中 華 醫 事 科 技 大 學 碩 士 班 研 究 生 論 文 口 試 委 員 會 審 定 書 醫 事 技 術 系 暨 研 究 所 碩 士 班 江 冠 勳 君 所 提 之 論 文 乳 酸 菌 對 抗 陰 道 病 原 菌 的 能 力 分 析, 經 本 委 員 會 審 議, 符 合 碩 士 資 格 標

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1 中 華 醫 事 科 技 大 學 生 物 科 技 研 究 所 碩 士 論 文 乳 酸 菌 對 抗 陰 道 病 原 菌 的 能 力 分 析 Inhibitory Analysis of Lactic Acid Bacteria on Vaginal Pathogens 研 究 生 : 江 冠 勳 指 導 教 授 : 呂 英 震 博 士 中 華 民 國 一 百 年 三 月

2 中 華 醫 事 科 技 大 學 碩 士 班 研 究 生 論 文 口 試 委 員 會 審 定 書 醫 事 技 術 系 暨 研 究 所 碩 士 班 江 冠 勳 君 所 提 之 論 文 乳 酸 菌 對 抗 陰 道 病 原 菌 的 能 力 分 析, 經 本 委 員 會 審 議, 符 合 碩 士 資 格 標 準 論 文 口 試 委 員 會 召 集 人 ( 簽 章 ) 委 員 ( 簽 章 ) ( 簽 章 ) ( 簽 章 ) ( 簽 章 ) ( 簽 章 ) 所 長 ( 簽 章 ) 中 華 民 國 一 百 年 一 月 十 一 日 - i -

3 中 華 醫 事 科 技 大 學 碩 士 論 文 全 文 電 子 檔 案 上 網 授 權 書 本 授 權 書 所 授 權 之 論 文 全 文 電 子 檔 案, 為 本 人 於 中 華 醫 事 科 技 大 學, 撰 寫 之 碩 士 學 位 論 文 ( 以 下 請 擇 一 勾 選 ) 同 意 立 即 開 放 同 意 一 年 後 開 放, 原 因 是 : 同 意 二 年 後 開 放, 原 因 是 : 同 意 三 年 後 開 放, 原 因 是 : 以 非 專 屬 無 償 授 權 中 華 醫 事 科 技 大 學 圖 書 館 和 國 家 圖 書 館 基 於 推 動 資 源 共 享 互 惠 合 作 之 理 念, 於 回 饋 本 校 與 社 會 作 為 學 術 研 究 目 的 之 用, 得 不 限 地 域 時 間 與 次 數, 以 紙 本 光 碟 學 位 論 文 全 文 系 統 網 路 或 其 他 各 種 方 法 收 錄 重 製 與 發 行, 或 再 授 權 他 人 以 各 種 方 法 重 製 與 利 用, 以 提 供 讀 者 基 於 個 人 非 營 利 性 質 之 線 上 檢 索 閱 覽 下 載 或 列 印 研 究 生 : 江 冠 勳 論 文 名 稱 : 乳 酸 菌 對 抗 陰 道 病 原 菌 的 能 力 分 析 指 導 教 授 : 呂 英 震 系 所 : 生 物 科 技 研 究 所 生 醫 產 業 科 技 組 學 號 : A 日 期 : 民 國 一 百 年 三 月 二 十 二 日 備 註 : 1. 本 授 權 書 請 填 寫 並 以 黑 色 筆 親 筆 簽 名 後, 裝 訂 於 各 紙 本 論 文 封 面 後 之 次 頁 2. 讀 者 基 於 非 個 人 營 利 性 質 之 線 上 檢 索 閱 覽 下 載 或 列 印 上 列 論 文, 應 依 著 作 權 法 有 關 規 定 辦 理 - ii -

4 致 謝 本 論 文 得 以 順 利 完 成, 要 感 謝 在 這 段 時 間 陪 我 歷 經 每 ㄧ 段 過 程 的 人, 首 先 誠 摯 感 謝 指 導 教 授 呂 英 震 博 士 的 多 年 來 的 悉 心 指 導 與 教 誨, 讓 我 在 實 驗 遇 到 困 境 時 會 引 領 我 去 突 破 自 己 的 困 境, 而 能 一 點 一 滴 的 架 構 出 觀 念, 且 於 撰 寫 論 文 及 口 試 期 間 撥 冗 批 閱 及 斧 正 論 文, 使 本 論 文 能 更 趨 完 備, 除 了 能 夠 完 成 學 業 外, 也 學 習 到 不 少 待 人 處 事 與 解 決 問 題 的 能 力, 於 此 獻 上 最 誠 摯 的 謝 意 同 時, 感 謝 美 麗 的 助 理 惠 如 在 收 集 實 驗 資 料 時, 義 不 容 辭 的 幫 助 以 及 學 弟 大 熊 冠 偉 阿 先 和 豬 仔 實 驗 上 的 協 助 與 球 技 上 的 切 磋, 還 有 學 妹 小 魚 小 緋 西 瓜 小 孟 小 四 欣 容 大 媽 韋 璇, 因 為 有 你 們 才 讓 實 驗 室 生 活 不 至 於 太 過 乏 味, 讓 我 在 研 究 生 涯 中 增 添 許 多 難 忘 的 回 憶, 因 為 有 你 們 的 幫 忙 與 協 助, 一 起 經 歷 每 ㄧ 個 實 驗, 才 能 完 成 這 篇 研 究 最 後, 感 謝 我 的 母 親 舅 舅 姐 姐 和 姊 夫 所 給 予 的 支 持 與 關 懷, 讓 我 在 學 習 過 程 中 無 後 顧 之 憂, 還 有 我 的 女 友 玟 蕙 在 我 最 需 要 幫 忙 時 給 予 鼓 勵 並 且 分 享 我 的 喜 怒 哀 樂, 在 此 希 望 將 ㄧ 切 榮 耀 與 成 就 呈 獻 給 我 最 深 愛 的 家 人 - iii -

5 中 文 摘 要 在 近 代 的 社 會 中, 細 菌 性 陰 道 炎 是 現 代 女 性 最 常 遇 到 的 健 康 問 題 之 一, 加 上 台 灣 氣 候 潮 濕 悶 熱, 私 密 處 困 擾 應 該 更 加 普 遍 徹 底 清 潔 的 觀 念 只 會 讓 陰 道 感 染 更 加 惡 化, 即 便 以 抗 生 素 治 療, 不 僅 效 果 不 彰 且 副 作 用 大, 覆 發 率 更 高 達 5 成 乳 酸 菌 是 生 殖 道 中 的 優 勢 共 生 菌 種, 藉 由 維 持 酸 性 環 境 分 泌 抗 菌 物 質 來 抑 制 陰 道 病 原 菌 種 生 長 或 粘 附 在 上 皮 組 織 中 本 篇 論 文 之 目 的 就 是 利 用 乳 酸 菌 所 產 的 乳 酸 H 2 O 2 細 菌 素 以 及 生 物 膜 來 對 抗 陰 道 病 原 菌 的 能 力 分 析 此 實 驗 篩 選 出 9 種 乳 酸 菌 菌 種 共 有 82 株 菌 實 驗 結 果 顯 示 乳 酸 菌 的 ph 值 在 3.6~4.55 之 間 (24 小 時 ) 3.5~4.5 (48 小 時 ), 酸 度 在 0.198~0.045% 之 間 H 2 O 2 和 乳 酸 對 Candida albicans Gardnerella vaginalis 和 Escherichia coli 的 MIC 試 驗,H 2 O 2 對 Candida albicans 的 最 小 抑 菌 濃 度 為 0.116mM, 對 Gardnerella vaginalis 的 最 小 抑 菌 濃 度 為 0.029mM, 對 Escherichia coli 的 最 小 抑 菌 濃 度 為 mM, 乳 酸 對 Candida albicans 的 最 小 抑 菌 濃 度 為 85%, 對 Gardnerella vaginalis 的 最 小 抑 菌 濃 度 為 4.25%, 對 Escherichia coli 的 最 小 抑 菌 濃 度 為 2.125% 最 後 在 所 有 抗 菌 試 驗 中 發 現 Lactobacillus reuteri 此 菌 種 針 對 Candida albicans 和 Gardnerella vaginalis 抑 制 能 力 效 果 最 佳 ;Lactobacillus rhamnosus 對 Escherichia coli 的 抑 制 能 力 最 好 關 鍵 字 : 細 菌 性 陰 道 炎 Lactobacillus Reuteri Lactobacillus rhamnosus Candida albicans Gardnerella vaginalis Escherichia coli - iv -

6 Abstract In modern society, modern women bacterial vaginosis is the most commonly encountered health problems, in addition Taiwan climate moist sultry, the feminine private parts problems should be more common. The traditional concept thorough cleaning will only worsen vaginal infections, even with antibiotic treatment, and side effects is not only ineffective, the recurrence rate as high as 50 percent. Lactic acid bacteria are the advantages of the genital tract symbiotic bacteria, by maintaining the acidic environments, the secretion of antimicrobial substances to inhibit the growth of vaginal pathogenic bacteria species or adhesion in epithelial tissues. The purpose of this thesis is the use of lactic acid, H 2 O 2, bacteriocin and the biofilm produced by lactic acid bacteria against the ability of vaginal pathogens. This experiment screened 9 species of 82 strains of lactic acid bacteria strains. The results showed that lactic acid ph value between 3.6 ~ 4.55 (24h), 3.5 ~ 4.5 (48 h), acidity in the ~ 0.045%. H 2 O 2 and lactic acid on Candida albicans, Gardnerella vaginalis and Escherichia coli the minimum inhibitory concentration (MIC) test, H 2 O 2 on the minimum inhibitory concentration of Candida albicans to 0.116mM, on the minimum inhibitory concentration of Gardnerella vaginalis as 0.029mM, of Escherichia coli minimum inhibitory concentration mM, lactic acid on Candida albicans of the minimum inhibitory concentration of 85%, of Gardnerella vaginalis in the minimum inhibitory concentration of 4.25%, on the Escherichia coli minimum inhibitory concentration of 2.125%. Finally, all antimicrobial tests found that this strain Lactobacillus reuteri for Candida albicans and Gardnerella vaginalis rejection the best. Lactobacillus rhamnosus against Escherichia coli is the ability to inhibit the best. Keyword: bacterial vaginosis, Lactobacillus Reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Candida albicans, Gardnerella vaginalis, Escherichia coli - v -

7 論 文 目 錄 論 文 口 試 委 員 會 審 定 書... i 授 權 書... ii 致 謝... iii 中 文 摘 要... iv Abstract... v 論 文 目 錄... vi 圖 表 目 錄... viii 第 一 章 緒 論 研 究 背 景 研 究 動 機 與 目 的... 5 第 二 章 相 關 議 題 探 討 陰 道 炎 與 主 要 致 病 菌 種 陰 道 炎 之 種 類 陰 道 炎 主 要 致 病 菌 種 乳 酸 菌 乳 酸 菌 基 本 特 性 各 乳 酸 菌 屬 主 要 特 性 簡 述 乳 酸 菌 在 人 體 的 生 理 活 性 乳 酸 菌 抑 菌 機 制 第 三 章 材 料 與 方 法 材 料 實 驗 方 法 篩 菌 試 驗 生 物 膜 vi -

8 酸 度 產 H 2 O 2 試 驗 抑 菌 試 驗 最 小 抑 菌 濃 度 (MIC) 實 驗 結 果 第 四 章 討 論 與 結 論 參 考 文 獻 vii -

9 圖 表 目 錄 表 一 篩 選 出 的 陰 道 乳 酸 菌 種 菌 種 及 株 數 表 二 酸 度 表 三 抑 菌 圈 大 小 表 四 各 種 陰 道 炎 分 泌 物 所 呈 現 特 徵 比 較 表 圖 1-1 乳 酸 菌 抑 制 致 病 菌 生 長 過 程 圖 2-1 女 性 生 殖 系 統 圖 2-2 有 機 酸 之 抑 菌 機 制 圖 2-3 乳 酸 菌 產 生 過 氧 化 氫 之 反 應 機 制 圖 2-4 分 子 結 構 式 圖 3-1 實 驗 流 程 圖 3-2 陰 道 乳 酸 菌 產 生 生 物 膜 的 強 度 圖 3-3 陰 道 乳 酸 菌 所 產 生 的 H 2 O 2 的 能 力 圖 3-4 陰 道 乳 酸 菌 產 生 乳 酸 的 強 弱 之 分 圖 3-5 本 實 驗 室 篩 出 的 陰 道 乳 酸 菌 針 對 Candida albicans 試 驗 圖 3-6 本 實 驗 室 篩 出 的 陰 道 乳 酸 菌 針 對 Gardnerella vaginal 試 驗 圖 3-7 本 實 驗 室 篩 出 的 陰 道 乳 酸 菌 針 對 Escherichia coli 試 驗 圖 3-8 MIC ( 最 小 抑 菌 濃 度 ) 試 驗 圖 3-9 MIC ( 最 小 抑 菌 濃 度 ) 試 驗 圖 3-10 MIC ( 最 小 抑 菌 濃 度 ) 試 驗 viii -

10 第 一 章 緒 論 1.1. 研 究 背 景 近 年 來, 隨 著 女 性 自 主 意 識 的 提 升, 其 獨 立 及 生 活 地 位 逐 漸 的 明 朗 化, 也 逐 漸 邁 入 有 自 我 的 自 主 權 不 須 倚 靠 男 性 過 活 的 時 代 但 在 外 表 光 鮮 亮 麗 之 下 可 能 忽 略 了 內 在 潛 藏 的 問 題, 那 就 是 私 密 處 的 問 題 國 外 研 究 指 出 女 大 學 生 最 常 遇 到 私 密 處 的 困 擾, 也 是 最 想 了 解 的 健 康 問 題 之 一, 約 有 四 分 之 一 的 女 大 學 生 曾 有 私 密 處 感 染 病 史 (Anukam K.C. et al., 2004; Foxman B. et al., 1990),30 歲 以 前 曾 被 感 染 的 比 率 高 達 50% (Zielske J.V. et al., 1981), 四 分 之 三 的 女 性 有 非 經 常 性 的 念 珠 球 陰 道 炎 感 染 (Sobel J.D. et al., 2000), 俗 語 說 十 女 九 帶 更 是 透 露 了 大 多 數 的 女 性 都 有 分 泌 物 過 多 或 氣 味 不 佳 等 困 擾, 外 加 台 灣 氣 候 悶 熱 潮 濕, 環 境 條 件 與 生 活 壓 力 大, 其 盛 行 率 可 能 更 為 普 遍 為 了 解 決 私 密 處 問 題, 通 常 會 先 採 取 加 強 清 洗 陰 道 內 灌 洗 使 用 衛 生 棉 墊, 或 是 以 婦 潔 液 等 消 毒 用 品, 也 就 是 企 圖 徹 底 清 潔 私 密 部 位, 以 上 方 法 沒 改 善, 就 醫 是 最 後 也 是 最 不 得 已 的 選 擇 然 而, 這 些 措 施 反 而 是 導 致 細 菌 性 陰 道 炎 的 高 危 險 因 子 (Alfonsi G.A. et al., 2004) 不 幸 的 是, 目 前 利 用 抗 生 素 治 療 是 唯 一 的 選 擇, 不 僅 副 作 用 多 且 復 發 率 高 達 50% (Ozkinay E. et al., 2005) 研 究 發 現 每 12 個 女 性 中 就 有 1 人, 每 年 - 1 -

