 為 1642 mm/yr, 於 2-9 月 降 雨 皆 高 於 80 mm ( 顯 示 兩 地 區 之 氣 候 環 境 有 明 顯 差 異, 推 測 兩 地 區 檸 檬 桉 葉 片 中 的 精 油 含 量 與 成 分 可 能 因 此 產 生 差 異 性 此 外,Batish 氏 等 人 (2006) 之 研 究 亦 指 出,100 g 檸 檬 桉 成 熟 葉 所 含 精 油 量 約 4.80 ml, 為 落 葉 中 精 油 含 量 的 2 倍 以 上, 且 香 茅 醛 (citronellal) 含 量 為 落 葉 19

33 中 精 油 之 1.5 倍, 故 未 來 可 以 新 鮮 檸 檬 桉 葉 片 作 為 萃 取 材 料, 以 提 升 萃 取 效 率, 並 降 低 成 本 本 研 究 分 析 文 旦 柚 精 油 與 檸 檬 桉 精 油 成 分, 得 知 文 旦 柚 精 油 含 96.27% 檸 檬 烯, 與 Tsai 氏 (2005) 報 導 文 旦 柚 精 油 含 95.85% 檸 檬 烯 相 似 根 據 Jing 氏 等 人 (2014) 綜 述, 柚 子 精 油 之 檸 檬 烯 含 量 會 隨 栽 培 環 境 不 同 而 改 變, 約 介 於 31%- 97%, 顯 示 植 物 中 精 油 的 成 分 比 例, 可 能 隨 著 作 物 栽 培 環 境 或 作 物 品 種 等 而 有 大 幅 度 的 差 異 另 檸 檬 桉 落 葉 中 精 油 主 要 成 分 為 香 茅 醛 與 香 茅 醇, 含 量 分 別 為 43.69% 與 17.06% Batish 氏 等 人 (2006) 曾 報 導, 檸 檬 桉 落 葉 中 精 油 含 香 茅 醛 與 香 茅 醇 含 量 分 別 為 53.87% 與 7.81%, 此 差 異 亦 可 能 是 因 栽 培 環 境 不 同 所 造 成 (Sharma and Tripathi, 2006; Jing et al., 2014) 本 研 究 將 柚 子 精 油 以 薰 蒸 方 式 處 理, 得 知 對 供 試 菌 株 的 生 長 抑 制 效 果 隨 使 用 濃 度 增 加 而 提 昇, 但 對 Penicillium digitatum Cmep1-3 菌 株 則 會 促 進 生 長, 證 實 在 高 濃 度 下, 精 油 對 抑 制 病 原 真 菌 生 長 有 較 佳 效 果, 且 效 果 會 因 菌 株 不 同 而 有 差 異 根 據 Kuate 氏 等 人 (2006) 的 報 導, 當 精 油 未 達 抑 制 濃 度 時, 可 能 會 有 促 進 部 分 病 原 菌 生 長 或 孢 子 發 芽 的 現 象, 此 現 象 於 本 研 究 中 以 稀 釋 50 倍 以 上 之 柚 子 精 油 薰 蒸 處 理 的 結 果 中 亦 可 觀 察 到 另 柚 子 精 油 對 卵 菌 綱 的 Phytophthora capsici PC 菌 株 無 抑 制 效 果, 顯 示 柚 子 精 油 對 卵 菌 類 病 原 的 抑 制 效 果 不 佳, 然 實 驗 中 只 針 對 單 一 菌 株, 未 來 需 測 試 更 多 卵 菌 類 病 原 以 確 定 其 有 效 性 柚 子 精 油 添 加 於 培 養 基 對 供 試 菌 株 的 生 長 抑 制 效 果 與 薰 蒸 效 果 類 似, 當 濃 度 增 加 時, 可 促 進 菌 株 生 長 抑 制 效 果, 但 效 果 會 因 菌 株 不 同 而 有 差 異 ; 而 當 培 養 基 添 加 稀 釋 1,000 倍 以 上 的 柚 子 精 油 後, 會 有 促 進 部 分 病 原 菌 生 長 的 效 果 比 較 精 油 以 薰 蒸 或 加 入 培 養 基 之 處 理 結 果, 本 研 究 使 用 之 塑 膠 培 養 皿 容 量 約 為 100 ml( 直 徑 cm 高 1.6cm), 各 皿 培 養 基 量 約 為 12.5 ml-15 ml, 若 精 油 於 培 養 皿 中 完 全 揮 發, 則 精 油 薰 蒸 試 驗 中 稀 釋 1 倍 至 100 倍 的 柚 子 精 油 於 培 養 皿 中 的 濃 度 約 為 1,176 mg /L 至 12 mg /L; 而 含 稀 釋 100 1,000 及 10,000 倍 柚 子 精 油 培 養 基 20

