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1 动 物 学 研 究 2013,Dec. 34(6): CN /Q ISSN Zoological Research DOI: /j.issn 鱼 类 体 表 粘 液 凝 集 素 研 究 进 展 黄 智 慧 1,2, 马 爱 军 2,*, 雷 霁 霖 2 1. 中 国 海 洋 大 学 水 产 学 院, 山 东 青 岛 中 国 水 产 科 学 研 究 院 黄 海 水 产 研 究 所 农 业 部 海 洋 渔 业 资 源 可 持 续 利 用 重 点 开 放 实 验 室, 青 岛 市 海 水 鱼 类 种 子 工 程 与 生 物 技 术 重 点 实 验 室, 山 东 青 岛 摘 要 : 鱼 类 体 表 粘 液 是 保 护 鱼 体 与 水 环 境 接 触 的 一 道 物 理 和 化 学 屏 障, 除 包 围 入 侵 微 生 物 外, 还 含 有 抗 菌 物 质 其 中, 凝 集 素 作 为 不 同 于 免 疫 球 蛋 白 且 不 具 酶 催 化 活 性 的 糖 蛋 白, 为 体 表 粘 液 中 所 含 有 的 重 要 免 疫 活 性 物 质, 在 保 护 鱼 体 免 遭 外 界 环 境 中 的 病 菌 寄 生 物 和 病 毒 侵 袭 中 至 关 重 要 该 文 以 鱼 类 体 表 粘 液 凝 集 素 为 研 究 对 象, 结 合 国 内 外 研 究 成 果, 对 其 研 究 简 史 分 类 生 物 学 性 质 和 功 能 等 进 行 阐 述, 为 其 今 后 的 研 究 及 应 用 提 供 参 考 关 键 词 : 体 表 粘 液 ; 凝 集 素 ; 免 疫 ; 功 能 ; 分 类 中 图 分 类 号 :Q26;Q959.4 文 献 标 志 码 :A 文 章 编 号 : (2013) Progress in study on the skin mucus lectin in fish Zhi-Hui HUANG 1,2, Ai-Jun MA 2,*, Ji-Lin LEI 2 1. Ocean University of China, Fisheries College, Qingdao, , China 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fisheries Sciences, Qingdao Key Laboratory for Marine Fish Breeding and Biotechnology, Qingdao, , China Abstract: Since water is a perfect medium for both bacteria and parasitic microbes, fish skin is constantly exposed to pathogen attacks. It is generally believed that skin mucus serves a mechanical as well as biochemical barrier. Lectins, an important part of the mucus, are carbohydrate-binding proteins that are neither antibodies nor enzymes, yet play important roles in innate and adaptive immunity. Based on the structure of the carbohydrate recognition domain (CRD) and their function, fish mucus lectins are classified as four types. Recent research has shed light on the structural diversity and functions in innate immunity of mucus lectins. Here, we reviewed recent research progress on the classification, biological properties and functions of fish mucus lectins. Analyses on other fish species are therefore important in clarifying lectin diversity and their functions in skin mucus. Keywords: Skin mucus; Lectins; Immunity; Function; Type 鱼 类 皮 肤 上 皮 组 织 中 分 布 有 大 量 粘 液 细 胞, 所 分 泌 粘 液 广 泛 覆 盖 在 鱼 体 表 面 构 成 其 与 外 界 直 接 接 触 的 第 一 道 门 户, 在 保 护 鱼 体 免 遭 外 界 环 境 中 的 病 菌 寄 生 物 和 病 毒 侵 袭 中 至 关 重 要 (Huang et al, 2009) 普 遍 认 为 体 表 粘 液 中 含 有 抵 抗 病 原 微 生 物 入 侵 的 非 特 异 性 免 疫 活 性 物 质, 尤 其 自 1969 年, Fletcher & Grant(1969) 提 出 在 血 清 和 粘 液 中 均 存 在 免 疫 球 蛋 白 后, 国 内 外 研 究 者 对 鱼 类 粘 液 的 免 疫 功 能 产 生 了 浓 厚 兴 趣 不 断 有 学 者 证 实 鱼 类 体 表 分 泌 物 中 存 在 补 体 溶 菌 酶 凝 集 素 C- 反 应 体 溶 血 素 抗 菌 肽 及 白 细 胞 介 素 IL-1 等 多 种 生 物 活 性 因 子 (Alexander & Ingram, 1992; Buchman & Bresciani, 1998; Ingram, 1980) 凝 集 素 