11 會 發 生 高 達 4 次 以 上 的 重 覆 感 染 (Hillier S. et al., 1999) 另 外 根 據 三 軍 總 醫 院 的 相 關 研 究 統 計, 在 泌 尿 科 門 診 中, 帄 均 每 3~4 人, 就 有 一 人 是 罹 患 泌 尿 道 感 染 ; 在 美 國, 每 年 將 有 近 七 百 萬 人 因 泌 尿 道 系 統 感 染 的 問 題 求 診, 尤 其 是 女 性 的 求 診 數 目, 遠 超 過 男 性 求 診 數 目 達 十 至 十 五 倍 以 上 ; 其 中 以 生 育 年 齡 層 及 65 歲 以 上 女 性 病 患 最 為 常 見 造 成 陰 道 發 炎 感 染 可 分 兩 種, 一 種 是 接 觸 性 皮 膚 炎, 如 很 多 女 性 為 避 免 分 泌 物 過 多 而 使 用 護 墊, 但 卻 反 而 容 易 造 成 磨 擦 悶 濕, 而 引 發 陰 道 發 炎 發 癢 症 狀 ; 另 一 種 感 染 途 徑, 則 經 由 細 菌 與 黴 菌 傳 染, 如 : 念 珠 菌 大 腸 桿 菌 葡 萄 球 菌 與 鏈 球 菌 等, 所 引 起 的 發 炎 症 狀, 尤 其 在 經 期 結 束 前 特 別 顯 著, 因 血 液 是 細 菌 黴 菌 孳 生 的 溫 床, 因 此 在 經 血 後 特 別 易 有 陰 道 感 染 症 狀 此 外, 衣 服 未 乾 潮 濕 悶 熱 或 經 由 性 行 為 手 接 觸 陰 部, 將 表 面 皮 膚 原 本 存 在 的 葡 萄 球 菌 與 鏈 球 菌 帶 到 陰 部, 都 會 助 長 細 菌 與 黴 菌 孳 生 私 密 處 的 悶 濕, 以 及 一 些 生 長 條 件 的 助 長, 使 念 珠 菌 及 葡 萄 球 菌 等 生 長 速 度 過 快, 讓 陰 道 處 的 乳 酸 桿 菌 來 不 及 抑 制 市 面 上 的 私 密 處 清 潔 液, 雖 然 可 去 除 念 珠 菌 等 壞 菌, 但 也 會 除 掉 抑 制 壞 菌 生 長 的 乳 酸 桿 菌 等 益 菌, 反 而 增 加 感 染 機 率 醫 師 指 出, 帄 常 應 作 息 正 常 少 熬 夜, 多 攝 取 乳 酸 桿 菌 提 升 免 疫 力, 而 增 加 乳 酸 桿 菌 數 量 就 可 減 少 壞 菌 的 數 量, 也 - 2 -

12 使 得 降 低 陰 道 炎 的 發 生 率, 由 此 可 知 乳 酸 桿 菌 可 能 與 陰 道 炎 的 抑 制 有 關 乳 酸 菌 (Lactobacilli) 在 陰 道 中 的 濃 度 為 10 7 ~10 8 CFU0g -1, 是 健 康 女 性 陰 道 中 的 優 勢 共 生 菌 屬 (Sobel J.D. et al., 1996) 許 多 研 究 證 實, 女 性 陰 道 中 的 乳 酸 菌 可 以 抑 制 多 種 造 成 細 菌 性 陰 道 炎 和 黴 菌 性 ( 念 珠 菌 ) 陰 道 炎 的 革 蘭 氏 陽 性 嗜 氧 菌 革 蘭 氏 陰 性 菌 (Juarez Tomas M.S. et al., 2003 Skarin A. et al., 1986 Klebanoff S.J et al., 1991 Mastromarino P. et al., 2002) 及 黴 菌, 以 及 引 起 尿 道 炎 的 大 腸 桿 菌 之 生 長, 所 以 失 去 陰 道 乳 酸 菌 被 認 為 是 造 成 多 種 陰 道 炎 和 尿 道 炎 的 主 因 (Sobel J.D. et al., 2000), 局 部 減 少 或 缺 乏 乳 酸 菌 會 增 加 2 至 4 倍 的 陰 道 炎 發 生 率 (Hawes S.E. et al., 1996), 也 是 反 覆 性 泌 尿 道 感 染 (Gupta K. et al., 1998) 愛 滋 病 毒 感 染 (Martin H.L. et al., 1999) 及 陰 道 癌 (Tomas M.S. et al., 2003) 的 高 危 險 因 子 陰 道 中 的 乳 酸 菌 限 制 致 病 菌 的 生 長 主 因 有 二, 第 一 個 原 因 是 彼 此 相 互 競 爭 吸 附 空 間 ; 乳 酸 菌 減 少 致 病 菌 寄 生 在 陰 道 上 皮 細 胞 的 機 會, 因 而 使 致 病 菌 無 法 大 量 繁 殖 (Boris S. et al.,2000) 第 二 個 原 因 是 乳 酸 菌 可 以 分 泌 許 多 抑 菌 物 質, 包 括 乳 酸 (lactic acid) 過 氧 化 氫 (hydrogen peroxide, H 2 O 2 ) 細 菌 素 (bacteriocins) 等 等 細 菌 素 (bacteriocins) 包 括 有 抗 菌 蛋 - 3 -

13 白 質 與 胜 肽 reuterin 及 雙 乙 醯 等 (1) 乳 酸 (lactic acid): 乳 酸 菌 發 酵 後 會 產 生 乳 酸 醋 酸 等 有 機 酸, 這 些 弱 酸 的 蓄 積 會 導 致 ph 值 下 降 到 微 生 物 無 法 生 長 的 範 圍 (Ita P. S. et al., 1991 ;Vandenbergh et al., 1993) ( 維 持 在 ph 值 4.5 以 下 的 酸 性 範 圍 ) ( 如 圖 1-1) (2) 過 氧 化 氫 (hydrogen peroxide, H 2 O 2 ): 乳 酸 菌 本 身 缺 乏 過 氧 化 氫 分 解 酵 素, 但 所 含 的 黃 素 蛋 白 氧 化 (flavoprotein) 的 氧 化 酵 素, 能 以 氧 做 為 之 電 子 接 受 體, 在 氧 的 存 在 之 下 形 成 過 氧 化 氫 ( 蘇, 1999), 但 目 前 H 2 O 2 的 抑 菌 能 力 卻 還 不 是 很 清 楚 (3) 細 菌 素 (Bacteriocins): 乳 酸 菌 可 生 產 具 有 抗 菌 性 質 的 蛋 白 質 或 胜 肽, 在 這 些 抗 菌 的 蛋 白 質 或 胜 肽 中, 分 子 量 大 於 20 kda 的 通 常 有 酵 素 的 活 性, 抗 菌 的 機 制 是 藉 由 酵 素 直 接 抑 制 目 標 菌 的 細 胞 膜, 這 些 大 分 子 的 蛋 白 質 例 如 溶 菌 素 (lysin) 及 胞 壁 酶 (muramidase) 而 小 於 10 kda 的 小 分 子 胜 肽, 例 如 細 菌 素, 則 是 以 非 酵 素 形 式 達 到 抗 菌 的 作 用 ; 即 藉 由 本 身 的 結 構 特 性 來 破 壞 目 標 菌 的 細 胞 結 構, 這 些 蛋 白 質 和 胜 肽 的 結 構 與 種 類 繁 多, 主 要 的 作 用 機 轉 可 能 來 自 抑 制 其 它 細 菌 的 細 胞 壁 生 合 成, 或 是 抑 制 DNA RNA, 使 細 菌 沒 有 足 夠 的 能 量 執 行 生 合 成 步 驟 而 無 法 生 存 (Abee T.et al., 1995 Jack R.et al., 1995 Parente E.et al., 1999 Simon - 4 -

14 L.et al., 2002 Tagg J.R.et al., 1976) 1.2. 研 究 動 機 與 目 的 乳 酸 菌 藉 由 維 持 酸 性 環 境 分 泌 抗 菌 物 質 來 抑 制 其 它 菌 種 生 長 或 粘 附 在 上 皮 組 織 中 而 且 被 認 為 是 控 制 陰 道 生 態 系 統 得 主 要 因 素 也 是 陰 道 中 的 優 勢 共 生 菌 種 美 國 婦 產 科 期 刊 指 出 乳 酸 菌 更 可 以 降 低 陰 道 炎 復 發 的 機 率 (Miller L.E., et al., 2010), 也 更 確 定 研 究 陰 道 與 共 生 乳 酸 菌 的 防 禦 機 制 的 動 機 本 篇 論 文 之 主 要 實 驗 目 的 就 是 探 討 利 用 乳 酸 菌 所 產 的 乳 酸 H 2 O 2 細 菌 素 以 及 生 物 膜 來 對 抗 陰 道 病 原 菌 的 能 力 分 析 主 要 對 抗 的 致 病 菌 種 有 細 菌 性 陰 道 炎 的 Gardnerella vaginalis ( 陰 道 伽 氏 菌 ) 黴 菌 性 陰 道 炎 的 Candida albicans ( 白 色 念 珠 菌 ) 尿 道 炎 的 Escherichia coli ( 大 腸 桿 菌 ) 等 - 5 -

15 第 二 章 相 關 議 題 探 討 為 了 防 止 感 染 傷 害, 生 殖 系 統 演 化 出 一 套 防 禦 機 制, 這 套 防 禦 機 制 包 含 二 部 份, 一 為 陰 道 的 菌 種 生 態 帄 衡 ; 另 一 則 為 生 殖 道 的 免 疫 反 應 一 直 到 近 年, 人 類 才 開 始 普 遍 得 知 自 己 的 私 密 部 位 具 有 相 當 多 種 類 與 數 量 的 微 生 物, 其 中 有 些 細 菌 是 維 繫 生 殖 系 統 健 康 的 重 要 防 線 (Ocaña V.S. et al., 1999) 生 殖 系 統 裡 與 人 類 陰 道 共 生 的 微 生 物 種 類 超 過 50 種 以 上, 乳 酸 菌 (Lactobacilli) 是 健 康 女 性 陰 道 中 的 優 勢 菌 種 (Sobel J.D. et al., 1996) 因 此 維 持 乳 酸 菌 的 菌 種 生 存 以 及 菌 相 的 帄 衡, 對 預 防 各 種 陰 道 炎 的 感 染 具 有 重 要 的 關 聯 性 而 須 維 持 乳 酸 菌 的 菌 種 生 存, 主 因 有 乳 酸 菌 可 以 與 致 病 菌 彼 此 競 爭 吸 附 陰 道 上 皮 細 胞 的 機 會 也 可 分 泌 乳 酸 (lactic acid) 過 氧 化 氫 (hydrogen peroxide, H 2 O 2 ) 抑 菌 素 (bacteriocins) reuterin 等 抑 菌 物 質 來 抑 制 致 病 菌 的 生 長 所 以 乳 酸 菌 成 為 陰 道 防 禦 機 制 最 重 要 的 一 環 2.1. 陰 道 炎 與 主 要 致 病 菌 種 女 性 生 殖 系 統 包 含 最 外 部 的 陰 戶 陰 道 子 宮 頸 子 宫 及 輸 卵 管, 是 一 連 串 與 外 界 相 連 的 通 道 ( 如 圖 2-1), 又 因 緊 鄰 肛 門, 相 當 容 易 受 到 外 界 致 病 菌 的 入 侵, 一 旦 陰 道 受 到 感 染, 除 了 造 成 分 泌 物 多, 不 良 氣 味 與 騷 癢 等 不 適 症 狀 外, 也 常 會 導 致 相 當 多 的 併 發 症, 包 括 骨 盆 腔 疾 病 - 6 -

16 (Sweet R.L., 2000) 增 加 母 親 與 嬰 兒 死 亡 率 的 異 常 懷 孕 與 分 娩 (McGregor J.A.et al., 2000) 及 較 易 感 染 愛 滋 病 與 性 病 (Sewankambo N. et al., 1997) 正 常 陰 道 流 液 包 含 了 陰 道 上 皮 的 漿 性 滲 出 液 子 宮 頸 腺 體 的 清 澈 潤 滑 黏 液 陰 道 的 複 層 鱗 狀 上 皮 脫 屑 及 其 他 由 子 宮 輸 卵 管 等 分 泌 液 所 形 成, 會 隨 著 排 卵 期 經 期 更 年 期 等 身 體 荷 爾 蒙 的 變 化, 在 分 泌 量 與 形 態 有 所 改 變 正 常 陰 道 分 泌 物 呈 現 無 臭 白 色 稀 薄 粘 稠 物 ph 值 小 於 4.5 而 此 分 泌 物, 正 常 分 泌 量 僅 夠 防 止 陰 道 乾 燥, 而 不 致 於 沾 濕 內 褲 但 若 經 過 空 氣 氧 化, 會 轉 變 成 黃 色 或 棕 色 陰 道 炎 的 診 斷 是 由 陰 道 分 泌 物 ( 俗 稱 白 帶 ) 的 分 泌 量 是 否 增 加 分 泌 物 呈 現 的 型 態 顏 色 氣 味, 以 及 是 否 伴 隨 其 他 症 狀 來 判 定 陰 道 分 泌 物 只 是 女 性 陰 道 炎 的 症 狀 之 ㄧ, 除 了 陰 道 分 泌 物, 其 他 症 狀 包 括 會 陰 部 搔 癢 刺 痛 性 交 疼 痛 下 腹 痛 陰 道 流 血 及 惡 臭 等 一 般 泌 尿 道 感 染, 多 半 是 細 菌 ( 特 別 是 大 腸 桿 菌 ) 由 尿 道 口 逆 行 至 尿 道 及 膀 胱, 並 在 細 胞 壁 上 沾 附 增 生, 造 成 發 炎 的 反 應 ( 表 四 各 種 陰 道 炎 分 泌 物 所 呈 現 特 徵 比 較 表 ) (Sobel J.D., 1997) - 7 -