34 中 所 含 柚 子 精 油 濃 度 則 分 別 為 10,000 mg /L 1,000 mg /L 及 100 mg /L 將 薰 蒸 稀 釋 1 倍 之 柚 子 精 油 與 含 稀 釋 1,000 倍 柚 子 精 油 培 養 基 對 病 原 真 菌 生 長 抑 制 結 果 進 行 比 較, 顯 示 當 濃 度 接 近 1,000 mg /L 時, 柚 子 精 油 以 薰 蒸 的 方 式, 較 能 有 效 抑 制 病 原 真 菌 生 長 前 人 研 究 曾 比 較 薰 蒸 與 培 養 基 添 加 柳 橙 精 油, 對 Aspergillus 屬 植 物 病 原 菌 之 生 長 抑 制 效 果, 亦 顯 示 當 柳 橙 精 油 以 薰 蒸 的 方 式 較 能 有 效 抑 制 病 原 真 菌 生 長 (Sharma and Tripathi, 2006; Jing et al., 2014), 指 出 使 用 方 法 的 不 同, 會 影 響 精 油 的 效 果 另 Fisher 與 Phillips 兩 氏 (2008) 亦 指 出, 培 養 基 之 結 構 會 影 響 培 養 基 中 揮 發 性 物 質 的 釋 放, 導 致 精 油 對 病 原 真 菌 的 抑 制 效 果 降 低 在 孢 子 發 芽 的 抑 制 效 果 上, 得 知 稀 釋 100 倍 之 柚 子 精 油 ( 約 10,000 mg /L), 能 夠 抑 制 CSG7-3 與 PG6-3 孢 子 發 芽 達 約 100%, 然 對 菌 絲 生 長 抑 制 率 低 於 80%, 顯 示 柚 子 精 油 對 孢 子 之 毒 性 可 能 較 高 Sharma 與 Tripathi 兩 氏 (2006) 指 出,100% 抑 制 病 原 真 菌 孢 子 發 芽 所 需 之 柳 橙 精 油 濃 度 較 100% 抑 制 病 原 菌 生 長 之 濃 度 低, 應 顯 示 柳 橙 精 油 對 真 菌 孢 子 之 毒 性 亦 較 高 ; 比 較 兩 精 油 之 差 異 後 得 知, 柳 橙 精 油 之 主 成 分 為 檸 檬 烯 ( 約 84.2%), 證 實 檸 檬 烯 對 真 菌 孢 子 之 毒 性 可 能 較 強, 未 來 可 進 一 步 了 解 檸 檬 烯 影 響 孢 子 發 芽 之 作 用 機 制 於 檸 檬 桉 精 油 測 試 結 果 指 出, 檸 檬 桉 精 油 抑 制 供 試 菌 株 生 長 效 果 的 情 形 與 柚 子 精 油 相 似, 抑 制 效 果 隨 使 用 濃 度 增 加 而 提 昇, 於 高 濃 度 時 對 真 菌 之 生 長 抑 制 效 果 較 佳, 且 效 果 會 因 菌 株 不 同 而 有 差 異 ; 此 外, 當 精 油 未 達 抑 制 濃 度 時, 可 能 會 有 促 進 部 分 病 原 菌 生 長 或 孢 子 發 芽 的 現 象 比 較 檸 檬 桉 精 油 與 柚 子 精 油 之 抑 制 效 果, 顯 示 檸 檬 桉 精 油 抑 制 供 試 病 原 真 菌 菌 株 之 生 長 效 果 較 柚 子 精 油 佳, 推 測 其 原 因 應 與 所 含 成 分 有 關 檸 檬 桉 精 油 之 主 要 有 效 成 分 則 為 香 茅 醛 與 香 茅 醇, 而 柚 子 精 油 之 主 要 成 分 為 檸 檬 烯 比 較 三 種 物 質 之 毒 性 資 料, 指 出 香 茅 醛 與 香 茅 醇 對 大 鼠 之 LD50 分 別 為 2420 mg/kg ( 與 3,450 mg/kg ( 而 檸 檬 烯 對 大 鼠 之 半 數 致 死 濃 度 (LD50) 為 4,400 mg/kg ( 顯 示 檸 檬 桉 精 油 中 的 香 茅 21

35 醛 與 香 茅 醇 之 毒 性 皆 較 文 旦 柚 精 油 中 的 檸 檬 烯 高 比 較 檸 檬 桉 精 油 以 薰 蒸 或 加 入 培 養 基 之 處 理 結 果, 將 薰 蒸 試 驗 中 稀 釋 10 倍 ( 濃 度 約 118 mg/l) 之 檸 檬 桉 精 油, 與 含 稀 釋 10,000 倍 檸 檬 桉 精 油 培 養 基 ( 濃 度 約 100 mg /L) 對 供 試 菌 株 的 生 長 抑 制 效 果 進 行 比 較, 可 知 於 同 樣 濃 度 下, 檸 檬 桉 精 油 與 柚 子 精 油 相 同, 以 薰 蒸 的 方 式 較 能 抑 制 病 原 菌 之 生 長 比 較 檸 檬 桉 精 油 抑 制 菌 絲 生 長 與 孢 子 發 芽 的 結 果, 顯 示 1,000 mg/l 檸 檬 桉 精 油 對 9 種 供 試 病 原 菌 中 7 種 菌 株 之 菌 絲 生 長 抑 制 率 可 達 100%, 然 對 孢 子 發 芽 抑 制 率 則 不 佳, 僅 對 其 中 2 種 孢 子 發 芽 抑 制 率 有 較 明 顯 效 果 約 100%, 顯 示 檸 檬 桉 精 油 對 真 菌 菌 絲 之 毒 性 較 強, 此 結 果 與 柚 子 精 油 處 理 不 同 ; 由 於 兩 種 精 油 的 成 分 相 異, 推 測 此 現 象 可 能 是 因 作 用 機 制 不 同 造 成, 未 來 可 比 較 處 理 兩 種 精 油 後 之 孢 子 與 菌 絲 之 細 胞 結 構 破 壞 性 本 研 究 得 知, 柚 子 精 油 對 自 香 水 檸 檬 分 得 的 P. digitatum Cmep1-3 菌 株 有 促 進 菌 絲 生 長 與 孢 子 發 芽 之 效 果 前 人 研 究 曾 分 析 各 種 柑 橘 屬 精 油 之 主 要 成 分, 並 測 試 對 