作 为 具 有 糖 专 一 性 可 促 进 细 胞 凝 集 的 糖 蛋 白, 为 鱼 类 体 表 粘 液 中 的 重 要 天 然 免 疫 因 子, 且 已 逐 渐 成 为 研 究 热 点 本 文 结 合 国 内 外 研 究 成 果, 对 鱼 类 体 表 粘 液 凝 集 素 的 研 究 简 史 分 类 生 物 学 性 质 和 功 能 进 行 阐 述 1 鱼 类 粘 液 凝 集 素 研 究 简 史 不 同 于 免 疫 球 蛋 白, 凝 集 素 为 不 具 酶 催 化 活 性 收 稿 日 期 : ; 接 受 日 期 : 基 金 项 目 : 国 家 863 计 划 (2012AA100822); 现 代 农 业 产 业 技 术 体 系 建 设 专 项 (CARS-50- G01); 泰 山 学 者 建 设 工 程 专 项 通 信 作 者 (Corresponding author), maaj@ysfri.ac.cn 第 一 作 者 简 介 : 黄 智 慧 (1982 ), 女, 汉 族, 山 东 菏 泽 人, 博 士 研 究 生, zhihuih0710@yahoo.com.cn

2 6 期 黄 智 慧 等 : 鱼 类 体 表 粘 液 凝 集 素 研 究 进 展 675 的 蛋 白 质 或 糖 蛋 白, 能 专 一 多 价 与 糖 非 共 价 可 逆 结 合, 并 具 有 凝 集 细 胞 和 沉 淀 聚 糖 或 糖 复 合 物 的 作 用 (Sun, 1994; Zhang, 1999), 广 泛 存 在 于 生 物 细 胞 膜 细 胞 质 和 细 胞 外 基 质, 在 脊 椎 动 物 及 无 脊 椎 动 物 的 先 天 性 免 疫 和 宿 主 防 御 过 程 中 起 重 要 作 用, 参 与 异 己 识 别 炎 症 反 应 吞 噬 作 用 细 胞 与 细 胞 之 间 和 细 胞 与 外 界 之 间 的 联 络 受 精 发 育 及 再 生 等 过 程 (Goldstein et al, 1980; Kilpatrick, 2002) 凝 集 素 最 早 由 Stillmark 在 1888 年 从 蓖 麻 籽 和 红 豆 碱 中 发 现, 此 后,1919 年 Sumner 从 豌 豆 中 分 离 出 结 晶 蛋 白, 命 名 为 ConA, 并 用 此 方 法 第 一 次 获 得 了 纯 凝 集 素 (Xiong et al, 2006) 20 世 纪 70 年 代, 凝 集 素 独 特 的 性 质 引 起 越 来 越 多 学 者 的 兴 趣, 并 在 很 多 生 物 体 中 被 发 现 Watkins & Morgan (1952) 最 早 从 鳗 鱼 中 提 取 得 到 糖 特 异 性 凝 集 素, 后 来 研 究 确 定 为 L-fucose 凝 集 素 20 世 纪 80 年 代 后, 在 重 组 技 术 的 支 持 下, 鱼 类 凝 集 素 研 究 有 了 突 飞 猛 进 的 发 展, 人 们 从 鱼 体 中 分 离 筛 选 出 多 种 新 的 具 有 生 物 活 性 的 凝 集 素 经 研 究 发 现, 鱼 类 凝 集 素 在 体 内, 如 血 清 体 液 肌 肉 血 细 胞 及 受 精 卵 等 (Jensen et al, 1997; Russel & Lumsden, 2005; Tateno et al, 2002; Yano, 1997), 分 布 广 泛 的 同 时, 也 分 布 于 体 外, 如 鱼 类 体 表 粘 液 (Suzuki et al, 2003) 鱼 类 皮 肤 是 保 护 鱼 体 与 水 环 境 接 触 的 一 道 物 理 和 化 学 屏 障 皮 肤 粘 液 除 包 围 入 侵 微 生 物 外, 还 含 有 抗 菌 物 质 其 中, 凝 集 素 可 有 效 识 别 和 结 合 异 己 物 质, 产 生 凝 集 反 应, 从 而 防 止 外 来 微 生 物 等 入 侵 鱼 体 Kamiya & Shimizu (1980) 第 一 次 从 斑 点 犁 齿 鲆 (Lophopsetta maculata) 体 表 粘 液 中 分 离 出 了 凝 集 素, 随 后,Ingram(1980) 提 出 了 鱼 类 体 表 含 有 凝 集 素, 并 将 其 描 述 为 既 非 抗 体 类 亦 非 酶 类 的 碳 水 化 合 物 结 合 蛋 白 此 后 30 年, 有 关 鱼 类 体 表 粘 液 凝 集 素 的 研 究 有 了 更 长 足 的 进 步, 研 究 者 们 分 别 从 阿 拉 伯 海 鲇 (Arius thalassinus) 海 鳗 (Conger myriaster) 欧 洲 小 龙 (Repomucenus richardsoniii) 泥 鳅 (Misgurnus anguillicaudatus ) 岬 羽 鼬 (Genypterus capensis) 等 多 种 鱼 体 表 粘 液 中 分 离 并 纯 化 出 了 凝 集 素 (Goto-Nance et al, 1995; Kamiya et al, 1988; Shiomi et al, 1989, 1990; Toda et al, 1996), 不 断 证 实 凝 集 素 存 在 于 鱼 类 体 表, 并 与 体 液 免 疫 因 子, 如 免 疫 球 蛋 白 补 体 溶 菌 酶 和 血 溶 素 等, 具 有 同 等 重 要 的 抵 抗 病 原 菌 侵 入 的 功 能, 在 鱼 体 天 然 免 疫 系 统 中 至 关 重 要 但 当 时 对 体 表 粘 液 凝 集 素 蛋 白 质 结 构 分 子 结 构 及 其 生 物 学 功 能 却 鲜 有 报 道 Suzuki(1985) Suzuki & Kaneko (1986) 对 日 本 鳗 鲡 (Anguilla japonica) 凝 集 素 红 血 球 凝 集 反 应 的 研 究, 提 出 的 该 凝 集 素 存 在 于 上 皮 组 织 杯 形 细 胞 中 的 推 论, 为 体 表 粘 液 凝 集 素 定 位 及 其 生 物 学 功 能 研 究 的 首 次 报 道 其 