17 陰 道 炎 之 種 類 1. 黴 菌 性 ( 念 珠 菌 ) 陰 道 炎 陰 道 會 有 乳 酪 狀 排 出 物, 小 便 有 灼 熱 感, 行 房 時 常 有 疼 痛 的 感 覺 據 2002 年 美 國 疾 管 局 估 計, 年 輕 女 性 中, 有 75% 曾 有 黴 菌 感 染 的 經 驗, 其 中 40~45 % 的 女 性 超 過 兩 次,5% 的 人 會 一 再 發 作 (Sobel J.D. et al., 2000), 難 以 根 治 其 實, 黴 菌 常 在 健 康 的 女 性 陰 道 中 出 現 (Drutz, D.J., 1992), 但 是 為 什 麼 有 人 沒 事, 有 的 人 會 有 症 狀 呢? 目 前 還 沒 有 找 到 確 切 的 原 因, 性 交 太 頻 繁, 或 是 黴 菌 潛 藏 在 直 腸 肛 門 的 說 法 都 未 獲 得 證 實, 有 些 狀 況 也 可 能 增 加 黴 菌 感 染 的 機 會, 例 如 懷 孕 控 制 不 佳 的 糖 尿 病 患 正 在 服 用 廣 效 性 抗 生 素 細 胞 毒 性 藥 物 或 含 高 濃 度 雌 激 素 避 孕 藥 的 人, 以 及 免 疫 力 低 下 的 人, 還 有 肥 胖 甲 狀 腺 或 甲 狀 旁 腺 腎 上 腺 功 能 減 退, 或 機 體 內 環 境 發 生 改 變 時 都 容 易 感 染 念 珠 菌 陰 道 炎 念 珠 菌 陰 道 炎 主 要 菌 種 為 Candida albicans, 典 型 症 狀 為 極 度 搔 癢 陰 道 分 泌 物 增 加, 分 泌 物 呈 現 白 色 厚 厚 一 層 附 著 於 陰 道 黏 膜, 像 起 司 (cottage cheese) 一 般 症 狀 包 括 陰 道 壁 紅 腫 會 陰 灼 熱 性 交 或 排 尿 疼 痛 等, 約 占 20-25% 約 有 2/3 婦 女 為 無 症 狀 的 帶 菌 者 從 陰 道 粘 膜 分 離 的 念 珠 菌 有 85%~90% 的 為 白 念 珠 菌 (Ferrer J., 2000.) 白 念 珠 菌 是 致 病 性 最 強 的 念 珠 菌 它 在 婦 女 外 陰 和 陰 道 感 染 率 僅 次 於 細 菌, 而 位 居 第 2 位 (Fabio P. et al., - 8 -

18 2000) 2. 細 菌 性 陰 道 炎 細 菌 性 陰 道 炎 (bacterial vaginosis, BV) 是 最 常 見 陰 道 炎, 是 由 於 細 菌 菌 落 附 著 在 陰 道 上 皮 細 胞 所 造 成 主 要 致 病 菌 是 Gardnerella vaginalis, 正 常 的 陰 道 呈 現 酸 性 (ph<4.5), 主 要 菌 種 為 陰 道 乳 酸 菌 lactobacilli, 乳 酸 菌 會 分 泌 乳 酸 來 維 持 陰 道 酸 性 的 環 境, 達 到 抑 制 細 菌 附 著 的 功 能 但 在 細 菌 性 陰 道 炎 病 人 的 陰 道 中 發 現 原 本 的 乳 酸 菌 種 大 量 減 少, 而 厭 氧 性 細 菌 ( 例 如 Prevotella sp. and Mobiluncus sp. Gardnerella vaginalis Mycoplasma hominisr) 大 量 增 生 (Eschenbach D.A. et al., 1989) 在 懷 孕 期 感 染 細 菌 性 陰 道 炎 容 易 引 發 羊 膜 破 裂, 造 成 早 產 (preterm birth) (Sobel, J. D.,2000) 流 產 (preterm labor) 及 產 後 子 宮 內 膜 炎 (postpartum endometritis) (Nelson D.B. et al., 2009) 所 以 感 染 BV 的 懷 孕 婦 女 必 須 接 受 治 療, 一 方 面 緩 解 疾 病 的 症 狀, 一 方 面 還 能 降 低 因 細 菌 感 染 可 能 引 起 的 併 發 症 及 降 低 其 他 感 染 的 發 生 症 狀 : 病 患 主 要 是 陰 道 分 泌 物 有 惡 臭 類 似 魚 腥 味 顏 色 則 呈 現 白 到 灰 色, 可 以 見 到 陰 道 壁 上 黏 著 一 些 分 泌 物, 比 例 約 占 40-50% (Sobel J.D., 1997) 3. 滴 蟲 陰 道 炎 由 陰 道 滴 蟲 Trichomonas vaginalis 寄 生 造 成, 屬 於 性 病 ( sexually - 9 -

19 transmitted disease, STD) 的 一 種, 一 般 經 由 性 交 傳 染 症 狀 : 感 染 滴 蟲 陰 道 炎 會 造 成 陰 道 分 泌 物 增 加 伴 有 搔 癢 及 灼 熱 感, 陰 道 周 圍 紅 腫 會 有 刺 激 甚 至 性 交 疼 痛, 陰 道 分 泌 物 呈 現 灰 綠 色 泡 沫 狀 且 有 惡 臭, 懷 孕 婦 女 感 染 滴 蟲 陰 道 炎, 可 能 造 成 早 期 破 水 早 產 及 新 生 兒 體 重 過 輕 的 後 遺 症, 約 占 15-20% (Sobel J.D., 1997 Cotch M. F. et al., 1997)) 4. 尿 道 感 染 E. coli 及 S. saprophyticus 是 泌 尿 系 統 感 染 的 主 因, 大 多 因 為 憋 尿 而 造 成 的 尿 道 感 染 症, 而 患 者 又 以 年 輕 女 性 居 多 (Holmes K. K. et al., 1999), 女 性 的 泌 尿 道 感 染 (Urinary tract infections, UTIs) 通 常 是 細 菌 經 由 尿 道 開 口 往 上 而 進 入 膀 胱 造 成 感 染, 而 且 由 於 男 女 性 構 造 上 的 差 異, 女 性 特 別 容 易 經 由 性 交 而 將 病 菌 經 由 陰 道 帶 入 尿 道 引 發 感 染 症 雖 然 大 多 數 患 有 復 發 性 UTIs 的 女 性 其 泌 尿 道 並 無 異 常 現 象, 但 有 些 患 者 一 再 發 作 的 原 因 卻 是 由 於 尿 道 上 皮 細 胞 具 有 較 多 的 E. coli 及 S. saprophyticus 受 體 (Holmes K. K. et al., 1999) 患 者 受 感 染 常 出 現 頻 尿 尿 急 排 尿 困 難 排 尿 疼 痛 或 是 偶 有 背 部 脅 腹 疼 痛 等 症 狀, 嚴 重 的 有 血 尿 膿 尿 等 症 狀 為 何 女 性 較 易 引 起 感 染? 女 性 由 於 生 理 結 構 的 關 係 也 就 是 尿 道 較 短, 所 以 遠 較 男 性 容 易 引 起 感 染, 大 約 有 25% 的 女 性 (Holmes K. K. et al., 1999), 至 少 在 一 生 當 中 會 患 膀 胱 炎 一 次, 不 少 人 重 複 多 次 感 染 典 型 的 泌 尿 道 感 染,

20 通 常 是 由 於 憋 尿 缺 乏 補 充 水 分 或 性 行 為 所 引 起 而 懷 孕 的 婦 女 由 於 生 理 期 構 造 的 變 化, 子 宮 變 大 後 會 壓 迫 到 輸 尿 管, 尿 液 容 易 滯 留, 造 成 細 菌 滋 生 的 機 會, 此 外, 懷 孕 期 間 荷 爾 蒙 的 變 化 也 會 使 得 泌 尿 系 統 變 得 比 較 脆 弱 而 容 易 引 起 感 染 女 性 在 停 經 之 後, 由 於 女 性 荷 爾 蒙 分 泌 減 少, 局 部 的 抵 抗 力 減 退, 使 泌 尿 道 及 陰 道 黏 膜 乾 澀 脆 弱 細 菌 較 容 易 生 長, 並 且 也 會 使 陰 道 及 泌 尿 道 感 染 的 機 率 增 加 陰 道 炎 主 要 致 病 菌 種 1. 大 腸 桿 菌 (Escherichia coli, E. coli) 人 和 動 物 腸 道 中 最 主 要 和 數 量 最 多 的 一 種 細 菌, 主 要 寄 生 於 大 腸 內 是 一 種 兩 端 鈍 圓 能 運 動 無 芽 孢 的 革 蘭 氏 陰 性 短 桿 菌 除 某 些 菌 型 能 引 起 腹 瀉 外, 一 般 不 致 病, 能 合 成 維 生 素 B 和 K (Bentley R. et al., 1982), 對 人 體 有 益 大 腸 菌 群 被 定 義 爲 所 有 好 氧 或 兼 性 好 氧 在 水 淨 化 和 污 水 處 理 領 域, 因 大 腸 桿 菌 在 糞 便 中 數 量 極 多, 故 常 用 為 檢 查 水 源 是 否 被 糞 便 污 染 的 標 誌, 其 測 量 標 準 爲 大 腸 菌 群 指 數 當 細 菌 離 開 腸 道 進 入 泌 尿 道 可 以 導 致 感 染, 由 於 性 交 會 導 致 細 菌 進 入 膀 胱, 有 時 被 稱 作 蜜 月 膀 胱 炎 尿 路 感 染 儘 管 對 女 性 更 爲 普 遍, 但 兩 性 都 可 能 發 生 老 年 中 發 病 男 女 比 例 大 體 相 同 因 爲 細 菌 總 是 通 過 尿 道 進 入 泌 尿 系 統, 廁 所 的 不 衛 生 會 升 高 感 染 機 率,

21 但 其 它 因 素 也 很 重 要 ( 如 女 性 懷 孕, 男 性 前 列 腺 肥 大 ), 還 有 一 些 原 因 不 明 2. 陰 道 伽 氏 桿 菌 (Gardnerella vaginalis) 型 態 為 桿 狀 或 球 桿 狀, 大 小 約 半 徑 0.5μm 長 度 1.5~2.5μm; 不 產 生 纖 維 狀 組 織 莢 膜 及 內 孢 子 ; 細 胞 壁 含 丙 胺 酸 氨 基 乙 酸 組 胺 酸 賴 胺 酸 甲 硫 胺 酸 比 克 胺 酸 絲 胺 酸 色 胺 酸 ; 為 厭 氧 菌, 生 長 在 人 類 生 殖 及 泌 尿 系 統, 分 布 於 全 球,pH6.0~6.5 為 最 佳 生 長 狀 態 ; 最 佳 適 合 溫 度 攝 氏 35~37 度, 症 狀 會 使 陰 道 分 泌 物 呈 稀 薄 狀 顏 色 為 灰 色 到 白 色 有 強 烈 的 魚 腥 味, 有 時 會 有 肚 子 痛 的 症 狀 陰 道 伽 氏 桿 菌 為 20~40% 健 康 婦 女 陰 道 中 之 正 常 菌 群, 而 在 細 菌 性 陰 道 炎 或 稱 非 專 一 性 陰 道 炎 之 婦 女, 此 菌 與 各 種 絕 對 厭 氧 菌 ( 包 括 Bacteroides spp., Mobiluncus 及 Peptostreptococcus spp.) 之 數 目 會 顯 著 增 加, 正 常 菌 群 的 乳 酸 菌 會 減 少, 然 而 此 菌 之 致 病 性 角 色 仍 不 十 分 清 楚 此 菌 可 引 起 產 後 (postpartum) 敗 血 症 子 宮 內 膜 炎 (endometritis) 及 陰 道 膿 瘍 (abscess) (Imlay J.A.,2002) 3. 白 色 念 珠 菌 (Candida albicans) 念 珠 菌 是 一 種 黴 菌, 屬 酵 母 菌 目 (Saccharomycetales), 主 要 以 單 細 胞 (unicellular) 酵 母 菌 (yeast;blastospore) 型 式 存 在 的 革 蘭 氏 陽 性 黴 菌,

22 大 小 為 4~6 mm, 以 發 芽 (budding) 方 式 生 殖 還 有 具 酵 母 型 或 假 菌 絲 型 雙 相, 是 一 種 雙 相 型 酵 母 菌, 常 表 現 爲 酵 母 細 胞 型, 酵 母 型 為 圓 形 或 橢 圓 形, 可 產 生 芽 生 分 生 孢 子 念 珠 菌 是 人 體 常 駐 菌 之 一, 在 正 常 人 體 的 皮 膚 和 咽 喉 口 腔 陰 道 外 陰 的 粘 膜 上, 均 可 分 離 出 念 珠 菌, 亦 可 見 於 其 他 臟 器 中 念 珠 菌 它 在 人 體 內 不 發 生 症 狀 時, 侵 犯 組 織 出 現 症 狀 時, 則 常 表 現 為 菌 絲 型 症 狀 為 分 泌 物 量 多, 典 型 的 白 帶 是 灰 白 色, 乾 黏 似 乾 酪 的 斑 片, 黏 著 在 陰 道 壁 上 酵 母 菌 感 染 大 部 分 是 白 色 念 珠 菌 所 引 起, 一 般 婦 女 4~6%(Anukam K.C. et al., 2004 Foxman B. et al., 1990), 懷 孕 婦 女 15~20%(Sobel, J. D.,2000) 會 發 生 感 染 症 狀 主 要 為 外 陰 及 陰 道 嚴 重 搔 癢 引 起 外 陰 疼 痛, 外 陰 有 紅 斑 發 疹, 也 會 有 水 腫 或 裂 紋 引 起 酵 母 菌 感 染 的 因 素 很 多 懷 孕 時 除 了 增 加 陰 道 內 肝 糖 含 量 外, 並 抑 制 細 胞 性 免 疫, 都 會 助 長 黴 菌 生 長 另 外, 血 糖 高 也 有 助 黴 菌 生 長 使 用 抗 生 素 抑 制 細 菌, 也 會 使 黴 菌 反 而 過 度 生 長 (Drutz, D.J., 1992) 4. 陰 道 滴 蟲 (Trichomonas vaginalis) 有 五 支 鞭 毛 可 動 的 原 生 蟲 Microaerophilic 梨 狀 7~10 mm, 可 吞 噬 細 菌 紅 血 球, 可 利 用 各 種 carbohydrate ( 炭 水 化 合 物 ), 以 二 分 法 分 裂 (binary fission), 以 細 胞 內 特 殊 的 小 器 官 hydrogenosomes