P. digitatum 與 P. italicum 病 原 真 菌 的 生 長 抑 制 效 果, 得 知 各 種 柑 橘 精 油 中 非 檸 檬 烯 的 單 萜 類 (monoterpene) 與 倍 半 萜 類 (sesquiterpene) 含 量 與 抑 制 P. digitatum 和 P. italicum 生 長 能 力 成 正 相 關 (Caccioni et al., 1998) 本 研 究 萃 取 之 柚 子 精 油 含 約 96.27% 的 檸 檬 烯, 非 檸 檬 烯 的 單 萜 類 與 倍 半 萜 類 含 量 低, 故 可 能 導 致 無 法 有 效 抑 制 P. digitatum 另 Tan 氏 等 人 (1998) 亦 報 導 P. digitatum NRRL1202 菌 株 具 有 將 檸 檬 烯 轉 化 為 α-terpineol 的 能 力, 顯 示 某 些 P. digitatum 菌 株 對 檸 檬 烯 之 感 受 性 低, 且 能 夠 將 其 代 謝, 本 實 驗 所 使 用 的 P. digitatum Cmep1-3 是 否 屬 於 此 類 菌 株, 未 來 需 進 一 步 測 定 對 檸 檬 烯 的 代 謝 能 力 本 研 究 將 亞 托 敏 與 精 油 混 合, 可 提 升 抑 制 抗 藥 性 菌 株 生 長 的 效 果 根 據 殺 菌 劑 抗 藥 性 行 動 委 員 會 (FRAC, 之 敘 述, 亞 托 敏 屬 於 史 托 比 系 藥 劑, 其 作 用 機 制 為 抑 制 粒 線 體 膜 上 的 細 胞 色 素 複 合 體 bc1 之 Qo 處, 影 響 電 子 傳 遞 鏈, 導 致 呼 吸 作 用 無 法 正 常 進 行 Carson 氏 等 人 (2002) 指 出, 精 油 屬 多 成 分 的 複 合 化 合 物, 目 前 被 認 為 不 具 特 定 的 作 用 機 制 與 作 用 標 的 ;Bakkali 氏 22

36 等 人 (2008) 的 綜 述 亦 指 出, 精 油 具 脂 溶 性, 能 夠 穿 過 細 胞 壁, 影 響 細 胞 膜 之 通 透 性, 並 會 破 壞 真 核 生 物 細 胞 內 之 粒 線 體 膜, 導 致 細 胞 凋 亡 的 發 生 探 討 本 研 究 亞 托 敏 與 精 油 混 合 後 之 加 成 效 果, 應 是 由 於 兩 者 作 用 機 制 不 同 所 致 然 本 研 究 亦 發 現, 當 精 油 與 低 濃 度 亞 托 敏 混 合 時, 會 有 抑 制 效 果 降 低 的 情 形 推 測 可 能 原 因 為, 精 油 與 低 濃 度 亞 托 敏 混 合 時 無 法 有 效 乳 化 而 浮 至 培 養 基 表 面, 增 加 了 精 油 散 失 量 所 致 由 於 史 托 比 系 藥 劑 作 用 標 的 專 一, 且 使 用 量 大, 此 類 藥 劑 的 抗 藥 性 已 成 為 世 界 上 嚴 重 的 問 題, 未 來 若 能 將 柚 子 精 油 或 檸 檬 桉 精 油 適 量 添 加 於 該 藥 劑 中, 應 可 延 緩 田 間 抗 藥 性 菌 株 的 產 生, 提 升 藥 效 測 試 柚 子 精 油 與 檸 檬 桉 精 油 對 胡 瓜 小 白 菜 及 草 莓 的 影 響, 顯 示 柚 子 精 油 要 稀 釋 至 20 倍 以 下, 才 會 造 成 胡 瓜 與 草 莓 的 藥 害 ; 而 稀 釋 100 倍 以 下 之 檸 檬 桉 精 油 會 引 起 胡 瓜 小 白 菜 及 草 莓 之 生 理 障 礙 根 據 Batish 氏 等 人 (2008) 之 報 告,125 mg/l 之 檸 檬 桉 精 油 對 植 物 有 明 顯 的 生 長 抑 制 效 果, 且 效 果 取 決 於 香 茅 醛 之 含 量, 顯 示 香 茅 醛 為 主 要 影 響 植 株 生 長 的 因 子 ; 而 柚 子 精 油 的 主 成 份 檸 檬 烯 對 於 植 物 的 毒 性 則 可 能 較 低 利 用 柚 子 精 油 與 檸 檬 桉 精 油 防 治 胡 瓜 炭 疽 病 小 白 菜 炭 疽 病 及 草 莓 灰 黴 病, 結 果 顯 示 除 防 治 胡 瓜 炭 疽 病 效 果 不 明 顯 外, 對 小 白 菜 炭 疽 病 與 草 莓 灰 黴 病 皆 有 防 治 效 果 本 研 究 中 所 使 用 之 胡 瓜 炭 疽 病 苗 於 接 種 後, 無 明 顯 發 病 情 形, 推 測 原 因 可 能 是 菌 株 保 存 過 久 造 成 毒 力 下 降 所 致 另 一 方 面, 從 小 白 菜 炭 疽 病 與 草 莓 灰 黴 病 的 結 果 得 知, 精 油 於 接 種 病 原 菌 後 1 小 時 施 用, 對 病 害 發 生 的 防 治 效 果 較 佳, 推 測 此 差 異 可 能 是 由 於 精 油 本 身 屬 高 揮 發 性 物 質 (Lin et al., 2007), 於 植 物 表 面 無 法 長 時 間 穩 定 存 在 所 致 防 治 草 莓 植 株 灰 黴 病 與 果 實 灰 黴 病 之 結 果 中 顯 示, 施 用 稀 釋 50 倍 之 柚 子 精 油 與 稀 釋 500 倍 之 檸 檬 桉 精 油 時, 可 能 會 有 促 進 病 害 發 展 的 現 象, 且 於 接 種 前 1 小 時 施 用 的 處 理 中 特 別 顯 著 Hsieh 氏 等 人 (2014) 曾 指 出, 丁 香 精 油 可 能 會 對 植 物 表 面 造 成 傷 害, 加 重 香 蕉 炭 疽 病 之 發 病 嚴 重 度, 推 論 本 研 究 所 使 用 兩 種 精 油 對 草 莓 果 實 與 幼 葉 等 脆 弱 的 組 織 仍 23