后,Muramoto & Kamiya (1992) 对 康 吉 鳗 (Conger myriaster) 粘 液 凝 集 素 的 氨 基 酸 进 行 测 序, 并 于 1999 年 根 据 其 蛋 白 质 一 级 结 构 提 出 了 康 吉 鳗 体 表 粘 液 凝 集 素 包 括 congerins Ⅰ 和 congerins Ⅱ 两 种 结 构 类 型 此 后 将 近 8 年 的 时 间 里, 东 京 大 学 又 从 日 本 鳗 鲡 红 鳍 东 方 鲀 (Takifugu. Rubripes) 及 颈 带 鲾 (Leiognathus nuchalis) 的 体 表 粘 液 中 分 离 出 了 不 同 的 凝 集 素 (Okamoto et al, 2005; Tasumi et al, 2004; Tsutsui et al, 2006), 并 分 别 进 行 了 结 构 研 究, 最 终 根 据 其 糖 类 识 别 位 点 (carbohydrate recognition domains, CRDs) 的 差 异 以 及 Ca 2+ 依 赖 性 将 鱼 类 体 表 粘 液 凝 聚 素 确 定 为 4 种 类 型, 此 后 在 其 他 鱼 种 中 发 现 的 粘 液 凝 集 素 也 大 都 归 属 于 以 上 4 类 (Chen, 2010; Rajan et al, 2011) 2 体 表 粘 液 凝 集 素 结 构 类 型 及 其 功 能 研 究 迄 今 为 止, 共 鉴 定 有 4 种 鱼 类 体 表 粘 液 凝 集 素, 即 : 半 乳 凝 集 素 C 型 凝 集 素 Lily 型 凝 集 素 及 L- 鼠 李 糖 结 合 凝 集 素 (Suzuki et al, 2003), 表 现 广 泛 的 分 子 多 样 性 第 1 种 类 型 属 于 半 乳 凝 素, 其 中 包 括 从 康 吉 鳗 中 分 离 出 的 congerins Ⅰ, congerins Ⅱ, 以 及 从 日 本 鳗 鲡 中 分 离 出 的 AJL-1, 由 于 此 类 凝 集 素 可 特 异 性 结 合 半 乳 糖 或 乳 糖, 故 在 皮 肤 粘 液 中 占 大 多 数 (Suzuki, 1985; Suzuki & Kaneko, 1986) 第 2 种 类 型 是 典 型 的 C 型 凝 集 素, 最 早 发 现 于 日 本 鳗 鲡, 命 名 为 AJL-2(Tasumi et al, 2002) 第 3 种 类 型 是 由 红 鳍 东 方 鲀 中 提 取 的 特 异 性 甘 露 糖 凝 集 素, 结 构 与 单 子 叶 植 物 凝 集 素 相 似, 被 命 名 为 Lily-type lectin(suzuki et al, 2003) 第 4 种 提 取 自 颈 带 鲾 (Leiognathus nuchalis), 为 特 异 性 乳 糖 结 合 凝 集 素 (PFL-1,PFL-2)(Okamoto et al, 2005), 由 于 其 与 从 某 些 鱼 卵 中 所 提 取 的 L- 鼠 李 糖 结 合 凝 集 素 具 有 高 度 同 源 性, 故 被 归 属 于 L- 鼠 李 糖 结 合 凝 集 素 家 族 另 外, 近 期 还 发 现 了 一 种 存 在 于 鱼 类 体 表 粘 液 中 的 特 异 内 源 性 凝 集 素 (Tsutsui et al, 2011), 目 前 尚 未 确 定 该 凝 集 素 的 分 类, 本 文 暂 将 其 单 列 一 类

3 676 动 物 学 研 究 34 卷 表 1 体 表 粘 液 凝 集 素 分 类 及 特 征 汇 总 Table 1 Characteristics of skin mucus lectin in fish 半 乳 凝 集 素 Galectin C 型 凝 集 素 C-type lectin Lily 型 凝 集 素 Lily-type lectin L- 鼠 李 糖 结 合 凝 集 素 Rhamnose-lectin 内 源 性 凝 集 素 Intelectin 鱼 种 Species 康 吉 鳗 Conger 日 本 鳗 Anguilla japonica 日 本 鳗 Anguilla japonica 康 吉 鳗 Conger 红 鳍 东 方 鲀 Takifugu颈 带 鲾 Leiognathus Rubripes nuchalis 鲶 鱼 Silurus asotus 凝 集 素 名 称 Lectin name 特 异 性 结 合 糖 类 Specific sugar 凝 集 细 菌 / 寄 生 虫 Agglutination of bacteria or parasite 氨 基 酸 残 基 Amino acid residues Congerins ⅠⅡ AJL-1 β- 半 乳 糖 β-galactosid V.anguillarum Streptococcus sp. AJL-1 142aa AJL-2 ConCL-s 乳 糖 Lactose E. coli AJL-2 166aa ConCL-s 174aa Pufflectin 甘 露 糖 Mannose Microcyclus marina Met-schnikowia reukaufii, PFL-1 PFL-2 β- 半 乳 糖 β-galactosid Intelectin 甘 露 糖 Mannose 116aa PFL-1 231aa 308aa 2.1 半 乳 凝 集 素 galectins Galectins 又 称 半 乳 凝 集 素, 是 广 泛 存 在 的 主 要 凝 集 素 类 型, 具 以 下 特 性 : Ca 2+ - 不 依 赖 性 特 异 的 β- 半 乳 糖 苷 酶 活 性 N- 末 端 封 闭 缺 少 单 肽 与 糖 基 以 及 主 要 定 位 与 细 胞 质 (Kilpatrick, 2000) Galectin 存 在 于 动 物 体 内 及 某 些 低 等 脊 椎 动 物 的 体 表 粘 液 中, 如 非 洲 爪 蟾 (Xenopus laevis)(marschal