23 產 生 能 源 (World Health Organization., 1995) 症 狀 分 泌 物 會 呈 現 膿 性 泡 沫 狀 白 帶, 顏 色 偏 黃 綠 色, 同 時 味 道 難 聞 陰 道 滴 蟲 多 經 性 交 傳 染, 偶 爾 會 因 浴 巾 沖 洗 管 嘴 感 染 白 帶 患 者 中 十 分 之 ㄧ 為 這 種 白 帶 蟲 引 起, 一 半 淋 病 患 者 也 會 合 併 此 病 感 染 的 婦 女 只 有 一 半 出 現 症 狀, 主 訴 為 大 量 惡 臭 白 帶, 小 便 困 難, 外 陰 搔 癢, 且 陰 道 有 充 脹 感, 月 經 期 或 剛 過 後 才 出 現 症 狀, 懷 孕 時 呈 急 性 化 部 份 感 染 呈 慢 性 帶 菌 而 無 症 狀 (Cameron D. W. et al., 1990 Cotch M. F. et al., 1997) 2.2. 乳 酸 菌 1. 乳 酸 菌 是 指 能 夠 代 謝 糖 類 產 生 50% 以 上 乳 酸 之 細 菌, 具 有 這 些 功 能 的 細 菌 包 括 了 : 乳 酸 桿 菌 (Lactobacillus) 鏈 球 菌 (Streptococcus) 明 串 球 菌 (Leuconostoc) 等 但 乳 酸 菌 為 習 慣 用 語, 並 不 是 分 類 學 上 正 式 用 語 我 們 經 常 講 的 雙 歧 桿 菌 或 比 菲 德 菌 會 產 生 乳 酸 及 醋 酸, 但 乳 酸 不 到 50%, 所 以 嚴 格 說 來 不 應 稱 為 乳 酸 菌 但 若 由 保 健 營 養 觀 點 而 言, 雙 歧 桿 菌 同 樣 具 有 安 全 健 康 等 乳 酸 菌 所 標 榜 之 形 象, 將 之 納 入 乳 酸 菌 家 族 亦 是 理 所 當 然 人 類 飲 用 醱 酵 乳 品 歷 史 非 常 悠 久, 所 以 乳 酸 菌 一 直 被 認 為 是 非 常 安 全 的 菌 種 (GRAS,generally regarded as safe), 是 最 具 代 表 性 的 腸 內 有 益 菌 屬

24 於 球 菌 型 的 乳 酸 菌 屬 包 括 鏈 球 菌 (Streptococcus) 乳 酸 鏈 球 菌 (Lactococcus) 小 球 菌 (Pediococcus) 明 串 球 菌 (Leuconostoc) 腸 球 菌 屬 (Enterococcus); 桿 菌 包 括 乳 酸 桿 菌 (Lactobacillus) 雙 歧 桿 菌 (Bifidobacterium) 等 菌 屬 (Klaenhammer T.R.,1988 Salminen S. et al., 1998) 乳 酸 菌 普 遍 存 在 於 人 類 生 活 環 境 的 四 周, 長 久 以 來 與 人 類 食 品 息 息 相 關, 經 常 被 使 用 於 發 酵 食 品 的 製 造, 包 括 蔬 菜 穀 類 魚 肉 類 與 乳 品 類 等 原 料 的 發 酵, 因 此 乳 酸 菌 是 食 品 工 業 上 很 重 要 的 一 群 微 生 物 而 其 中 乳 酸 發 酵 乳 品 即 是 利 用 乳 酸 菌 將 乳 品 中 的 醣 類 轉 變 為 含 乳 酸 的 產 品, 這 些 產 品 如 乾 酪 (cheese) 乳 酪 發 酵 乳 乳 酸 飲 料 等, 基 本 上 這 類 產 品 必 須 含 有 一 定 數 量 以 上 的 活 性 乳 酸 菌, 因 此 食 用 時 可 以 攝 取 到 豐 富 的 營 養 和 享 受 其 特 殊 的 風 味 除 了 增 進 食 品 的 營 養 價 值 外, 乳 酸 菌 對 人 類 的 健 康 上 亦 有 所 貢 獻, 如 可 以 抑 制 腸 道 內 病 原 菌 的 生 長 及 維 持 腸 道 菌 群 帄 衡 改 善 乳 糖 不 耐 症 的 代 謝 障 礙 和 提 高 乳 糖 的 利 用 率 (Kaur I. P. et al., 2002), 如 今 已 有 部 分 科 學 家 認 為 乳 酸 菌 含 有 抗 腫 瘤 與 降 低 膽 固 醇 (Adolfsson O. et al., 2004 Galdeano C.M. et al., 2007) 及 刺 激 活 化 免 疫 系 統 等 醫 療 效 果 甚 至 近 年 來 更 是 發 現 乳 酸 菌 有 改 善 陰 道 炎 的 相 關 性

25 乳 酸 菌 基 本 特 性 乳 酸 菌 (Lactic acid bacteria), 廣 義 而 言 是 指 一 群 可 利 用 碳 水 化 合 物 進 行 發 酵 而 產 生 多 量 乳 酸 的 細 菌 之 總 稱, 通 常 具 有 下 列 共 同 特 性 : 一 為 革 蘭 氏 陽 性 菌, 通 常 無 運 動 性 不 產 生 孢 子 二 營 養 需 求 十 分 複 雜, 須 有 碳 水 化 合 物 氨 基 酸 維 生 素 核 酸 衍 生 物 以 及 多 種 生 長 素 等 養 分 才 能 夠 支 持 其 生 長 三 通 常 缺 乏 過 氧 化 氫 酶 活 性 與 細 胞 色 素 (cytochrome) ( 廖,1998) 乳 酸 菌 在 自 然 界 中 廣 泛 地 存 在, 其 存 在 環 境 通 常 含 有 豐 富 的 可 溶 性 碳 化 合 物 蛋 白 質 分 解 產 物 與 維 生 素, 且 環 境 中 溶 氧 低 ( 廖,1998), 因 此 廣 泛 存 在 於 大 自 然 中 的 蔬 菜 穀 類 牛 乳 或 乳 製 品 及 肉 品 等 許 多 發 酵 產 品 ( 如 : 發 酵 肉 製 品 魚 肉 香 腸 泡 菜 發 酵 豆 腐 ) 中 被 當 作 發 酵 種 菌 使 用 以 及 人 或 動 物 的 腸 道 或 黏 膜 等 環 境 中 都 可 以 很 普 遍 地 發 現 它 們 的 存 在 乳 酸 菌 在 發 酵 過 程 中 會 產 生 乳 酸 醋 酸 二 氧 化 碳 (CO 2 ) 過 氧 化 氫 (H 2 O 2 ) 細 菌 素 洛 德 因 (reuterin) 及 雙 乙 醯 (diacetyl) 等, 均 可 以 抑 制 一 些 污 染 菌 或 是 病 原 菌 的 生 長 (Choi H. J. et al., 2002 Liang H. F. et al., 2003 Messens W. et al., 2002 Sarantinopoulos P. et al., 2002 Tomás M.S. et al., 2002) 乳 酸 菌 代 謝 糖 質 而 行 乳 酸 發 酵, 其 發 酵 型 式 可

26 大 致 分 為 同 質 乳 酸 發 酵 (homolactic fermentation) 及 異 質 乳 酸 發 酵 (heterolactic fermentation) 前 者 經 醣 解 作 用 使 碳 水 化 合 物 分 解 為 丙 酮 酸 後, 直 接 還 原 成 約 90~100% 的 乳 酸, 而 後 者 除 了 經 醣 解 作 用 外, 亦 可 經 由 phosphoketolase 作 用, 產 生 乙 醇 及 二 氧 化 碳 等 其 他 化 合 物 同 質 發 酵 反 應 如 ( 式 一 ) 所 示, 乳 酸 為 其 葡 萄 糖 代 謝 的 唯 一 產 物, 例 如 Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus 等 菌 屬 之 異 質 乳 酸 發 酵 反 應 如 ( 式 二 ) 或 ( 式 三 ) 所 示, 例 如 Lactobacillus brevis,leuconostoc mesenteroids 等, 可 代 謝 葡 萄 糖 生 成 乳 酸 乙 醇 及 二 氧 化 碳 雙 歧 桿 菌 則 可 將 2 莫 耳 的 葡 萄 糖 轉 化 為 2 莫 耳 乳 酸 與 3 莫 耳 醋 酸, 反 應 如 ( 式 三 ) 所 示 C 6 H 12 O 6 2CH 3 CHOHCOOH 葡 萄 糖 乳 酸 ( 式 一 ) C 6 H 12 O 6 CH 3 CHOHCOOH + C 2 H 5 OH + CO 2 葡 萄 糖 乳 酸 乙 醇 二 氧 化 碳 ( 式 二 ) 2 C 6 H 12 O 6 2 CH 3 CHOHCOOH + 3 CH 3 COOH 葡 萄 糖 乳 酸 醋 酸 ( 式 三 )

27 各 乳 酸 菌 屬 主 要 特 性 簡 述 1. 鏈 球 菌 屬 (Streptococcus) 屬 於 Lactobacillaceae, 含 19 種 菌 種, 為 球 狀 或 卵 狀, 微 好 氣 性 屬 於 同 質 發 酵,S. lactis 為 酸 乳 及 乾 酪 之 主 要 菌 種, 但 有 些 於 人 體 可 致 病 ( 如 : 人 體 的 上 呼 吸 道 疾 病 ), 可 存 在 於 腸 道 植 物 與 乳 品 中 多 為 中 溫 性 有 些 可 於 低 溫 下 生 長 本 屬 中 在 優 酪 乳 扮 演 重 要 角 色 的 是 Str. thermophilus, 也 是 本 屬 中 唯 一 可 用 在 食 品 中 的 菌 種 此 屬 尚 包 括 了 病 原 菌, 如 Str. agalactiae Str. pneumoniae 及 Str. pyogenes Mathot (A.G. et al., 2003 Stiles M.E. et al., 1997), 其 他 的 菌 種 包 括 Str. Macedonicus (Georgalaki M.D. et al., 2002) 及 Str. bovis (Lee S.S. et al., 2002) 等 ; 此 外, Str. sanguis 與 Str. mutans 則 是 牙 斑 上 造 成 蛀 牙 的 細 菌 (Kawashima M. et al., 2003) 2. 乳 酸 鏈 球 菌 屬 (Lactococcus) 型 態 多 呈 卵 型 或 球 型, 以 單 一 成 對 或 鏈 狀 出 現, 因 鏈 狀 常 延 伸 很 長, 故 有 時 會 誤 判 為 lactobacilli 可 進 行 同 質 發 酵, 最 適 生 長 溫 度 為 30 C, 可 生 長 於 10 C 至 45 C 的 溫 度 中, 在 含 鹽 量 6.5% 以 上 或 ph 值 為 9.6 的 培 養 液 中 無 法 生 長 (Mundt J.O., 1986) 可 分 為 兩 菌 種 即 Lac. lactis 和 Lac. raffinolactis Lac. lactis 又 可 細 分 為 兩 個 亞 種 即 Lac. lactis subsp

28 cremoris 和 Lac. lactis subsp. lactis, 前 者 於 40 C 及 ph 為 9.2 時 不 能 生 長, 且 無 法 利 用 arginine 產 生 ammonia (Harrigan W.F. et al., 1976), 後 者 中 的 一 些 菌 株 可 產 生 廣 效 性 細 菌 素 nisin 及 lacticins 等 (Barakat R.K. et al., 2000 Delves-Broughton J., 1990 O'Sullivan L. et al., 2002 Scannell A.G. et al., 2001 Schleifer K.H. et al., 1987) Lac. lactis 為 乳 製 品 工 業 製 造 上 重 要 的 菌 酛, 本 屬 菌 種 一 般 可 以 發 揮 良 好 的 發 酵 產 酸 及 風 味 成 分, 如 雙 乙 醯 等 (Klaenhammer T. et al., 2002 Sørensen K.I. et al., 2000 Stiles M.E. et al.,1997) 3. 小 球 菌 屬 (Pediococcus) 為 乳 酸 四 連 球 菌, 細 胞 具 有 特 殊 的 型 態, 會 形 成 四 球 狀 並 從 兩 個 帄 面 分 裂, 屬 於 同 質 發 酵 型 之 乳 酸 菌 屬 (Nettles C.G. et al., 1993) 此 菌 屬 包 含 9 種 菌 種, 其 中 Ped. pentosaceus 又 可 分 為 亞 種 Ped. pentosaceus subsp. intermedius 此 菌 株 所 產 生 之 細 菌 素 pediocin 可 有 效 抑 制 其 他 雜 菌 之 生 長 廣 泛 作 為 發 酵 蔬 菜 乳 酪 肉 製 品 或 香 腸 產 品 之 發 酵 種 菌, 進 而 延 長 製 品 之 保 存 期 限 (Spelaung S.R. et al., 1989 Motlagh A.M. et al., 1992 殷,1996) 本 屬 也 會 造 成 啤 酒 的 腐 敗 ; 例 如 Ped. claussenii sp. nov. 是 造 成 啤 酒 腐 壞 的 媒 介,Ped. damnosus 會 使 啤 酒 產 生 苦 味, 而 Ped. cerevisiae 會 在 啤 酒 中 產 生 黏 膜 (Dobson C.M. et al., 2002), 這 些 都 是 造

29 成 啤 酒 在 發 酵 中 產 生 臭 味 的 主 要 菌 種 4. 明 串 球 菌 屬 (Leuconostoc) 為 鏈 球 菌 科 中 之 一 菌 屬, 型 態 為 球 菌, 菌 體 為 成 對 或 鏈 狀, 營 養 要 求 較 其 他 乳 酸 菌 更 為 嚴 苛 屬 於 異 質 發 酵 之 乳 酸 菌 屬 (Garvie E.I., 1986) 最 適 生 長 溫 度 為 20~30 C 此 菌 屬 包 含 6 種 菌 種 Leuconostoc 外 形 會 隨 著 培 養 基 之 不 同 而 可 能 呈 現 球 狀 或 短 桿 形, 此 外 觀 差 異 在 電 子 顯 微 鏡 下 方 可 觀 察 到 其 在 蔬 菜 中 的 乳 酸 菌 中 是 佔 優 勢 的 菌 種, 為 天 然 存 在, 因 此 在 酸 泡 菜 中 為 重 要 之 菌 株 (Fremaux C. et al., 1995 Klaenhammer T. et al., 2002 Stiles M.E. et al., 1997) 其 中 的 Leu.mesenteroides Leu. paramesenteroides Leu. lactis 及 Leu. dextranicum 常 出 現 在 秣 草 中, 而 在 阿 根 廷 西 北 方 所 生 產 的 牛 乳 及 乳 酪 中, 可 分 離 到 本 屬 菌 種 (Ennahar S. et al., 2003 Medina R. et al., 2001) 本 屬 的 Leu. carnosum 可 以 在 真 空 包 裝 的 肉 製 品 中 做 為 保 護 用 菌 種, 而 從 韓 國 泡 菜 中 所 離 的 菌 種 命 名 為 Leu. kimchii sp. nov.(budde B.B. et al., 2003 Kim J. et al., 2000b Osmanağaoğlu Ő., 2003) 5. 乳 酸 桿 菌 屬 (Lactobacillus) 為 屬 於 Lactobacillaceae, 含 15 種 菌 種, 因 菌 種 不 同 可 為 同 質 發 酵 性 或 異 質 發 酵 性 依 生 理 代 謝 時 fructose-1.6-diphosphate 及