37 可 能 造 成 傷 害, 若 於 病 原 菌 接 種 前 施 用 過 高 濃 度 的 精 油, 可 能 會 造 成 植 物 表 面 蠟 質 的 減 損 或 細 微 的 傷 口, 增 加 病 原 菌 侵 染 的 機 率, 然 未 來 仍 需 進 一 步 透 過 顯 微 觀 察, 確 定 果 表 或 葉 表 是 否 有 傷 害 現 象 本 研 究 亦 發 現 tween 20 會 影 響 供 試 病 原 菌 的 生 長 與 病 害 的 嚴 重 度 Tween 20 為 界 面 活 性 劑 (surfactant), 其 分 子 同 時 具 有 親 水 性 及 親 油 性, 可 用 於 油 與 水 的 乳 化 反 應 (Woertz, 2004), 前 人 報 導 中 曾 指 出, 低 濃 度 (0.05 mg /L) 的 界 面 活 性 劑 即 可 能 會 干 擾 膜 的 穩 定 性 進 而 影 響 微 生 物 的 生 長 (Laha, 1991) 植 物 方 面, 也 有 報 導 指 出 界 面 活 性 劑 會 破 壞 植 物 表 面 蠟 質 的 完 整 而 增 加 其 透 水 性 (Riederer, 1990), 顯 示 介 面 活 性 劑 的 使 用 可 能 使 病 原 菌 較 易 入 侵 而 加 重 病 害 的 嚴 重 度, 亦 可 能 影 響 微 生 物 生 長 而 減 經 病 害 的 發 生, 此 效 果 隨 植 物 種 類 與 病 害 的 不 同 而 有 所 差 異, 未 來 可 透 過 進 一 步 的 試 驗 來 確 定 tween 20 對 病 害 發 生 的 影 響 文 旦 柚 皮 與 檸 檬 桉 落 葉 分 別 為 台 灣 本 土 與 國 外 造 紙 業 於 農 業 和 工 業 生 產 時 製 造 的 農 業 廢 棄 物, 本 研 究 結 果 顯 示, 此 兩 種 材 料 皆 可 作 為 精 油 萃 取 來 源, 並 具 有 應 用 於 防 治 植 物 病 害 與 提 升 亞 托 敏 藥 效 的 潛 力 未 來 仍 可 繼 續 測 試 精 油 於 溫 室 或 田 間 是 否 也 有 提 升 亞 托 敏 藥 效 的 能 力, 並 篩 選 適 當 的 施 用 方 法 或 劑 型, 來 降 低 精 油 可 能 造 成 的 藥 害 和 其 於 開 放 空 間 的 散 失, 開 發 成 更 具 植 物 病 害 防 治 效 果 的 資 材 24

38 參 考 文 獻 Akhtar, M.M., Srivastava, S., Sinha, P., Singh, D.K., Luqman, S., Tandon, S., and Yadav, N.P Antimicrobial potential of topical formulation containing essential oil of Eucalyptus citriodora Hook. Annals of Phytomedicine 3: Bakkali, F., Averbeck, S., Averbeck, D., and Idaomar, M Biological effects of essential oils a review. Food and Chemical Toxicology 46: Batish, D.R., Singh, H.P., Kohli, R.K., and Kaur, S Eucalyptus essential oil as a natural pesticide. Forest Ecology and Management 256: Batish, D.R., Singh, H.P., Setia, N., Kaur, S., and Kohli, R.K Chemical composition and phytotoxicity of volatile essential oil from intact and fallen leaves of Eucalyptus citriodora. Zeitschrift fur Naturforschung C-Journal of Biosciences 61: Caccioni, D.R., Guizzardi, M., Biondi, D.M., Renda, A., and Ruberto, G Relationship between volatile components of citrus fruit essential oils and antimicrobial action on Penicillium digitatum and Penicillium italicum. International Journal of Food Microbiology 43: Carson, C.F., Mee, B.J., and Riley, T.V Mechanism of action of Melaleuca alternifolia (tea tree) oil on Staphylococcus aureus determined by time-kill, lysis, leakage, and salt tolerance assays and electron microscopy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46: Chen, L.S Investigation ofsensitivities and resistant mechanisms of Botrytis cenerea to strobilurins in Taiwan. Department of Plant Pathology (National Chung Hsing University), pp (In Chinese) Chiang, Y.J Plant application and regulation against enviromental stresses. Agricultural Politics and Sentiment 231: (In Chinese) Choi, W.S., Park, B.S., Lee, Y.H., Jang, D.Y., Yoon, H.Y., and Lee, S.E Fumigant toxicities of essential oils and monoterpenes against Lycoriella mali adults. Crop Protection 25: Elegbede, J., Elson, C., Qureshi, A., Tanner, M., and Gould, M Inhibition of DMBA-induced mammary cancer by the monoterpene d-limonene. Carcinogenesis 5: Fan, M.C Effect of black nightshade extracts on spore germination of Alternaria brassicicola and identification of its antifungal compounds. Department of Plant Pathology (National Chung Hsing University), pp Fisher, K., and Phillips, C.A The effect of lemon, orange and bergamot essential oils and their components on the survival of Campylobacter jejuni, Escherichia coli O157, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus and 25

39 Staphylococcus aureus in vitro and in food systems. Journal of Applied Microbiology 101: Fisher, K., and Phillips, C Potential antimicrobial uses of essential oils in food: is citrus the answer? Trends in Food Science & Technology 19: Hsieh, T.F., Chen, C.H., and Tsai, J.N Effects of plant essential oils on spore germination of several fruit anthracnose pathogens. Plant Pathology Bulletin 23: (In Chinese) Hsieh, T.F., Huang, J.H., Hsieh, L.J., Hu, M.F., and Ko, W.H Antifungal effect of plant