et al, 1992) 以 及 康 吉 鳗 (congerins Ⅰ 和 congerins Ⅱ) 等 (Suzuki, 1985; Suzuki & Kaneko, 1986) Tasumi et al(2002) 对 提 取 自 日 本 鳗 鲡 的 凝 集 素 AJL-1 的 结 构 研 究 显 示, 其 表 现 β- 半 乳 糖 苷 酶 活 性 及 Ca 2+ - 不 依 赖 性,N- 末 端 封 闭, 由 142 个 氨 基 酸 残 基 组 成, 无 半 胱 氨 酸, 未 非 共 价 键 结 合 的 二 聚 体 结 构, 属 于 galectin 而 对 其 基 因 全 长 的 研 究 则 显 示,AJL bp 的 开 放 阅 读 框 编 码 142 个 氨 基 酸, 同 源 性 比 较 分 析 表 明 其 与 congerins Ⅱ 表 现 较 高 相 似 度 (45%), 且 AJL-1 具 三 个 不 同 的 糖 结 合 残 基, 与 congerins Ⅰ 结 构 相 似 (Shirai et al, 1999) 这 些 证 据 都 表 明 AJL-1 与 康 吉 鳗 粘 液 凝 集 素 同 源 性 较 高 基 因 表 达 检 测 显 示 该 凝 集 素 仅 存 在 于 体 表 粘 液, 且 表 达 含 量 很 高 (Kilpatrick, 2000) AJL-1 具 有 较 强 的 抵 抗 病 原 微 生 物 能 力, 对 致 病 菌 链 球 菌 属 均 表 现 凝 集 活 性, 是 鱼 类 体 表 粘 液 中 重 要 的 防 御 因 子 2.2 独 特 的 C 型 凝 集 素 在 动 物 凝 集 素 中,C 型 凝 集 素 分 布 广 泛, 功 能 复 杂, 涉 及 体 内 许 多 重 要 的 生 理 病 理 过 程 C 型 凝 集 素 成 员 均 含 有 一 个 或 多 个 特 征 性 糖 类 识 别 功 能 域 (CRD), 且 该 功 能 域 能 够 通 过 两 对 或 三 对 二 硫 键 形 成 明 显 而 稳 定 的 结 构, 具 有 Ca 2+ - 依 赖 性, 其 中 有 14 个 恒 定 残 基 ( 包 括 4 个 C 残 基 ) 和 18 个 保 守 残 基 大 多 数 C 型 凝 集 素 都 与 D 型 甘 露 糖 (D-mannose) D 型 葡 糖 糖 (D-glucose) 这 一 类 的 Man 型 配 体 (Gal-type ligands) 或 D 型 半 乳 糖 (D-galactose) 及 其 衍 生 物 结 合 (Kolatkar & Weis, 1996) 目 前 研 究 最 多 甘 露 糖 结 合 (mannose-binding protein, MBP)C 型 凝 集 素 是 激 活 免 疫 系 统 补 体 途 径 的 最 主 要 因 子 (Dong et al, 2004; Wei et al, 2010; Zhang et al, 2010) 在 鱼 类 中, 虹 鳟 (Oncorhynchus mykiss) 鲤 鱼 (Cyprinus carpio) 大 西 洋 鲑 (Salmo salar) 日 本 牙 鲆 (Paralichthys olivaceus) 以 及 大 菱 鲆 (Scophthalmus maximus) 中 的 C 型 凝 集 素 均 已 被 克 隆 并 进 行 了 部 分 功 能 验 证 (Kondo et al, 2007; Nakao et al, 2006; Nikolakopoulou & Zarkadis, 2006; Richards et al, 2003; Zhang et al, 2010) 上 述 C 型 凝 集 素 均 分 布 于 体 内, 直 到 2002 年, Tasumi 从 日 本 鳗 鲡 体 表 粘 液 中 分 离 出 凝 集 素 AJL-2, 其 结 构 与 C-type lectin 相 似, 均 具 有 一 段 保 守 性 氨 基 酸 序 列, 以 及 4 个 需 要 二 硫 键 联 接 的 保 守 半 胱 氨 酸 残 基 AJL-2 具 有 Ca 2+ - 不 依 赖 性, 其 基 因 序 列 中 包 括 498 bp 的 开 放 阅 读 框, 编 码 166 个 氨 基 酸, 同 源 性 比 对 分 析 发 现 其 与 肋 突 螈 (Pleurodeles), 响 尾 蛇 (Crotalus atrox) 及 小 鼠 等 多 个 物 种 的 C 型 凝 集 素 同 源, 同 源 性 30% Northern blot 分 析 发 现,AJL-2 仅 存 在 于 体 表, 且 在 鱼 体 上 皮 组 织 中 的 杯 型 细 胞 分 泌 液 泡 中 积 累 凝 集 反 应 实 验 表 明, AJL-2 的 凝 集 模 式 与 MBP 结 合 方 式 相 似, 对 病 原 菌 E.coli K 12 具 有 凝 集 作 用, 进 而 抑 制 细 菌 穿 透 细 胞 膜 进 入 机 体, 或 促 使 细 菌 陷 入 到 体 表 粘 液 中 最 终 被 新 分 泌 出 来 的 粘 液 冲 洗 掉 而 起 到 保 护 鱼 体 的 作 用 (Tasumi et al, 2002)