30 phosphoketolase 的 存 在 與 否 而 分 為 三 個 分 群, 其 中 group I group II 及 少 數 的 group III 可 用 在 發 酵 食 品 中, 大 部 分 的 group III 屬 於 和 食 品 具 有 相 關 性 的 食 品 腐 敗 菌 (Annuk H. et al., 2003 Jay J.M., 2000 Stiles M.E. et al.,1997) 三 個 分 群 如 下 : (1) group I: 絕 對 同 型 發 酵 (obligately homofermentative) 乳 酸 菌 ; 例 如 Lb. bulgaricus Lb. acidophilus 及 Lb. delbrueckii 等, 屬 於 不 發 酵 戊 糖 (pentoses) 的 乳 酸 菌 種 (Harp E. et al., 2003 Tharmaraj N. et al., 2003 Ulrich R.L. et al., 2001) (2) group II: 兼 性 異 型 發 酵 (facultative heterofermentative), 乳 酸 菌 ; 例 如 Lb. plantarum Lb. casei 在 30 C 時, 可 產 生 1.5% 的 乳 酸 (Jay J. M., 2000), 此 外 屬 於 group II 的 還 有 Lb.coryniformis Lb. curvatus 及 Lb. farciminis 等 (Tichaczek P. S. et al., 1993 Van Reenen C. A. et al., 1998 Vigolo G. et al., 1996), 其 中 Lb. plantarum 為 發 酵 肉 品 牧 草 及 蔬 菜 製 品 中 的 重 要 菌 種 (Leal-Sánchez M.V. et al., 2002 Maldonado A. et al., 2002) (3) group III: 絕 對 異 型 發 酵 (obligately heterofermentative) 乳 酸 菌 ; 例 如 Lb. brevis Lb. buchneri Lb. bifermentans Lb. fermentum Lb. cellobiosus 及 Lb. viridescens 等 (Jay J.M., 2000 Stiles M.E. et

31 al.,1997) 本 屬 菌 種 為 長 桿 菌, 顯 微 鏡 下 常 見 呈 長 鏈 狀 多 數 是 微 好 氣 或 厭 氣 菌 生 長 溫 度 範 圍 在 2~53 C, 最 適 生 長 溫 度 為 25~35 C, 通 常 存 在 於 水 中 廣 存 植 物 體 及 乳 製 品 中, 也 常 在 醃 燻 及 加 工 肉 製 品 中 發 現 有 些 可 用 為 發 酵 乳 之 製 造, 如 酸 乳 及 保 加 利 亞 乳, 有 些 則 用 為 乾 酪 之 製 造 6. 雙 歧 桿 菌 屬 (Bifidobacterium) 此 菌 屬 至 少 含 有 25 種 菌, 先 後 被 命 名 為 Bacillus bifidus Lactobacillus bifidus 及 Bifidobacterium bidifum 目 前 分 類 上 屬 於 放 射 菌 科 (Actinomyceetaceae) 中 的 雙 歧 桿 菌 屬 (Bifidobacterium) 本 屬 為 絕 對 厭 氧 菌, 型 態 和 其 他 的 乳 酸 菌 不 同 型 態 通 常 呈 現 Y 字 型, 尾 端 為 棍 棒 狀, 為 人 體 腸 胃 道 中 正 常 的 菌 叢 本 屬 在 分 類 上 多 有 爭 議 的 原 因 之 一 乃 是 因 其 乳 酸 的 產 量 較 醋 酸 少, 二 者 的 的 產 量 比 為 2:3; 但 因 其 為 人 體 腸 胃 道 中 的 正 常 菌 群, 除 產 生 乳 酸 之 外, 多 數 特 性 與 乳 酸 菌 相 似, 故 一 般 仍 將 其 歸 類 在 乳 酸 菌 中 (Tharmaraj N. et al., 2003) 此 菌 可 用 於 牛 乳 優 酪 乳 及 其 他 食 品 之 發 酵, 有 些 則 被 認 為 可 促 進 人 體 健 康 7. 腸 球 菌 屬 (Enterococcus) 此 屬 呈 鏈 狀 之 球 菌, 常 存 於 人 體 之 腸 道 中, 故 為 污 染 指 標 菌 之 一 除 Ent. cecorum 外, 其 餘 本 屬 的 菌 種 均 可 在 10 C 以 下 生 長, 而 有 些 Ent

32 faecalis 及 Ent. faecium 甚 至 可 以 在 0~6 C 之 間 生 長, 此 屬 與 其 他 兼 性 厭 氧 球 菌 不 同 之 處 在 於 其 有 至 少 14 個 菌 種 均 可 於 6.5% (w/v) 的 NaCl 及 ph 9.6 的 環 境 下 生 長 (Park S.H. et al., 2003a) 除 了 Ent. faecalis 之 外, 主 要 的 菌 種 還 包 括 了 Ent. faecium 及 Ent. durans Ent. faecium 為 健 康 豬 隻 小 腸 盲 腸 及 直 腸 中 的 正 常 菌 叢, 也 可 以 從 陰 道 中 分 離 到 此 菌, 在 糞 便 肥 料 的 儲 朝 槽 中 也 能 存 在 所 有 的 菌 種 均 可 分 解 fesculin (Al Jassim R. A., 2003 Cotta M.A et al., 2003 Jay J. M., 2000) 乳 酸 菌 在 人 體 的 生 理 活 性 1. 改 善 乳 糖 不 耐 症 當 人 體 缺 乏 乳 糖 水 解 酵 素 (lactase) 的 時 候, 會 因 為 無 法 代 謝 乳 糖 故 在 飲 用 牛 乳 後 會 有 腹 瀉 的 現 象 產 生 乳 酸 菌 擁 有 lactose 分 解 酵 素 (lactase), 能 將 乳 糖 代 謝 成 乳 酸 使 小 腸 消 化 吸 收, 使 β-galactosiddase 缺 乏 症 的 患 者 或 因 腸 胃 炎 等 腸 疾 導 致 的 lactase 活 性 不 足 者 可 以 減 緩 許 多 不 適 同 時 乳 蛋 白 在 腸 道 中 引 起 的 過 敏 反 應 也 會 因 為 乳 酸 菌 的 蛋 白 水 解 酵 素 而 降 解 而 減 緩 (Mustapha A. et al., 1997) 2. 降 低 膽 固 醇 吸 收 乳 酸 菌 影 響 膽 固 醇 的 吸 收 機 制 並 未 清 楚, 推 測 是 醱 酵 乳 當 中 的 成 分 3-hydroxy-3-methyl glutaric acid (HMG) 會 抑 制 膽 固 醇 合 成 中 決 定 合 成

33 速 率 之 酵 素 HMG CoA reductase 之 作 用, 使 血 清 中 之 膽 固 醇 降 低 ( 廖, 1998) 更 有 學 者 發 現 在 體 外 試 驗 時, 培 養 於 含 0.1%~0.5% 膽 鹽 培 養 基 中 的 B. breve, 在 越 高 膽 鹽 濃 度 的 的 培 養 基 中, 菌 株 降 低 膽 固 醇 的 能 力 亦 越 強 因 此 證 明, 在 乳 酸 菌 可 以 耐 受 的 膽 鹽 濃 度 範 圍 內, 乳 酸 菌 降 低 膽 固 醇 的 能 力 和 環 境 中 膽 鹽 的 量 成 正 相 關, 當 培 養 基 中 膽 鹽 的 含 量 增 加, 乳 酸 菌 降 低 膽 固 醇 的 能 力 也 就 越 強 3. 抑 制 腸 道 病 菌 生 長 除 幫 助 消 化 外, 乳 酸 菌 利 用 本 身 的 代 謝 物 達 到 抑 制 其 他 病 菌 的 生 長 乳 酸 菌 本 身 即 帶 有 抑 菌 力 (Hernandez D. et al., 2005) 或 是 代 謝 醣 類 產 生 的 乳 酸 具 有 抑 制 病 原 菌 的 功 效 (Rossland E. et al., 2005), 它 能 導 致 細 胞 質 酸 化 促 使 病 菌 細 胞 死 亡 乳 酸 菌 亦 會 分 泌 具 有 抑 菌 功 能 的 蛋 白 質 例 如 bacteriocin bavaricin A enterococcin A 等 (Ocana V.S. et al., 2004 Pantev A. et al., 2003) 另 外 有 部 分 Lactobacillus 可 分 泌 生 物 界 面 活 性 劑 (biosurfactants), 去 競 爭 營 養 源 與 上 皮 細 胞 吸 附 性 (Ouwehand A.C. et al., 2000) 而 抑 制 病 原 菌 之 吸 附 及 防 止 泌 尿 道 病 原 菌 作 用 (Velraeds M.C. et al., 1996) 4. 調 節 免 疫 力 已 有 臨 床 實 驗 證 明, 服 用 乳 酸 菌 之 後 能 促 進 血 漿 以 及 腸 黏 膜 免 疫 系

34 統 產 生 抗 體, 同 時 乳 酸 菌 細 胞 壁 含 有 某 些 成 分 如 脂 多 醣 (lipopolysaccharide,lps) 與 peptidoglycan 可 刺 激 活 化 巨 噬 細 胞 (phagocyte) 及 淋 巴 細 胞 (lymphocyte) 再 經 細 胞 訊 號 傳 遞, 促 使 細 胞 產 生 細 胞 激 素 (cytokines) 和 提 升 IgA 濃 度 並 促 使 INF-γ 或 TNF-α 被 分 泌, 使 得 腫 瘤 細 胞 被 抑 制 ( 廖,1998) 5. 減 緩 高 血 壓 症 狀 研 究 指 出 飲 用 乳 酸 菌 醱 酵 可 以 適 度 控 制 慢 性 高 血 壓 患 者 血 壓 情 形 (Seppo L. et al., 2003) 並 指 出 可 以 從 醱 酵 物 當 中 分 離 出 VPP 與 LPP 兩 種 小 分 子 胜 肽 鏈 (tripeptide) 會 抑 制 血 管 收 縮 素 轉 化 酵 素 (angiotensin converting enzyme, ACE), 進 而 達 到 降 低 血 壓 的 功 效 (Vercruysse L. et al.,2005) 6. 解 決 女 性 私 密 處 困 擾 陰 道 上 皮 細 胞 富 含 肝 糖, 可 由 乳 酸 桿 菌 代 謝 成 乳 酸 使 陰 道 維 持 酸 性 環 境, 抑 制 致 病 菌 的 生 長, 因 此 正 常 陰 道 存 在 著 多 種 菌 落, 隨 著 月 經 週 期 彼 此 維 持 著 微 妙 的 動 態 帄 衡, 其 中 可 以 產 生 H 2 O 2 ( 過 氧 化 氫 ) 的 乳 酸 桿 菌 是 最 主 要 的 菌 落,H 2 O 2 可 以 抑 制 厭 氧 菌 和 其 它 致 病 菌 生 長 細 菌 性 陰 道 炎 的 病 人 其 乳 酸 桿 菌 數 量 減 少, 甚 至 這 些 乳 酸 桿 菌 不 製 造 H 2 O 2, 於 是 陰 道 內 菌 落 失 去 帄 衡,Gardnerella vaginalis 與 厭 氧 菌 的 數 量 可 增 加 至

35 正 常 量 的 10~1000 倍 (Eschenbach D.A. et al., 1989), 厭 氧 菌 代 謝 產 生 大 量 amines( 胺 ), 不 但 產 生 魚 腥 味 更 使 陰 道 ph 值 上 升, 陰 道 上 皮 細 胞 脫 落, 形 成 分 泌 物, 惡 性 循 環 結 果,pH 上 升 (5.0~6.0), 乳 酸 桿 菌 變 少, Gardnerella vaginalis 變 多, 厭 氧 菌 形 成 因 此, 細 菌 性 陰 道 炎 是 由 陰 道 內 正 常 存 在 的 菌 落 產 生 不 帄 衡 所 導 致 (Nelson D.B. et al., 2009) 乳 酸 菌 抑 菌 機 制 細 菌 間 的 競 爭 作 用 為 空 間 及 養 分 的 不 足, 當 面 臨 惡 劣 環 境 時, 為 了 提 高 自 己 活 存 的 競 爭 力, 而 發 展 出 一 套 特 殊 的 適 應 模 式, 就 是 分 泌 出 對 特 定 對 象 具 有 抑 菌 活 性 之 物 質 例 如 酸 過 氧 化 氫 二 氧 化 碳 抗 菌 蛋 白 質 與 胜 肽 reuterin 及 雙 乙 醯 等, 停 止 對 方 的 生 長, 進 而 提 高 自 己 的 勢 力 乳 酸 菌 抑 菌 主 要 分 為 物 理 性 及 化 學 性 兩 方 面 1. 物 理 性 抑 菌 方 面 (1) 競 爭 所 需 的 營 養 成 分 : 有 益 微 生 物 與 病 原 菌 共 同 競 爭 營 養 成 分, 碳 氮 源 或 礦 物 質, 使 病 原 菌 無 法 獲 得 養 分 進 行 增 值 (2) 競 爭 附 著 位 置 : 微 生 物 對 腸 道 須 具 吸 附 能 力, 才 可 避 免 因 常 到 蠕 動 而 被 排 出 體 外

36 可 與 其 他 病 原 菌 競 爭 腸 道 結 合 位 置, 進 而 將 之 排 除 (3) 聚 集 (accumulation) 作 用 : 有 益 微 生 物 對 病 原 菌 產 生 凝 聚, 防 止 病 原 菌 與 腸 道 細 胞 結 合, 使 病 原 菌 排 出 體 外 2. 化 學 性 抑 菌 方 面 (1) 有 機 酸 的 產 生 與 ph 值 的 降 低 : 乳 酸 菌 發 酵 後 會 產 生 乳 酸 醋 酸 等 有 機 酸, 這 些 弱 酸 的 蓄 積 會 導 致 ph 值 下 降 到 微 生 物 無 法 生 長 的 範 圍 (Ita P.S. et al., 1991 Vandenbergh P.A. et al., 1993), 但 ph 值 下 降 並 不 是 抑 制 細 菌 生 長 的 主 因, 另 外 可 以 抑 制 微 生 物 生 長 的 原 因 可 能 是 由 乳 酸 菌 所 產 生 的 酸 未 完 全 解 離 以 乳 酸 (lactic acid) 而 言, 在 ph 值 5.0 時, 其 pka 值 為 3.86 這 些 只 有 部 份 解 離 的 酸, 多 在 細 菌 的 細 胞 外 以 不 帶 電 荷 的 分 子 型 式 存 在, 由 於 不 帶 電 荷, 分 子 較 小, 故 有 機 會 透 過 細 胞 膜 進 入 細 胞 中 這 些 未 解 離 的 酸 進 入 細 胞 內 後 進 行 解 離 反 應 並 且 酸 化 細 胞 內 部, 阻 礙 胺 基 酸 代 謝 DNA 合 成 能 量 代 謝 以 及 引 起 細 胞 膜 滲 透 率 的 改 變, 來 達 到 抗 菌 的 效 果,(Ita P.S. et al.,1991 Jay J.M., 2000), 有 機 酸 未 解 離 部 分 濃 度 越 高, 抑 制 微 生 物 的 生 長 效 果 也 越 顯 著, 而 未 解 離 部 分 的 形 成 量 多 寡 則 依 ph 值 而 定 (Ercolani G.L., 1976)( 如 圖 2-2)