extracts on phytopathogenic fungi. Plant Pathology Bulletin 14: (In Chinese) Hsu, T.L Application of acibenzolar-s-methyl and its resistance mechanism in controlling diseases of Pak-choi. Department of Plant Pathology (National Chung Hsing University), pp Huang, Y.J Effect of nanosilicate platelets on growth of Botrytis cinerea and Colletotrichum gloeosporioides from strawberry. Department of Plant Pathology (National Chung Hsing University), pp Ishii, H., Yano, K., Date, H., Furuta, A., Sagehashi, Y., Yamaguchi, T., Sugiyama, T., Nishimura, K., and Hasama, W Molecular characterization and diagnosis of QoI resistance in cucumber and eggplant fungal pathogens. Phytopathology 97: Javed, S., Shoaib, A., Mahmood, Z., Mushtaq, S., and Iftikhar, S Analysis of phytochemical constituents of Eucalyptus citriodora L. responsible for antifungal activity against post-harvest fungi. Natural Product Research 26: Jing, L., Lei, Z., Li, L., Xie, R., Xi, W., Guan, Y., Sumner, L.W., and Zhou, Z Antifungal ctivity of citrus essential oils. Journal of Agricultural and Food Chemistry 62: Kim, J., Marshall, M.R., and Wei, C. I Antibacterial activity of some essential oil components against five foodborne pathogens. Journal of Agricultural and Food Chemistry 43: Kim, J.K., Kang, C.S., Lee, J.K., Kim, Y.R., Han, H.Y., and Yun, H.K Evaluation of repellency effect of two natural aroma mosquito repellent compounds, citronella and citronellal. Entomological Research 35: Kong, C., Hu, F., and Xu, X Allelopathic potential and chemical constituents of volatiles from Ageratum conyzoides under stress. Journal of Chemical Ecology 28: Konishi, H., Ogawara, T., Keisuke, S., and Yasunori, T Hot water spraying for the control of anthracnose and gray mold on strawberry. Bulletin of the 26

40 Horticultural Institute 17: Kuate, J., Foko, J., Ndindeng, S.A., Jazet-Dongmo, P.M., Fouré, E., Damesse, F., and Ducelier, D Effect of essential oils from citrus varieties on in vitro growth and sporulation of Phaeoramularia angolensis causing citrus leaf and fruit spot disease. European Journal of Plant Pathology 114: Ladaniya, M.S Fruit