4 6 期 黄 智 慧 等 : 鱼 类 体 表 粘 液 凝 集 素 研 究 进 展 677 Tsutsui et al (2007) 由 康 吉 鳗 体 表 粘 液 中 发 现 了 另 一 种 对 酵 母 菌 具 凝 集 活 性 的 甘 露 糖 特 异 性 结 合 凝 集 素, 并 称 之 为 concl-s, 与 之 前 在 康 吉 鳗 中 发 现 的 congerins Ⅰ 和 congerins Ⅱ 不 属 于 同 一 类 型 该 凝 集 素 为 四 聚 体 结 构, 由 两 个 以 二 硫 键 结 合 且 单 体 分 子 量 为 的 二 聚 体 组 成, 其 结 构 属 于 C-type lectin 家 族 concl-s 对 酵 母 菌 的 结 合 表 现 明 显 Ca 2+ - 不 依 赖 性 基 因 表 达 实 验 发 现 其 广 泛 存 在 于 机 体 内 部 和 外 部 粘 膜 组 织 中, 如 皮 肤 鳃 舌 和 食 道, 在 这 些 组 织 中,conCL-s 对 细 菌 具 有 凝 集 性, 且 在 康 吉 鳗 巨 噬 细 胞 中,lectin 结 合 微 球 体 可 显 著 提 高 细 胞 的 吞 噬 作 用 这 些 发 现 均 表 明 concl-s 具 有 调 理 素 的 作 用, 在 体 表 天 然 免 疫 系 统 中 起 重 要 作 用 2.3 Lily 型 凝 集 素 pufflectin Suzuki et al(2003) 将 从 红 鳍 东 方 鲀 体 表 粘 液 中 提 取 出 的 pufflectin 认 定 为 第 3 种 类 型 凝 集 素, 并 命 名 为 Lily-type lectin 该 凝 集 素 较 为 特 殊,cDNA 全 长 527 bp, 包 括 编 码 116 个 氨 基 酸 的 348 bp 开 放 阅 读 框, 其 上 游 区 无 ATG 翻 译 起 始 位 点, 即 不 含 单 肽 的 特 征 常 见 于 半 乳 凝 集 素 (Kilpatrick, 2000) Pufflectin 氨 基 酸 序 列 与 目 前 发 现 的 任 何 一 类 动 物 凝 集 素 均 无 同 源 性, 却 与 单 子 叶 植 物 的 甘 露 糖 凝 集 素 高 度 同 源, 如 雪 花 莲 (Galanthus nicalis) 水 仙 花 (Narcissus hybrid cultivar) 韭 菜 (Allium prorrum) 和 大 蒜 (A.sativum) 等 这 些 植 物 的 凝 集 素 都 含 有 三 个 甘 露 糖 结 合 位 点, 而 pufflectin 被 证 实 含 有 其 中 两 个 (Tsutsui et al, 2007) 这 类 凝 集 素 在 体 内 分 布 广 泛, 在 鳃 口 腔 壁 食 道 以 及 体 表 都 有 表 达 据 报 道, 凝 集 素 与 细 菌 具 有 特 异 性 凝 集 现 象, 而 pufflectin 与 细 菌 并 不 发 生 凝 集 反 应, 但 却 对 寄 生 虫 具 有 凝 集 活 性, 这 一 发 现 指 出 其 对 鱼 体 在 由 寄 生 虫 引 起 的 机 体 防 御 系 统 中 起 重 要 作 用 Pufflectin 是 第 一 个 被 发 现 与 寄 生 虫 有 凝 集 现 象 的 鱼 类 体 表 粘 液 凝 集 素, 证 实 了 凝 集 素 对 细 菌 及 寄 生 虫 均 具 天 然 免 疫 功 能 2.4 L- 鼠 李 糖 结 合 凝 集 素 PFL-1,PFL-2 第 四 种 类 型 粘 液 凝 集 素 为 提 取 自 颈 带 鲾 (ponyfish Leiognathus nuchalis) 的 特 异 性 乳 糖 结 合 凝 集 素 (PFL-1,PFL-2),cDNA 全 长 bp, 包 括 693 bp 开 放 阅 读 框, 编 码 231 个 氨 基 酸 PFL-1 与 从 某 些 鱼 卵 中 提 取 的 L- 鼠 李 糖 结 合 凝 集 素 高 度 同 源, 均 拥 有 一 段 保 守 的 串 联 重 复 序 列, 故 归 属 于 L- 鼠 李 糖 结 合 凝 集 素 家 族 但 PFL-1 仅 表 达 于 体 表 粘 液, 而 不 存 在 于 性 腺 鳃 肝 脏 脾 脏 以 及 肠 道 PFL-2 与 PFL-1 的 N- 末 端 氨 基 酸 序 列 高 度 相 似, 被 确 认 与 PFL-1 同 型 (Okamoto et al, 2005) 该 种 凝 集 素 亦 具 有 凝 集 细 菌, 阻 止 其 进 入 而 保 护 鱼 体 的 重 要 免 疫 功 能, 但 其 具 体 作 用 机 理 尚 无 报 道 2.5 新 发 现 的 粘 液 凝 集 素 Tsutsui et al(2011) 在 鲶 鱼 (Silurus asotus) 体 表 粘 液 中 发 现 了 具 甘 露 糖 结 合 的 Ca 2+ - 依 赖 活 性 的 甘 露 糖 结 合 凝 集 素 凝 胶 过 滤 结 果 显 示, 其 具 有 单 聚 体 和 二 聚 体 形 式, 为 由 308 个 氨 基 酸 组 成 的 分 泌 蛋 白, 与 哺 乳 动 物 和 鱼 类 内 源 凝 集 素 同 源 该 凝 集 素 基 因 在 鱼 类 的 鳃 部 肾 和 皮 肤 都 有 所 表 达 抗 血 清 反 应 监 测 显 示, 内 源 性 凝 集 素 蛋 白 存 在 于 皮 肤 和 鳃 的 杯 型 细 胞 肾 脏 及 血 浆 此 凝 集 素 对 病 原 微 生 物 具 有 凝 集 活 性, 揭 示 其 在 鱼 类 体 表 抵 抗 外 来 细 菌 侵 入 的 自 我 保 护 系 统 中 至 关 重 要 而 且, 该 凝 集 素 的 发 现 证 实 内 源 性 蛋 白 同 样 存 在 于 鱼 类 体 表 粘 液, 为 对 凝 集 素 家 族 功 能 的 补 充 目 前 该 凝 集 素 分 类 尚 未 确 定, 暂 将 其 归 为 内 源 性 凝 集 素 类 随 着 分 子 生 物 学 蛋 白 组 学 技 术 及 测 序 技 术 的 迅 猛 发 展, 通 过 转 录 组 文 库 蛋 白 组 图 谱 等 高 端 技 术, 研 究 者 在 其 他 鱼 种 中 发 现 了 粘 液 凝 集 素, 如 Rajan et al (2011) 在 对 大 西 洋 鳕 鱼 (Gadus morhua) 粘 液 进 行 比 较 蛋 白 组 学 研 究 时, 就 发 现 其 存 在 Galectin-1 及 甘 露 糖 凝 集 素 (MBL),Bo et al(2012) 构 建 感 染 鳗 弧 菌 青 鳉 鱼 (Oryzia melastigma) 的 消 减 文 库,Blast 比 对 获 得 了 其 粘 液 凝 集 素 但 目 前 尚 未 深 入 开 展 这 些 凝 集 素 分 子 结 构 特 点 及 凝 集 反 应 现 