37 (2) 過 氧 化 氫 (H 2 O 2 ) 的 累 積 : 乳 酸 菌 在 有 氧 環 境 下 透 過 本 身 的 黃 素 蛋 白 氧 化 酶 (flavoprotein oxidase) 或 NADH 氧 化 酶 (NADH oxidase) 作 用, 會 將 氧 分 子 轉 變 為 過 氧 化 氫 ( 如 圖 2-3), 但 因 乳 酸 菌 本 身 缺 乏 過 氧 化 氫 分 解 酵 素, 使 得 乳 酸 菌 本 身 對 過 氧 化 氫 具 有 耐 性, 於 是 過 氧 化 氫 會 蓄 積 於 環 境 過 氧 化 氫 具 有 強 烈 的 氧 化 性, 可 破 壞 細 胞 蛋 白 質 的 基 本 結 構, 因 而 能 對 其 他 細 菌 產 生 抑 制 作 用 ( 陳,1991) 例 如 L. lactis 最 低 抑 制 濃 度 為 125mg/mL,S. aureus 僅 為 5mg/mL, 因 此 可 以 有 效 防 止 雜 菌 的 生 長 (Daeschel M.A., 1989) 另 外 可 刺 激 牛 乳 中 的 天 然 的 抗 菌 系 統 乳 過 氧 化 酶 系 統 (lactoperoxidase system, LPS) 的 反 應 乳 過 氧 化 酶 系 統 係 由 乳 過 氧 化 酵 素 (lactoperoxidase, LP) 過 氧 化 氫 以 及 及 硫 氰 酸 鹽 (thiocyanate, SCN-) 三 者 所 組 成 當 三 者 以 適 當 濃 度 同 時 存 在 時, 即 會 產 生 次 硫 氰 酸 鹽 (hypothiocyanite;oscn-), 次 硫 氰 酸 鹽 的 產 生 可 以 抑 制 或 殺 死 細 菌 (Annuk H. et al., 2003) 此 外, 以 高 壓 處 理 合 併 乳 過 氧 化 酶 系 統 使 用 時, 可 以 增 加 抗 菌 的 效 能 (Garcia-Graells C. et al., 2003) 乳 酸 菌 產 生 過 氧 化 氫 的 含 量 視 菌 種 以 及 食 品 中 氧 的 含 量 而 定, 會 產 生 較 多 的 過 氧 化 氫 的 乳 酸 菌 種 為 同 型 發 酵 的 lactobacilli, 所 以 過 氧 化 氫 的 抗 菌 功 效 可 能 需 視 來 源 食 品 的 種 類 過 氧 化 氫 產 生 的 量 其 他 輔 助 因 子 或 是 目 標 菌 不 同 而 定,

38 在 各 種 不 同 的 條 件 下 所 產 生 的 抗 菌 結 果 會 有 差 異 (3) 二 氧 化 碳 (CO 2 ) 的 作 用 : 二 氧 化 碳 的 產 生 可 能 是 源 自 乳 酸 菌 本 身 之 代 謝 活 動 所 致, 乳 酸 菌 產 生 二 氧 化 碳, 造 成 厭 氧 環 境 而 抑 制 好 氧 菌 的 生 長, 或 是 蓄 積 在 一 些 病 原 菌 或 污 染 菌 細 胞 膜 的 表 層, 導 致 細 胞 膜 上 通 透 性 改 變, 造 成 細 胞 代 謝 阻 礙 這 些 機 能 性 的 障 礙, 會 妨 礙 細 胞 的 正 常 功 能, 而 造 成 抑 制 細 菌 生 長 的 效 果 (Riley M.A. et al., 2002) (4) 細 菌 素 (bacteriocin): 乳 酸 菌 所 生 產 的 細 菌 素 是 由 核 醣 體 合 成 的 胞 外 蛋 白 質 或 多 肽 類 (Bennik M.H.J. et al., 1997) 細 菌 素 對 血 緣 相 近 之 微 生 物 具 有 殺 菌 的 功 效 其 定 義 為 (Tagg J.R. et al. 1976): i. 有 生 物 活 性 的 蛋 白 質 ii. 有 抑 制 細 菌 增 殖 的 靜 菌 作 用 (bacteriostatic action) 與 殺 菌 作 用 (bactericidal action) iii. 對 細 胞 具 有 特 定 的 作 用 部 位 iv. 受 質 體 (plasmid) 所 調 控 v. 只 對 與 自 身 血 緣 接 近 的 微 生 物 具 有 作 用 細 菌 素 的 特 性 為 由 細 菌 代 謝 所 產 生 的 具 有 生 物 活 性 之 蛋 白 質 或 是

39 多 肽 類, 產 生 細 菌 素 的 基 因 以 及 宿 主 細 胞 對 細 菌 素 的 免 疫 基 因 大 部 分 都 位 在 質 體 上 (Tagg J.R. et al. 1976) 細 菌 素 之 生 產 過 程 為 細 菌 素 相 關 基 因 經 由 轉 錄 作 用 (transcription) 產 生 mrna 片 段, 再 經 轉 譯 作 用 (translation) 產 生 pre- 或 pro-bacteriocin ( 細 菌 素 前 驅 物 ), 然 後 再 將 細 菌 素 前 驅 物 移 物 (translocation) 到 細 胞 膜 上, 並 將 細 菌 素 前 驅 物 的 leader peptide 去 除, 修 飾 細 菌 素 前 驅 物 形 成 雙 硫 鍵 ( 此 步 驟 只 限 於 革 蘭 氏 陽 性 菌 ), 再 經 修 飾 成 具 有 生 理 活 性 的 細 菌 素, 留 在 細 胞 膜 上 或 是 分 泌 到 細 胞 膜 外 (Abee T. et al., 1995 Jack R.W. et al.,1995 Kupke T. et al., 1996) 乳 酸 菌 所 產 之 細 菌 素 包 括 acidolin, acidophilin, lactacin, plantacin, nisin 及 bulgarcus 等 依 細 菌 素 之 生 化 及 基 因 特 性 將 其 分 為 四 類 (Klaenhammer T. R., 1993): i. lantibiotics: 為 小 分 子 胜 肽, 具 熱 安 定 性 由 19~37 個 胺 基 酸 組 成, 結 構 中 常 有 不 常 見 之 胺 基 酸, 抑 菌 範 圍 較 廣 主 要 作 用 於 細 胞 之 細 胞 膜, 破 壞 質 子 驅 動 力 (proton motive force), 抑 制 胺 基 酸 的 運 輸, 例 如 Lactococcus lactis (nisin)(hurst A., 1981) ii. non-lantibiotic-small heat-stable peptide 具 熱 安 定 性, 其 結 構 中 不 含 胺 基 酸 此 類 細 菌 素 並 不 多 見, 抑 菌 範 圍 狹 窄, 只 作 用 於 血 緣 相 近 之 菌 種, 主 要 是 吸 附 於 作 用 細

40 胞 膜 上, 但 不 用 像 nisin 作 用 時 需 要 特 殊 受 器 作 為 介 質 iii. large heat-labile proteins 分 子 量 大 於 30,000 Da, 不 具 熱 安 定 性 例 如 caseicin 80 (Lactobacillus casei B80)(Rammelsberg M. et al., 1990) iv. complex proteins 其 分 子 結 構 必 須 含 有 醣 類 或 脂 質 才 具 有 抑 菌 活 性 Lantibiotics 與 small heat-stable nonlantibiotics 這 兩 類 細 菌 素 的 單 體 (monomers) 吸 附 於 目 標 細 胞 表 面 並 嵌 入 細 胞 膜 後, 單 體 產 生 聚 集 並 造 成 細 胞 膜 的 孔 洞, 引 起 ATP 胺 基 酸 及 金 屬 離 子 等 胞 內 物 質 的 流 失 或 生 化 反 應 的 阻 礙, 導 致 細 胞 死 亡 (Daeschel M.A., 1989) 以 乳 酸 鏈 球 菌 素 而 言, 它 的 作 用 點 在 於 敏 感 菌 株 細 胞 膜 上 的 磷 脂 質 (phospholipid), 並 引 起 胺 基 酸 及 陰 離 子 的 快 速 流 失, 而 細 胞 膜 的 破 裂 則 是 由 於 該 物 質 使 氫 硫 基 (sulfhydryl group) 失 活 所 致 ( 廖, 1998) Lactococcus lactis subsp. cremoris 產 生 的 細 菌 素 -dioplococcin, 能 阻 止 DNA 和 RNA 之 生 合 成, 並 減 少 蛋 白 質 之 合 成 (Davey G.P., 1981) (5) 天 然 滅 菌 劑 (Reuterin): Reuterin 是 由 人 或 動 物 的 腸 胃 道 所 分 離 出 的 乳 酸 菌 Lactobacillus reuteri 在 厭 氧 的 狀 態 下 發 酵 glycerol 後 所 產 生 的 滅 菌 物 質 ( 如 圖 2-4),

41 reuterin 是 一 低 分 子 量, 具 良 好 熱 穩 定 性 之 物 質, 具 廣 泛 的 抗 菌 作 用, 能 抑 制 革 蘭 氏 陽 陰 性 菌 酵 母 菌 黴 菌 及 原 蟲 等, 其 抑 菌 作 用 機 制 可 能 與 RNA 氧 化 還 原 酶 (ribonucleotide reductase) 或 硫 氫 基 酵 素 (sulfhydryl enzyme) 受 到 reuterin 之 抑 制 而 引 起 DNA 合 成 作 用 受 到 阻 礙 有 關 (T. L. Talarico et al., 1989) 主 要 特 性 為 具 有 高 溶 解 度 以 及 ph 值 為 中 性 等 (6) 雙 乙 醯 (diacetyl): 乳 酸 菌 所 產 生 的 雙 乙 醯 為 食 品 風 味 組 成 的 要 素 之 一, 是 乳 製 品 風 味 的 主 要 來 源, 為 丙 酮 酸 經 乳 酸 菌 分 解 而 得, 對 於 酵 母 菌 及 革 蘭 氏 陰 性 菌 具 有 抑 制 效 果, 而 且 效 果 隨 ph 值 降 低 而 增 加 其 抑 菌 機 制 可 能 藉 由 阻 礙 革 蘭 氏 陰 性 菌 對 精 胺 酸 (arginine) 的 利 用 (Daeschel M.A., 1989), 除 了 革 蘭 氏 陰 性 菌 之 外, 雙 乙 醯 對 於 酵 母 菌 也 會 有 抗 菌 的 作 用 (Hoefnagel M.H.N. et al., 2002 Sarantinopoulos P. et al., 2002 Vandenbergh P.A. et al., 1993) 但 是 雙 乙 醯 具 有 強 烈 的 揮 發 性 氣 味, 因 而 不 適 用 於 食 物 之 保 存

42 第 三 章 材 料 與 方 法 3.1. 材 料 MRS (Man Rogos Sharpe) : 啟 新 生 技 公 司 所 購 得 YM (Yeast Extract & Malt Extract) : 啟 新 生 技 公 司 所 購 得 LB (Luria-Bertain) : 啟 新 生 技 公 司 所 購 得 Phenol ( 酚 紅 ) : 啟 新 生 技 公 司 所 購 得 TMB : 3,3, 5,5, -teramethyl benzidine, Sigma 所 購 得 HRPO (horseradish peroxidase) : 2 U/50 ml, Sigma 所 購 得 H 2 O 2 ( 過 氧 化 氫 ) : M = g/mol, Sigma 所 購 得 Sheep ( 綿 羊 血 ) : blood:creative media products 所 購 得 BHI (Brain Heart Infusion) : Oxoid 所 購 得 Lactic acid ( 乳 酸 ) : 85%, 友 和 貿 易 公 司 所 購 得 Gardnerella vaginalis ( 陰 道 伽 氏 菌 ): 本 實 驗 室 所 篩 出 Escherichia coli ( 大 腸 桿 菌 ): 本 實 驗 室 所 篩 出 Candida albicans ( 白 色 念 珠 菌 ): 本 實 驗 室 所 篩 出

43 3.2. 實 驗 方 法 實 驗 流 程 如 圖 3-1 所 示, 首 先 先 進 行 篩 菌 試 驗, 鑑 定 菌 種 後 檢 測 乳 酸 菌 特 性 的 能 力 分 析, 如 : 生 物 膜 強 度 產 H 2 O 2 的 有 無 及 含 量 多 寡 和 產 乳 酸 之 強 弱, 再 檢 測 陰 道 乳 酸 菌 與 致 病 菌 對 H 2 O 2 與 乳 酸 之 最 小 抑 菌 濃 度 (MIC), 最 後 進 行 抑 菌 試 驗 及 測 量 其 抑 菌 圈 大 小, 而 得 知 最 佳 抑 菌 菌 株 及 菌 種 篩 菌 試 驗 取 待 檢 測 檢 體 加 入 1000 μl MRS broth, 混 合 均 勻, 從 中 取 出 750 μl 加 入 250 μl 50% 甘 油, 保 存, 剩 下 的 250 μl 中, 取 100 μl 準 備 操 作 連 續 稀 釋, 剩 下 的 150 μl 自 行 保 存 連 續 稀 釋 & 塗 盤 取 9 個 eppendorf 各 加 入 900μl MRS broth, 在 操 作 連 續 稀 釋, 並 混 合 均 勻 取 100 μl 已 經 稀 釋 好 的 菌 液 加 入 MRS plate 中, 並 使 用 過 完 火 已 冷 卻 的 塗 抹 棒 均 勻 塗 抹 完 成 後 厭 氧 培 養 於 37 C,24~48 小 時 挑 菌 依 生 長 情 況 選 擇 自 己 所 需 要 的 菌 ( 例 如 : 產 酸 度 菌 相 大 小 ), 取 1000 μl MRS broth 到 eppendorf 利 用 過 完 火 冷 卻 的 loop 取 所 需

44 要 的 菌 至 eppendorf 中 培 養 於 37 C,24 小 時 次 培 養 ( 目 的 為 確 認 所 挑 的 菌 落 為 單 一 的 菌 落 無 污 染 情 況 ) 從 eppendorf 中 取 750 μl 菌 液 到 另 一 個 乾 淨 eppendorf, 並 離 心 rpm,5 min, 去 掉 上 清 液, 加 入 750 μl MRS broth 再 加 入 250 μl 50% 甘 油, 保 存 剩 下 的 250 μl 菌 液, 利 用 過 完 火 冷 卻 的 loop 四 區 劃 線 於 MRS plate 完 成 後 厭 氧 培 養 於 37 C,24~48 小 時 確 認 單 一 菌 落 確 認 為 單 一 菌 落 無 污 染 後, 將 plate 拍 照 存 檔 取 1000 μl MRS broth 到 eppendorf 利 用 過 完 火 冷 卻 的 loop 將 單 一 菌 落 取 至 eppendorf 中 培 養 於 37 C,24 小 時 次 日, 從 eppendorf 中 取 500 μl 菌 液 到 另 一 個 乾 淨 eppendorf, 並 離 心 rpm,5 min 去 掉 上 清 液, 加 入 750 μl MRS broth 再 加 入 250 μl 50% 甘 油, 保 存 剩 下 的 500 μl 菌 液 準 備 操 作 RAPD(Randomly amplified polymorphic DNA) 確 認 生 物 膜 活 化 取 100μl 陰 道 乳 酸 菌 菌 液 至 1000 μl MRS broth 的 eppendorf 中 培 養 於 37 C,24 小 時