morphology, anatomy, and physiology. Pages in: Citrus Fruit, M.S. Ladaniya, ed. Academic Press, San Diego. Laha, S., & Luthy, R. G. (1991). Inhibition of phenanthrene mineralization by nonionic surfactants in soil-water systems. Environmental Science & Technology, 25 (11) : Lee, S.O., Choi, G.J., Jang, K.S., Lim, H.K., Cho, K.Y., and Kim, J. C Antifungal activity of five plant essential oils as fumigant against postharvest and soilborne plant pathogenic fungi. The Plant Pathology Journal 23: Lin, C.T., Lai, W.C., Hsiao, W.F., and Wang, S.Y repellency and killing activities of essential oil from Cryptomeria japonica Heartwood against Silver Fish (Lepisma saccharina). Quarterly Jounal of Chinese Forestry 40: Miller, J.A., Lang, J.E., Ley, M., Nagle, R., Hsu, C.-H., Thompson, P.A., Cordova, C., Waer, A., and Chow, H.S Human breast tissue disposition and bioactivity of limonene in women with early-stage breast cancer. Cancer Prevention Research 6: Nakahara, K., Alzoreky, N.S., Yoshihashi, T., Nguyen, H.T., and Trakoontivakorn, G Chemical composition and antifungal activity of essential oil from Cymbopogon nardus (citronella grass). Japan Agricultural Research Quarterly 37: Ramezani, H., Singh, H., Batish, D., and Kohli, R Antifungal activity of the volatile oil of Eucalyptus citriodora. Fitoterapia 73: Ramos Alvarenga, R.F., Wan, B., Inui, T., Franzblau, S.G., Pauli, G.F., and Jaki, B.U Airborne antituberculosis activity of Eucalyptus citriodora essential oil. Journal of Natural Products 77: Ribeiro, J., Ribeiro, W., Camurça-Vasconcelos, A., Macedo, I., Santos, J., Paula, H., Magalhães, R., and Bevilaqua, C Efficacy of free and nanoencapsulated Eucalyptus citriodora essential oils on sheep gastrointestinal nematodes and toxicity for mice. Veterinary Parasitology 204: Riederer, M., and Jörg S Effects of surfactants on water permeability of isolated plant cuticles and on the composition of their cuticular waxes. Pesticide science 29 (1) : Sharma, N., and Tripathi, A Fungitoxicity of the essential oil of Citrus sinensis on post-harvest pathogens. World Journal of Microbiology and Biotechnology 27