象 等 有 关 功 能 特 性 的 研 究 3 鱼 类 体 表 粘 液 凝 集 素 功 能 性 研 究 展 望 凝 集 素 功 能 性 研 究 开 展 较 早 的 是 植 物 凝 集 素, 对 其 生 理 功 能 以 及 分 子 机 制 等 都 有 较 深 入 探 究, 尤 其 是 为 防 治 病 虫 害 开 拓 了 新 思 路 植 物 凝 集 素 被 认 为 是 植 物 防 御 系 统 的 重 要 组 成 部 分, 目 前, 更 多 应 用 于 转 基 因 抗 虫 品 种 的 培 育 及 抗 病 品 种 的 筛 选 海 洋 生 物 凝 集 素 相 对 发 展 较 晚, 自 20 世 纪 70 年 代 后 期, 其 在 贝 类 免 疫 识 别 中 的 作 用 才 为 人 们 所 关 注, 随 着 研 究 的 深 入, 现 已 发 现 海 洋 生 物 凝 集 素 的 生 物 活 性 绝 不 逊 色 于 陆 生 植 物 凝 集 素, 且 水 产 动 物 凝 集 素 的 研 究 也 已 有 不 少 报 道 (James & Rowland, 1974;Muramoto et al, 1994) 其 中, 鱼 类 凝 集 素 通 过 有 效 识 别 和 结 合 异 己 物 质, 提 高 吞 噬 细 胞

5 678 动 物 学 研 究 34 卷 对 异 己 物 质 的 吞 噬 灭 杀 作 用, 以 及 作 为 免 疫 活 性 物 质 保 护 机 体 的 防 御 功 能 已 得 到 了 越 来 越 多 的 关 注 鱼 类 体 表 粘 液 及 其 中 所 包 含 的 凝 集 素, 以 及 凝 集 素 的 分 子 结 构 多 样 性 在 保 护 鱼 体 免 遭 外 界 环 境 中 的 病 菌 寄 生 物 和 病 毒 的 侵 袭 中 至 关 重 要 (Huang et al, 2009) 粘 液 凝 集 素 对 寄 生 虫 也 表 现 强 烈 的 凝 集 活 性, 同 时, 还 具 有 调 理 素 的 功 能 因 此, 掌 握 其 生 物 功 能 的 多 样 性 及 特 殊 性, 对 于 了 解 鱼 类 粘 液 免 疫 系 统 以 及 抵 抗 外 界 环 境 胁 迫 效 应 都 有 着 广 泛 的 应 用 前 景 日 本 东 京 大 学 SuzukiYuzuru 教 授 经 过 近 10 年 的 研 究, 目 前, 已 从 多 个 物 种 中 分 离 纯 化 出 了 凝 集 素, 并 对 其 蛋 白 及 分 子 结 构 作 了 详 细 分 析 和 功 能 验 证, 根 据 其 对 糖 特 异 性 结 合 位 点 及 对 Ca 2+ - 依 赖 性 等 结 构 性 特 性 进 行 了 初 步 分 类 但 这 些 成 果 对 于 大 规 模 凝 集 素 功 能 性 应 用 开 发 而 言, 只 是 初 级 阶 段, 关 于 体 表 粘 液 凝 集 素 的 功 能 性 分 子 机 理 以 及 应 用 性 研 究 仍 需 进 一 步 研 究 笔 者 认 为, 凝 集 素 具 有 多 价 结 合 能 力, 能 与 荧 光 素 酶 生 物 素 铁 蛋 白 及 胶 体 金 等 结 合, 而 不 影 响 其 生 物 活 性, 可 用 于 光 镜 或 电 镜 水 平 的 免 疫 细 胞 化 学 研 究 工 作, 探 究 机 体 在 处 于 环 境 胁 迫 条 件 下 的 体 表 上 皮 细 胞 分 化 增 生 和 恶 变 的 生 物 学 演 变 过 程, 了 解 病 理 变 化, 从 而 对 机 体 状 态 作 出 诊 断 评 价 而 且 粘 液 凝 集 素 对 于 不 同 类 型 的 细 菌 具 有 特 异 凝 集 活 性, 可 以 作 为 粗 略 鉴 定 病 原 微 生 物 的 指 示 因 子 总 之, 粘 液 凝 集 素 作 为 生 物 体 内 特 殊 的 糖 蛋 白, 存 在 于 鱼 体 与 外 界 直 接 接 触 的 第 一 道 门 户 体 表 粘 液 中, 在 鱼 类 整 个 生 命 过 程 中 至 关 重 要 它 在 认 识 和 解 决 鱼 类 集 约 化 半 集 约 化 养 殖 疾 病 防 治 中 的 重 要 意 义 也 得 到 了 越 来 越 多 的 关 注, 而 且 随 着 生 物 工 程 研 究 手 段 和 研 究 领 域 的 不 断 扩 大, 对 其 开 发 利 用 和 生 化 工 程 技 术 的 拓 展 将 具 有 广 阔 应 用 前 景 参 考 文 献 : Alexander JB, Ingram GA Noncellular nonspecific defence mechanisms of fish. Annual Review of Fish Diseases, 2: Bo J, Giesy JP, Ye R, Wang KJ, Lee JS, Au DW Identification of differentially expressed genes and quantitative expression of complement genes in the liver of marine medaka Oryzias melastigma challenged with Vibrio parahaemolyticus. Comparative Biochemistry and Physiology, Part D, 7(2): Buchman K, Bresciani J Microenvironment of Gyrodactylus derjavini on rainbow trout Oncorhynchus mykiss: association between mucous cell density in skin and site selection. Parasitology Research, 84(1): Chen YY Identification and Molecular Characterization of Three Kinds of Lectin in Large Yellow Croaker. Guangzhou: Sun Yar-sen University, [ 陈 园 园 大 黄 鱼 三 种 凝 集 素 的 克 隆 表 达 进 化 分 析 和 功 能 研 究. 