45 生 物 膜 取 活 化 後 之 100 μl 陰 道 乳 酸 菌 菌 液 至 3 ml MRS broth 的 玻 璃 管 中 培 養 於 37 C,48 小 時 上 清 液 倒 掉, 加 入 1% 的 酚 紅 指 示 劑, 旋 轉 2 分 鐘, 再 將 上 清 液 倒 掉, 室 溫 烘 乾,24 小 時, 即 可 觀 察 附 著 在 乳 酸 菌 生 物 膜 的 酚 紅 指 示 劑 酸 度 取 活 化 後 之 100 μl 陰 道 乳 酸 菌 菌 液 至 10 ml MRS broth 的 玻 璃 管 中 培 養 於 37 C,48 小 時 先 測 其 ph 值 而 後 再 滴 1 N 的 NaoH 使 其 菌 液 ph 值 達 中 性 而 看 其 滴 入 量 帶 入 公 式 酸 度 公 式 x %,x 為 滴 入 1N NaoH 量 10ml 產 H 2 O 2 試 驗 本 實 驗 利 用 TMB 和 酵 素 (HRPO) 會 與 乳 酸 菌 所 產 生 的 H 2 O 2 生 成 藍 色 反 應, 以 利 觀 察 乳 酸 菌 所 產 生 的 H 2 O 2 的 多 寡 準 備 好 所 需 要 的 培 養 基, 並 養 好 所 需 要 的 乳 酸 菌 次 日, 四 區 劃 線 於 製 備 好 的 培 養 基 上 厭 氧 培 養 於 37 C,48 小 時 看 結 果 前, 於 操 作 台 內 烘 乾 培 養 基 觀 察 培 養 基 變 藍 色 情 形 ( 越 藍 表 示 產 H 2 O 2 能 力 越 強 )

46 培 養 基 製 備 : MRS 100 ml 加 上 TMB g 在 加 上 酵 素 (HRPO) 1 μl 抑 菌 試 驗 先 養 好 所 需 要 的 致 病 菌 和 乳 酸 菌, 準 備 好 所 需 要 的 培 養 基 (Gardnerella vaginalis : BHI+5% Sheep Escherichia coli : LB Candida albicans : YM) 要 操 作 的 致 病 菌 利 用 分 光 光 度 計 調 到 % T 600 = 20, 每 片 plate 加 入 100 μl 致 病 菌, 利 用 過 完 火 的 塗 抹 棒 塗 抹 均 勻 利 用 1000 μl 大 小 的 Tip 尾 端 挖 洞 再 填 入 100 μl MRS 培 養 基, 等 待 冷 卻 在 所 挖 的 洞 分 別 加 入 陰 道 乳 酸 菌 培 養 於 37 C,24~48 小 時, 觀 察 結 果, 測 量 抑 菌 圈 直 徑 最 小 抑 菌 濃 度 (MIC) 先 養 好 所 需 要 的 致 病 菌 和 乳 酸 菌, 準 備 好 所 需 要 的 培 養 基 (Gardnerella vaginalis : BHI+5% Sheep Escherichia coli : LB Candida albicans : YM) 要 操 作 的 致 病 菌 和 乳 酸 菌 利 用 分 光 光 度 計 調 到 % T 600 = 20 每 片 plate 加 入 100 μl 致 病 菌 和 乳 酸 菌, 利 用 過 完 火 的 塗 抹 棒 塗 抹 均 勻 利 用 1000 μl 大 小 的 Tip 尾 端 挖 洞 在 所 挖 的 洞 分 別 加 入 稀

47 釋 後 的 乳 酸 和 H 2 O 2 培 養 於 37 C,24~48 小 時, 觀 察 抑 菌 圈 結 果, 得 知 最 大 稀 釋 倍 數, 再 去 換 算 最 小 抑 菌 濃 度 實 驗 結 果 此 實 驗 篩 選 出 9 種 乳 酸 菌 菌 種 共 有 82 株 菌 Lactobacillus fermentum : 6 株 Lactobacillus plantarum : 28 株 Lactobacillus rhamnosus : 11 株 Lactobacillus reuteri : 8 株 Lactobacillus casei : 14 株 Lactobacillus acidophilus : 2 株 Lactobacillus gasseri : 9 株 Lactobacillus vaginalis : 3 株 Lactobacillus johnsonii : 1 株 表 一 為 篩 選 出 的 陰 道 乳 酸 菌 種 菌 種 及 株 數 結 果 顯 示 乳 酸 菌 產 生 乳 酸 的 ph 值 在 3.6~4.55 之 間 (24 小 時 ) 3.5~4.5(48 小 時 ), 酸 度 在 0.198~0.045 %( 表 二 ), 各 菌 種 帄 均 酸 度 : Lactobacillus fermentum : 0.114% Lactobacillus plantarum : 0.157% Lactobacillus rhamnosus : 0.146% Lactobacillus reuteri : 0.109% Lactobacillus casei : 0.145% Lactobacillus acidophilus : 0.126% Lactobacillus gasseri : 0.139% Lactobacillus vaginalis : 0.108% Lactobacillus johnsonii : 0.045% 從 表 得 知 相 同 的 ph 值 並 不 代 表 有 相 同 的 酸 度

48 圖 3-2 為 利 用 酚 紅 指 示 劑 的 深 淺 得 知 陰 道 乳 酸 菌 在 玻 璃 管 壁 所 形 成 的 生 物 膜 強 弱 如 : 則 最 佳 的 菌 株 有 Luc11 Luc20 Luc38 Luc39 Luc51 Luc54 Luc76 Luc79 Luc81, 最 弱 的 有 Luc2 Luc7 Luc16 Luc18 Luc49 Luc53 Luc57 Luc59 Luc61 Luc62 Luc63 Luc65 Luc67 Luc68 Luc83 Luc88 Luc90 Luc92 Luc93 Luc97 Luc98 Luc99 Luc102 Luc104 Luc107 Luc108 Luc110 Luc112 Luc113 Luc119 Luc125 Luc127 Luc128 圖 3-3 是 陰 道 乳 酸 菌 與 TMB 的 化 學 反 應 產 生 藍 色 效 果 可 知 乳 酸 菌 產 生 H 2 O 2 的 多 寡, 如 : 則 最 佳 的 菌 株 有 Luc30 Luc36 Luc37 Luc101 Luc117, 無 產 生 的 有 Luc2 Luc33 Luc50 Luc61 Luc63 Luc73 Luc80 Luc83 Luc86 Luc87 Luc88 Luc92 Luc97 Luc98 Luc102 Luc104 Luc112 Luc113 Luc119 圖 3-4 為 陰 道 乳 酸 菌 在 培 養 基 上 生 成 乳 酸 之 強 弱, 如 : 則 最 佳 的 菌 株 有 Luc11 Luc15 Luc16 Luc17 Luc30 Luc33 Luc36 Luc37 Luc54 Luc63 Luc67 Luc68 Luc82 Luc85 Luc92 Luc93 Luc95 Luc103 Luc109 Luc111 Luc114 Luc123 Luc125 Luc128, 不 明 顯 的 有 Luc49 Luc50 Luc53 Luc57 Luc61 Luc83 Luc88 Luc90 Luc102 Luc113 Luc

49 圖 3-7 為 陰 道 乳 酸 菌 與 Candida albicans 的 抗 菌 試 驗, 發 現 只 有 Luc71 有 抗 菌 的 效 果,Luc71 為 Lactobacillus reuteri ( 表 三 ) 圖 3-8 為 陰 道 乳 酸 菌 與 Gardnerella vaginalis 的 抗 菌 試 驗, 發 現 有 抗 菌 能 力 的 有 Luc11 Luc15 Luc16 Luc22 Luc36 Luc38 Luc39 Luc54 Luc59 Luc62 Luc63 Luc65 Luc66 Luc68 Luc69 Luc71 Luc72 Luc73 Luc74 Luc75 Luc77 Luc79 Luc80 Luc82 Luc83 Luc85 Luc93 Luc95 Luc96 Luc98 Luc101 Luc103 Luc104 Luc105 Luc107 Luc109 Luc111 Luc114 Luc115 Luc117 Luc120 Luc123 Luc125 Luc127 Luc128 Luc518( 表 三 ) 圖 3-9 為 陰 道 乳 酸 菌 與 Escherichia coli 的 抗 菌 試 驗, 發 現 有 抗 菌 能 力 的 有 Luc15 Luc16 Luc17 Luc20 Luc22 Luc30 Luc33 Luc36 Luc37 Luc38 Luc39 Luc51 Luc54 Luc59 Luc61 Luc62 Luc63 Luc65 Luc67 Luc68 Luc69 Luc70 Luc72 Luc73 Luc74 Luc75 Luc76 Luc79 Luc82 Luc83 Luc85 Luc88 Luc89 Luc90 Luc91 Luc93 Luc95 Luc96 Luc97 Luc98 Luc103 Luc104 Luc105 Luc107 Luc108 Luc109 Luc110 Luc111 Luc114 Luc115 Luc120 Luc122 Luc123 Luc125 Luc127 而 Luc74 Luc75 Luc105 為 Lactobacillus rhamnosus, 其 抑 菌 能 力 效 果 更 是 明 顯 ( 表 三 )

50 圖 3-10 為 H 2 O 2 和 乳 酸 對 Candida albicans 的 MIC 試 驗,H 2 O 2 對 Candida albicans 的 最 小 抑 菌 濃 度 為 0.116mM, 乳 酸 對 Candida albicans 的 最 小 抑 菌 濃 度 為 85% 圖 3-11 為 H 2 O 2 和 乳 酸 對 Gardnerella vaginalis 的 MIC 試 驗,H 2 O 2 對 Gardnerella vaginalis 的 最 小 抑 菌 濃 度 為 0.029mM, 乳 酸 對 Gardnerella vaginalis 的 最 小 抑 菌 濃 度 為 4.25% 圖 3-12 為 H 2 O 2 和 乳 酸 對 Escherichia coli 的 MIC 試 驗,H 2 O 2 對 Escherichia coli 的 最 小 抑 菌 濃 度 為 mM, 乳 酸 對 Escherichia coli 的 最 小 抑 菌 濃 度 為 2.125% (H 2 O 2 原 液 濃 度 為 11.6 mm, 乳 酸 原 液 濃 度 為 85%) 最 後 在 所 有 抗 菌 試 驗 中 發 現 Lactobacillus reuteri 此 菌 種 針 對 Candida albicans 和 Gardnerella vaginalis 都 有 抑 制 能 力 效 果 ; Lactobacillus rhamnosus 對 Escherichia coli 的 抑 制 能 力 最 好

51 第 四 章 討 論 與 結 論 乳 酸 菌 為 陰 道 菌 蟲 中 的 主 要 菌 種, 此 研 究 中 偵 測 生 物 膜 就 是 試 驗 乳 酸 菌 吸 附 在 陰 道 上 皮 細 胞 的 能 力, 吸 附 性 愈 強 則 減 少 致 病 菌 寄 生 在 陰 道 上 皮 細 胞 的 機 會 就 愈 大, 因 而 使 致 病 菌 更 無 法 大 量 繁 殖 乳 酸 菌 發 酵 後 會 產 生 乳 酸 醋 酸 等 有 機 酸, 這 些 弱 酸 的 蓄 積 會 導 致 ph 值 下 降 到 微 生 物 無 法 生 長 的 範 圍, 於 是 檢 測 乳 酸 強 度 與 酸 度 更 是 可 得 知 哪 種 菌 種 和 哪 株 菌 是 最 可 以 降 低 陰 道 ph 值 的, 但 相 同 的 ph 值 並 不 代 表 有 相 同 的 酸 度 維 持 一 個 健 康 的 陰 道, 乳 酸 菌 產 生 H 2 O 2 和 細 菌 素 來 抑 制 致 病 菌 的 生 長 是 非 常 重 要 的 功 能, 但 事 實 上 只 有 一 些 乳 酸 菌 種 能 產 生 足 量 的 H 2 O 2 和 不 同 的 乳 酸 菌 種 就 有 不 同 的 細 菌 素 能 去 抑 制 陰 道 厭 氧 的 菌 蟲 和 鏈 球 菌 以 及 部 分 的 Escherichia coli 和 yeast 根 據 之 前 的 研 究 指 出 生 產 的 H 2 O 2 主 要 是 負 責 抑 制 Gardnerella vaginalis 和 Candida albicans, 文 中 更 指 出 雖 然 無 法 有 效 的 完 全 抑 制 但 只 要 低 於 致 病 數 就 等 於 有 抑 菌 的 效 果 在 本 論 文 中, 我 們 利 用 乳 酸 菌 活 菌 針 對 各 病 菌 的 抑 制 能 力 進 行 實 驗, 實 驗 結 果 發 現 Luc71 菌 株 (Lactobacillus reuteri) 對 Candida albicans 和 Gardnerella vaginalis 都 有 抑 制 的 效 果 ;Lactobacillus rhamnosus 對 Escherichia coli 的 抑 制 能 力 最 好 據 之 前 報 告 中 指 出 Lactobacillus reuteri 會 產 生 reuterin 此 類 抑 菌 素, 文 獻 中 更 指 出 reuterin 具 廣 泛 的 抗 菌 作 用,