广 州 : 中 山 大 学, ] Dong CH, Yang ST, Yang ZA, Zhang L, Gui JF A C-type lectin associated and translocated with cortical granules during oocyte maturation and egg fertilization in fish. Developmental Biology, 265(2): Fletcher TC, Grant PT Immunoglobulins in the serum and mucus of the plaice (Pleuronetes platessa). The Journal of Biochemistry, 115(5): Goldstein IJ, Huges RC, Monsigny M, Osawa T, Sharon N What should be called a lectin. Nature, 285(5760): 66. Goto-Nance R, Watanabe Y, Kamiya H, Ida H Characterization of lectins from the skin mucus of the loach Misgurnus anguillicaudatus. Fisheries Science, 61(1): Huang ZH, Ma AJ, Wang M Research progression in secretion of fish skin mucous and its function. Marine Sciences, 33(1): [ 黄 智 慧, 马 爱 军, 汪 岷 鱼 类 体 表 黏 液 分 泌 功 能 与 作 用 研 究 进 展. 海 洋 科 学, 33(1): ] Ingram GA Substances involved in the natural resistance of fish to infection: a review. Journal of Fish Biology, 16(1): James LH, Rowland DT Jr Heterogeneity of lobster agglutinins. Purification and physicochemical characterization. Biochemistry, 13(4): Jensen LE, Thiel S, Petersen TE, Jensenius JC A rainbow trout lectin with multimeric structure. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 116(4): Kamiya H, Shimizu Y Marine biopolymer with cell specificity: Ⅱ. Purification and characterization of agglutinins from mucus of windowpane flounder Lophopsetta maculata. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure, 622(2): Kamiya H, Muramoto K, Goto R Purification and properties of agglutinins from conger eel, Conger myriaster (Brevoort), skin mucus. Developmental & Comparative Immunology, 12(2): Kilpatrick DC Handbook of Animal Lectins. Chichester: Wiley, Kilpatrick DC Animal lectins: a historical introduction and overview. Biochimica et Biophysica Acta, 1572(2-3): Kolatkar AR, Weis WI Structural basis of galactose recognition by C-type animal lectins. Journal of Biological Chemistry, 271(12): Kondo H, Yeu Tzeh AG, Hirono I, Aoki T Identification of a novel C-type lectin gene in Japanese flounder, Paralichthys olivaceus. Fish & Shellfish Immunology, 23(5): Muramoto K, Kamiya H The amino-acid sequence of a lectin from conger eel, Conger myriaster, skin mucus. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, 1116(2): Muramoto K, Yako H, Kamiya H Multiple lectins as major proteins