52 能 抑 制 革 蘭 氏 陰 性 菌 革 蘭 氏 陽 性 菌 酵 母 菌 黴 菌 及 原 蟲 等 於 是 本 實 驗 也 針 對 Lactobacillus reuteri 進 行 reuterin 萃 取, 再 實 驗 比 較 對 各 病 菌 的 抑 制 能 力 實 驗 結 果 顯 示, 萃 取 出 的 reuterin 都 沒 有 抑 菌 的 效 果, 其 原 因 可 能 是 沒 有 萃 取 到 reuterin 或 是 活 菌 具 有 多 方 面 的 抑 制 條 件 而 reuterin 就 只 有 單 一 條 件 因 此 未 來 應 用 乳 酸 菌 於 陰 道 炎 的 治 療, 其 乳 酸 菌 的 抑 菌 機 制 是 有 待 更 深 入 之 研 究 乳 酸 菌 控 制 陰 道 致 病 菌 是 扮 演 著 一 個 重 要 的 角 色 但 也 是 一 個 非 常 複 雜 的 機 制, 而 本 實 驗 的 乳 酸 H 2 O 2 reuterin 和 生 物 膜 只 是 其 中 的 一 部 分, 此 時 就 要 看 抑 制 的 目 標 致 病 菌 為 何, 於 是 可 能 還 有 其 他 的 抑 菌 機 制 存 在, 如 : 如 同 腸 胃 道 的, 乳 酸 菌 可 能 可 以 選 擇 性 的 抑 制 上 皮 細 胞 分 泌 的 免 疫 發 炎 啟 動 分 子 以 及 其 餘 多 種 的 細 菌 素 在 2010 年 的 美 國 婦 產 科 期 刊 更 證 實 增 加 陰 道 乳 酸 菌 可 以 降 低 陰 道 炎 的 復 發 機 率 乳 酸 菌 維 持 陰 道 正 常 菌 群 是 非 常 重 要 的, 所 以 做 為 感 染 的 屏 障 是 逐 漸 被 認 可 的, 乳 酸 菌 產 生 乳 酸 和 H 2 O 2 的 作 用 在 維 持 一 個 健 康 的 陰 道 也 一 直 都 是 有 案 可 稽 的 總 言 之 女 性 生 殖 系 統 就 是 藉 由 乳 酸 菌 的 抑 菌 功 能 以 及 維 持 菌 種 帄 衡, 來 預 防 病 原 體 的 入 侵 與 生 長 本 論 文 的 結 論 為 經 過 種 種 測 試 之 後, 就 可 挑 選 出 最 有 抑 制 效 果 的 陰 道 乳 酸 菌

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65 表 一 篩 選 出 的 陰 道 乳 酸 菌 種 菌 種 及 株 數 代 號 菌 種 生 物 膜 H 2 O 2 強 度 乳 酸 強 度 Luc2 L.fermentum Luc7 L.plantarum Luc11 L.plantarum Luc15 L.rhamnosus Luc16 L.plantarum Luc17 L.reuteri Luc18 L.plantarum Luc20 L.casei Luc22 L.plantarum Luc30 L.plantarum Luc33 L.plantarum Luc36 L.plantarum Luc37 L.plantarum Luc38 L.plantarum Luc39 L.plantarum Luc49 L.acidophilus + + +/- Luc50 L.gasseri /

66 Luc51 L.plantarum Luc52 L.vaginalis Luc53 L.vaginalis + + +/- Luc54 L.casei Luc57 L.vaginalis + + +/- Luc59 L.gasseri Luc61 L.gasseri + - +/- Luc62 L.gasseri Luc63 L.gasseri Luc65 L.plantarum Luc66 L.plantarum Luc67 L.plantarum Luc68 L.plantarum Luc69 L.plantarum Luc70 L.reuteri Luc71 L.reuteri Luc72 L.plantarum Luc73 L.casei Luc74 L.rhamnosus

67 Luc75 L.rhamnosus Luc76 L.reuteri Luc77 L.plantarum Luc79 L.plantarum Luc80 L.plantarum Luc81 L.johnsonii Luc82 L.plantarum Luc83 L.casei + - +/- Luc85 L.casei Luc86 L.reuteri Luc87 L.plantarum Luc88 L.acidophilus + - +/- Luc89 L.gasseri Luc90 L.gasseri + + +/- Luc91 L.gasseri Luc92 L.reuteri Luc93 L.plantarum Luc95 L.casei Luc96 L.rhamnosus

68 Luc97 L.casei Luc98 L.plantarum Luc99 L.gasseri Luc101 L.fermentum Luc102 L.fermentum + - +/- Luc103 L.rhamnosus Luc104 L.casei Luc105 L.rhamnosus Luc107 L.casei Luc108 L.casei Luc109 L.rhamnosus Luc110 L.fermentum Luc111 L.rhamnosus Luc112 L.plantarum Luc113 L.fermentum + - +/- Luc114 L.casei Luc115 L.rhamnosus Luc117 L.casei Luc119 L.fermentum + - +/

69 Luc120 L.rhamnosus Luc122 L.casei Luc123 L.casei Luc125 L.plantarum Luc127 L.rhamnosus Luc128 L.plantarum Lyc518 L.reuteri Lyc519 L.reuteri

70 表 二 酸 度 代 號 菌 種 ph 值 酸 度 Luc2 L.fermentum % Luc7 L.plantarum % Luc11 L.plantarum % Luc15 L.rhamnosus % Luc16 L.plantarum % Luc17 L.reuteri % Luc18 L.plantarum % Luc20 L.casei % Luc22 L.plantarum % Luc30 L.plantarum % Luc33 L.plantarum % Luc36 L.plantarum % Luc37 L.plantarum %

71 Luc38 L.plantarum % Luc39 L.plantarum % Luc49 L.acidophilus % Luc50 L.gasseri % Luc51 L.plantarum % Luc52 L.vaginalis % Luc53 L.vaginalis % Luc54 L.casei % Luc57 L.vaginalis % Luc59 L.gasseri % Luc61 L.gasseri % Luc62 L.gasseri % Luc63 L.gasseri % Luc65 L.plantarum % Luc66 L.plantarum %

72 Luc67 L.plantarum % Luc68 L.plantarum % Luc69 L.plantarum % Luc70 L.reuteri % Luc71 L.reuteri % Luc72 L.plantarum % Luc73 L.casei % Luc74 L.rhamnosus % Luc75 L.rhamnosus % Luc76 L.reuteri % Luc77 L.plantarum % Luc79 L.plantarum % Luc80 L.plantarum % Luc81 L.johnsonii % Luc82 L.plantarum %

73 Luc83 L.casei % Luc85 L.casei % Luc86 L.reuteri % Luc87 L.plantarum % Luc88 L.acidophilus % Luc89 L.gasseri % Luc90 L.gasseri % Luc91 L.gasseri % Luc92 L.reuteri % Luc93 L.plantarum % Luc95 L.casei % Luc96 L.rhamnosus % Luc97 L.casei % Luc98 L.plantarum % Luc99 L.gasseri %

74 Luc101 L.fermentum % Luc102 L.fermentum % Luc103 L.rhamnosus % Luc104 L.casei % Luc105 L.rhamnosus % Luc107 L.casei % Luc108 L.casei % Luc109 L.rhamnosus % Luc110 L.fermentum % Luc111 L.rhamnosus % Luc112 L.plantarum % Luc113 L.fermentum % Luc114 L.casei % Luc115 L.rhamnosus % Luc117 L.casei %

75 Luc119 L.fermentum % Luc120 L.rhamnosus % Luc122 L.casei % Luc123 L.casei % Luc125 L.plantarum % Luc127 L.rhamnosus % Luc128 L.plantarum % Lyc518 L.reuteri % Lyc519 L.reuteri %

76 表 三 抑 菌 圈 大 小 代 號 菌 種 Candida albicans Gardnerella vaginalis Escherichia coli Luc2 L.fermentum Luc7 L.plantarum Luc11 L.plantarum 不 明 顯 Luc15 L.rhamnosus Luc16 L.plantarum Luc17 L.reuteri 不 明 顯 Luc18 L.plantarum - - 不 明 顯 Luc20 L.casei Luc22 L.plantarum Luc30 L.plantarum - 不 明 顯 1.2 Luc33 L.plantarum Luc36 L.plantarum Luc37 L.plantarum - 不 明 顯 1.1 Luc38 L.plantarum Luc39 L.plantarum

77 Luc49 L.acidophilus Luc50 L.gasseri Luc51 L.plantarum Luc52 L.vaginalis - - 不 明 顯 Luc53 L.vaginalis Luc54 L.casei Luc57 L.vaginalis Luc59 L.gasseri Luc61 L.gasseri Luc62 L.gasseri Luc63 L.gasseri Luc65 L.plantarum Luc66 L.plantarum 不 明 顯 Luc67 L.plantarum - 不 明 顯 1.0 Luc68 L.plantarum Luc69 L.plantarum Luc70 L.reuteri Luc71 L.reuteri

78 Luc72 L.plantarum Luc73 L.casei Luc74 L.rhamnosus Luc75 L.rhamnosus 外 2.0 內 1.3 外 2.0 內 1.3 Luc76 L.reuteri Luc77 L.plantarum 不 明 顯 Luc79 L.plantarum Luc80 L.plantarum 不 明 顯 Luc81 L.johnsonii Luc82 L.plantarum Luc83 L.casei Luc85 L.casei Luc86 L.reuteri - - Luc87 L.plantarum - - 不 明 顯 不 明 顯 Luc88 L.acidophilus Luc89 L.gasseri Luc90 L.gasseri Luc91 L.gasseri

79 Luc92 L.reuteri Luc93 L.plantarum Luc95 L.casei Luc96 L.rhamnosus Luc97 L.casei Luc98 L.plantarum Luc99 L.gasseri Luc101 L.fermentum Luc102 L.fermentum Luc103 L.rhamnosus Luc104 L.casei Luc105 L.rhamnosus 外 1.6 內 1.1 Luc107 L.casei Luc108 L.casei - 不 明 顯 1.2 Luc109 L.rhamnosus Luc110 L.fermentum Luc111 L.rhamnosus Luc112 L.plantarum Luc113 L.fermentum

80 Luc114 L.casei Luc115 L.rhamnosus Luc117 L.casei Luc119 L.fermentum - - 不 明 顯 不 明 顯 Luc120 L.rhamnosus Luc122 L.casei - 不 明 顯 1.1 Luc123 L.casei Luc125 L.plantarum Luc127 L.rhamnosus Luc128 L.plantarum 不 明 顯 Lyc518 L.reuteri 不 明 顯 Lyc519 L.reuteri - 不 明 顯 不 明 顯

81 表 四 各 種 陰 道 炎 分 泌 物 所 呈 現 特 徵 比 較 表 特 徵 生 理 性 分 泌 物 念 珠 菌 感 染 滴 蟲 感 染 細 菌 感 染 萎 縮 性 陰 道 炎 顏 色 透 明 到 白 色 白 色 黃 到 黃 綠 色 白 到 灰 色 - 氣 味 無 臭 無 臭 惡 臭 魚 腥 味 - 型 態 棉 絮 狀 Floccular 棉 絮 狀 Floccular 稀 薄 成 水 狀 Homogeneous 稀 薄 成 水 狀 Homogeneous - 黏 稠 度 高 高 低 低 低 PH 值 >4.5 >6.0 其 他 - 厚 乾 酪 狀 curdlike 泡 沫 狀 薄 分 泌 物 稀 少

82 乳 酸 菌 Lactic Acid H 2 O 2 Bacteriocins 生 物 膜 ph HOCl H + 病 原 體 死 亡 圖 1-1 乳 酸 菌 抑 制 致 病 菌 生 長 過 程

83 圖 2-1 女 性 生 殖 系 統

84 (Baired-Paker, 1980) 圖 2-2 有 機 酸 之 抑 菌 機 制

85 3 Acetyl phosphate + Pyruvate + O 2 + PO 4 Pyruvate oxidase CO 2 + H 2 O 2 Lactate + O 2 Pyruvate + H 2 O 2 L-lactate oxidase Lactate + O 2 NAD-independent D-lactate Pyruvate + H 2 O 2 dehydrogenase NADH + H + + O 2 NAD + H 2 O 2 NADH oxidase 圖 2-3 乳 酸 菌 產 生 過 氧 化 氫 之 反 應 機 制

86 (a) Reuterin 的 分 子 結 構 式 (b) L. reuterin 在 厭 氧 的 狀 態 下 代 謝 glycerol 產 生 reuterin 圖 2-4 分 子 結 構 式

87 篩 菌 產 生 生 物 膜 強 度 檢 測 產 生 H 2 O 2 之 有 無 與 強 弱 檢 測 產 生 乳 酸 之 強 弱 測 量 所 產 乳 酸 之 ph 值 與 酸 度 檢 測 陰 道 乳 酸 菌 與 致 病 菌 對 H 2 O 2 與 乳 酸 之 最 小 抑 菌 濃 度 (MIC) 針 對 主 要 之 致 病 菌 進 行 抑 菌 試 驗 測 量 其 抑 菌 圈 大 小 圖 3-1 實 驗 流 程

88 + + + (a) + + (b) + (c) 圖 3-2 觀 察 附 著 在 乳 酸 菌 生 物 膜 的 酚 紅 指 示 劑 得 知 陰 道 乳 酸 菌 產 生 生 物 膜 的 強 度 (a)+++ : 強 (b)++ : 中 強 (c)+ : 弱

89 (a) (c) + (b) (d) 圖 3-3 利 用 TMB 和 酵 素 (HRPO) 會 與 乳 酸 菌 所 產 生 的 H 2 O 2 生 成 藍 色 反 應, 以 利 觀 察 乳 酸 菌 所 產 生 的 H 2 O 2 的 多 寡 (a)+++ : 強 (b)++ : 中 強 (c)+ : 弱 (d)- : 無

90 (a) (b) + +/ (c) (d) 圖 3-4 觀 察 陰 道 乳 酸 菌 產 生 的 透 明 圈 得 知 乳 酸 的 強 弱 之 分 (a)+++ : 強 (b)++ : 中 強 (c)+ : 弱 (d)+/- : 不 明 顯

91 (a) (b) (c) (d) 圖 3-5 本 實 驗 室 篩 出 的 陰 道 乳 酸 菌 針 對 Candida albicans 試 驗 發 現 Luc71 菌 株 有 明 顯 的 抑 菌 能 力

92 (a) (b) (c) (d) 圖 3-6 本 實 驗 室 篩 出 的 陰 道 乳 酸 菌 針 對 Gardnerella vaginal 試 驗 清 楚 辨 別 有 無 抑 菌 的 能 力,Luc71 菌 株 也 有 明 顯 的 抑 制 能 力

93 (a) (b) (c) (d) 圖 3-7 本 實 驗 室 篩 出 的 陰 道 乳 酸 菌 針 對 Escherichia coli 試 驗 發 現 Lactobacillus rhamnosus 菌 種 抑 制 效 果 最 好 (Luc 74 Luc 75 Luc 105)

94 (a) (b) 圖 3-8 MIC ( 最 小 抑 菌 濃 度 ) 試 驗 (a) 為 H 2 O 2 對 Candida albicans 的 最 小 耐 受 性 試 驗 (b) 為 乳 酸 對 Candida albicans 的 最 小 耐 受 性 試 驗

95 (a) (b) 圖 3-9 MIC ( 最 小 抑 菌 濃 度 ) 試 驗 (a) 為 H 2 O 2 對 Gardnerella vaginalis 的 最 小 耐 受 性 試 驗 (b) 為 乳 酸 對 Gardnerella vaginalis 的 最 小 耐 受 性 試 驗

96 (a) (b) 圖 3-10 MIC ( 最 小 抑 菌 濃 度 ) 試 驗 (a) 為 H 2 O 2 對 Escherichia coli 的 最 小 耐 受 性 試 驗 (b) 為 乳 酸 對 Escherichia coli 的 最 小 耐 受 性 試 驗