6 6 期 黄 智 慧 等 : 鱼 类 体 表 粘 液 凝 集 素 研 究 进 展 679 in the coelomic fluid of the acorn barnacle Megabalanus rosa. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry, 107(3): Muramoto K, Kagawa D, Sato T, Ogawa T, Nishida Y, Kamiya H Functional and structural characterization of multiple galectins from the skin mucus of conger eel, Conger myriaster. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 123(1): Nakao M, Kajiya T, Sato Y, Somamoto T, Kato-Unoki Y, Matsushita M, Nakata M, Fujita T, Yano T Lectin pathway of bony fish complement: identification of two homologs of the mannose-binding lectin associated with MASP2 in the common carp (Cyprinus carpio). The Journal of Immunology, 177(8): Nikolakopoulou K, Zarkadis IK Molecular cloning and characterisation of two homologues of mannose-binding lectin in rainbow trout. Fish & Shellfish Immunology, 21(3): Richards RC, Hudson DM, Thibault P, Ewart KV Cloning and characterization of the Atlantic salmon serum lectin, a long-form C-type lectin expressed in kidney. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, 1621(1): Okamoto M, Tsutsui S, Tasumi S, Suetake H, Kikuchi K, Suzuki Y Tandem repeat L-rhamnose-binding lectin from the skin mucus of ponyfish, Leiognathus nuchalis. Biochemical and Biophysical Research Communications, 333(2): Rajan B, Fernandes JMO, Caipang CMA, Kiron V, Rombout JHWM, Brinchmann MF Proteome reference map of the skin mucus of Atlantic cod (Gadus morhua) revealing immune competent molecules. Fish & Shellfish Immunology, 31(2): Russel S, Lumsden JS Function and heterogeneity of fish lectins. Veterinary Immunology and Immunopathology, 108(1-2): Shiomi K, Uematsu H, Yamanaka H, Kikuchi T Purification and characterization of a galactose-binding lectin from the skin mucus of the conger eel Conger myriaster. Comparative Biochemistry and Physiology B, 92(2): Shiomi K, Uematsu H, Ito H, Yamanaka H, Kikuchi T Purification and properties of a lectin in the skin mucus of the dragonet Repomucenus richardsonii. Nippon Suisan Gakkaishi, 56(1): Shirai T, Mitsuyama C, Niwa Y, Matsui Y, Hotta H, Yamane T, Kamiya H, Ishii C, Ogawa T, Muramoto K High-resolution structure of the conger eel galectin, congerin I, in lactose-liganded and ligand-free forms: emergence of a new structure class by accelerated evolution. Structure, 7(10): Sun C Talk about the basic principles of the lection role and the structure of the glycoprotein oligosaccharide. Biology of Chemical, 14(2): [ 孙 册 谈 谈 凝 集 素 作 用 的 基 本 原 理 和 糖 蛋 白 的 寡 糖 结 构. 生 物 的 化 学, 14(2): ] Suzuki Y Hemolysin and hemagglutinin in skin mucus of the Japanese ell Anguilla japonica. Nippon Suisan Gakkaishi, 51: Suzuki Y, Kaneko T Demonstration of the mucous hemagglutinin in the club cells of eel skin. 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